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己农江
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1 用安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C18 5 µm 3.5 µm 和 1.8 µm 色谱柱改进辛伐他汀的分析应用报告制药作者 William Long 和 Anne Brooks 安捷伦科技公司 285 Centerville Road Wilgton, DE 1989 USA Yun Zou 安捷伦科技公司中国上海外高桥保税区英伦路 412 号, 2131 摘要辛伐他汀属于降胆固醇的他汀类药物, 是世界上使用最广泛的处方药之一本应用报告介绍了对美国药典 (USP) 的辛伐他汀片剂分析方法所做的改进该 USP 方法使用的是 25 mm,5 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱, 分析时间为 1 分钟使用快速分离 Eclipse Plus C mm x 1 mm,3.5 µm 色谱柱或快速分离高通量 Eclipse Plus C mm x 5 mm,1.8 µm 色谱柱, 对该方法稍加改动后, 缩短了分析时间, 并显著节省了时间和溶剂所有色谱柱都是在低于 4 bar 压力下操作的, 因此几乎可以在任何仪器上使用本报告还报导了方法的耐用性线性和色谱柱寿命

2 前言辛伐他汀属于降胆固醇的他汀类药物, 是世界上使用最广泛的处方药之一辛伐他汀的结构如图 1 所示该药一经摄取, 即被水解成干扰肝脏生成胆固醇的物质辛伐他汀既降低总胆固醇水平, 也降低 LDL 胆固醇医学研究表明, 高 LDL 胆固醇与冠状动脉疾病有关在美国使用的其它主要他汀类药物包括 : 阿托伐他汀氟伐他汀洛伐他汀帕伐他汀和罗苏伐他汀 [1] 其中许多都是联合用药 [1] 辛伐他汀通常以 5 到 8 mg 剂量的片剂服用, 制剂中还含有一些非活性辅料, 如纤维素乳糖和淀粉目前其作为普通药物在世界各地生产高效液相色谱 (HPLC) 分析在 Agilent 12 高分离度快速液相色谱 (RRLC) 系统上进行 : G1312B SL 型二元泵, 流动相通道 A: ph 4.5 磷酸缓冲水溶液, 通道 B: 乙腈,(35:65); 流速为 1.5 ml/( 耐用性测定时条件有所改变 ) G1376CSL 型自动液体进样器 (ALS),25 mm 色谱柱的进样量为 1 µl,15mm 色谱柱为 6 µl,1 mm 色谱柱为 4 µl, 5mm 色谱柱为 2 µl G1316B SL 型柱温箱 (TCC), 温度为 45 C G1316C SL 型二极管阵列检测器 (DAD), 使用的波长为 238, 4 nm 36, 5 mm, 配备 G 微量流通池 (5mm 光程, 6 µl 体积 ) ZORBAX 色谱柱 : Eclipse Plus C18, 4.6 mm 25 mm, 5 µm 部件号快速分离 Eclipse Plus C18, 4.6 mm 1 mm, 3.5 µm 部件号快速分离 HT Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm 部件号样品和流动相按 USP 辛伐他汀片分析方法配制 [2] 样品制备图 1. 辛伐他汀的结构在生产高质量产品的同时降低成本是制药和普通药物生产商的目标与美国药典的辛伐他汀片剂方法 (25 mm 4.6 mm,5 µm 柱 ) 相比, 使用 Eclipse Plus C18 色谱柱能节省 6% 到 8% 的时间, 并相应节省了溶剂由于使用的溶剂是乙腈, 所以改用粒度更小的更短的色谱柱可能更有吸引力实验冰醋酸氢氧化钠溶液磷酸磷酸二氢钠和辛伐他汀均来自 Sigma-Aldrich 公司 USP 辛伐他汀来自美国药典 1. 将 3 ml 冰醋酸加入含 9 ml 水的 1 L 容量瓶中 2. 用 5N 氢氧化钠溶液调节 ph 至取 2 ml 上述溶液与 8 ml 乙腈混合, 配成稀释液 4. 将 USP 辛伐他汀标准品置于 1 ml 容量瓶中配成.1 mg/ml 标样分析制备 1. 将 1 片辛伐他汀置于 25mL 容量瓶中, 并加水 (5 到 1 ml) 2. 涡旋振摇至片剂溶解 3. 用稀释液将片剂溶液稀释到刻度 4. 取一定体积混合物离心, 再取一定体积澄明的上清液配制成最终浓度为.1 mg/ml 的辛伐他汀 2

3 流动相配制 1. 称取 3.9 g 磷酸二氢钠, 溶于 9 ml 水中 2. 确认 ph 为 4.5, 必要时可按 USP 方法用 5% 氢氧化钠或 85% 磷酸调节 3. 加水至 1 ml 并混匀流动相为乙腈和缓冲液的 65:35 混合物该方法的色谱和性能要求列于 USP 方法中这些要求总结如下 [2] 238 nm 检测 4.6 mm 25 mm 色谱柱,L1 色谱柱 (C18),1 µl 进样 45 C 1.5 ml/ 流速 k' 不小于 3 N 45 塔板数 USP 拖尾因子 (T f ) 不超过 2. 从图 2 中可以看出,USP 方法的柱效和其它色谱性能要求很容易满足在用上述 USP 方法操作的一天当中, 每 1-12 分钟可以进行一次分析即分析通量为每小时 5-6 次分析, 或每天 12 次进样 ( 按每次进样 12 分钟计算 ) 用 25 mm,5μm 柱, 一周可以进行 1 次进样在许多应用中, 这样的通量已足够调整方法还可以提高通量 USP 更新章节 <621> 提出了一个方法可以进行多大程度调整的建议, 其允许的改动包括 : 柱长 :±7% 柱内径 :±25% 柱填料粒度 : 最多减小 5%, 但不能增大流速 :±5% 进样量 : 只要符合系统适用性试验 (SST) 的指标即可改变柱温 :±1% 流动相 ph:±.2 UV 波长 : 改动不得超出生产商家的规定缓冲液的盐浓度 :±1% 超出上述范围的改动都需要重新验证如果分析人员选择使用更短的色谱柱, 如 4.6 mm 1 mm,3.5 µm 柱 ( 如图 3a 所示 ), 同使用 ZORBAX Eclipse Plus C18,4.6 x 25 mm,5µm 色谱柱进行辛伐他汀片剂分析, 完全符合 USP 方法系统适用性试验的要求 /ph 4.5 (65:35) 2 ZORBAX Eclipse Plus C mm 25 mm 5 µm ( ) 45 C ml/ µl.1 mg/ml USP UV 238 nm T R k N T f 图 2. 用 ZORBAX Eclipse Plus C18,4.6 mm 25 mm 5 µm 柱按 USP 方法分析辛伐他汀片 3

4 样的分析可以用原分析 4% 的时间完成 ( 每次进样约 4 分钟 ) 而且只需要使用 4% 的溶剂 USP 指南允许进行一定调整而无需再验证方法这些调整包括柱长 (±7%) 内径(±25%) 和粒度 ( 只能减小 5%, 不可增大 ) 从图 3a 中可以看出, 柱长内径和粒度允许的调整范围满足性能需求即便如此, 大多数实验室还是要对新方法进行验证该分析还可以使用 4.6 mm 5 mm,1.8 µm Eclipse Plus C18 色谱柱完成 ( 如图 3b 所示 ) 由于 USP 方法的性能要求很容易满足, 所以当方法超出了 621 方法调整的限度时又必要进行重新验证柱长缩短了 8%, 粒度减小了 62% 需要进行验证的步骤包括示范用于温度 ph 和有机相比例线性和耐用性试验在满足了辛伐他汀片 USP 方法性能要求的同时, 节省了时间和溶剂 (a) 8 / ph 4.5 (65:35) ZORBAX RREclipse Plus C18, mm, 3.5 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 4. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm 6 4 每次分析节省了 6 分钟和 9 ml 溶剂 T R k N T f (b) / ph 4.5 (65:35) ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 2. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm 8 6 每次分析节省了 8 分钟和 12 ml 溶剂 T R k N T f 图 3. 色谱图重叠显示了用更小粒径更短色谱柱的 USP 辛伐他汀片剂分析方法 4

5 证明稳定的色谱柱批次间重复性是一个经常被错误理解的步骤验证中需要证明的是用不同批次填料可以得到相同的分离结果这个步骤的目的是确保不是单一批次生产的柱填料也具有一致的选择性使方法获得成功这也可以理解为在一个方法执行过程中所购买的色谱柱会导致多大程度的分离差异为便于客户查阅, 安捷伦 ZORBAX 柱的色谱柱批号列于包装盒上, 以及盒内的数据表中图 4 显示了三根不同批号色谱柱的分离结果由图可见, Eclipse Plus C18, 4.6 mm x 5 mm, 1.8 µm 色谱柱性能数据 (N = 13,, Tf 1. and k 4.9) 的一致性比该分析所要求的更好用 ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18 柱成功而快速地进行三个批次的耐用性测试 / ph 4.5 (65:35) ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 2. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm B821 B7125 B811 T R k N T f B B B 图 4. 重叠显示了用三个生产批次的色谱柱执行 USP 辛伐他汀片方法 5

6 图 5 显示了有机相比例改变对分析的影响 USP 允许流动相中的溶剂比例调整为 : 相对 ±3% 或绝对 ±2%, 但无论哪种, 变动都不能超过 1%( 基于流动相的 5% 或更少 ), 任何流动相组成的最终浓度不得减为零因为我们的流动相中有机相较高 (65% 乙腈 ), 所以我们根据较小比例成分 ( 缓冲液 ) 进行调整缓冲液的 3% 即为 1.5% 调整的最大允许量为 ±1% 允许的调整范围为缓冲液的 31.5% 到 38.5%, 或乙腈 68.5% 到 61.6% 随着有机相比例减小, 保留也如预期减小虽然有机相变化所导致的性能数据波动比色谱柱不同批次的数据要大, 但仍在方法的要求范围内在允许范围内调整流动相组成符合方法要求 / ph 4.5 ( ) ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 6 2. µl.1 mg/ml USP 5 4 UV 238 nm % % % % T R k N T f 图 5. 重叠显示调整二元流动相的 USP 辛伐他汀片方法 6

7 图 6 显示了 ph 对辛伐他汀分析的影响在测定范围内几乎没有检测到 ph 的变化但对于许多其它极性化合物这也会对分析产生很大影响在允许范围内调节 ph 对分离没有影响 / ph 4.5 (65:35) ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 2. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm ph = ph = ph = T R k N T f ph = ph = ph = 图 6. 重叠显示调节不同 ph 的 USP 辛伐他汀片方法 7

8 最后, 温度变化对方法的影响见图 7 我们考察了温度变化 ±1% 的影响在 1 C 范围内变化, 仍能满足性能要求调节温度仍符合方法要求 / ph 4.5 (65:35) ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 2. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm C 45 C 5 C T R k N T f 4 C C C 图 7. 重叠显示调节温度的 USP 辛伐他汀片方法 8

9 图 8a 显示了分析的线性和回收率数据用 5% 到 15% 的校正超过了所配制样品 (.1 mg/ml) 的 8% 到 12% 预期范围的要求通过计算在样品中加入已知量标准的回收率, 测定精密度在要求范围内, 以及之上和之下, 进行测定并比较因 USP 没有指定样品数, 所以按国际协调会 (ICH) 的建议, 每个浓度水平测定三次结果如图 8b 所示, 准确度接近 1%, 说明方法完全能够满足需要最后, 由三个化学家用不同仪器进行了耐用性试验, 结果见图 8c 再验证需要进行的测定很少用这种更快的方法分析 1 多个样品, 所有验证成本都可以包含在内用 RRHT Eclipse Plus C18 测定辛伐他汀, 显示了良好的线性耐用性和重现性 8 7 DAD1 A = *Amt _ Res% (1): _ e (a) (b) /RSD (%) (%) ± ± ±.21 : [mg/ml].1.15 (c) (%) /RSD (%) /RSD (%) /RSD (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ±.22 图 8. 调整后 USP 辛伐他汀片分析方法的线性和回收率 a) 线性,b) 准确度,c) 回收率 9

10 大多数实验室负责人都很关心分析实际样品时的柱寿命为了验证这一新方法的效果和稳定性, 我们用实际样品在 4.6 mm 5 mm Eclipse Plus C18 色谱柱上进行了 11 次进样取 1 片 4 mg 辛伐他汀片 (Teva 制药公司 ) 在水中分散, 用稀释液溶解, 如参考 1 所述每个 USP 步骤, 取几份溶液置于 2 只离心管中离心取每份溶液的上清液稀释成.1 mg/ml 辛伐他汀, 并转移至自动进样器样品管中用 4 升磷酸盐缓冲液和 4 升乙腈充满 Agilent 12 系列 SL 系统的溶剂瓶从图 9 中可以看出, 该方法进样 11 次后柱效未降低, 柱压也没有增加该方法产生的压力在 4 bar 以下, 从而使这一方法可以在所有现代 HPLC 系统上运行进样次数受 4 升乙腈量的限制如果用 25-mm, 5-µm 色谱柱进行这一分析, 大约需要 2 升乙腈另外,1 次进样分析大约用了 33 小时如果是用 USP 指定方法在 25 mm 色谱柱上进行这一分析, 需要花 165 小时或 6.85 天才能完成这些测定 RRHT Eclipse Plus C18 色谱柱 1 多次进样未显示性能损失 (bar) (N) / ph 4.5 (65:35) ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm ( ) 45 C 1.5 ml/ 2. µl.1 mg/ml USP UV 238 nm 图 9. 调整后 USP 辛伐他汀方法的寿命研究显示 11 次进样未降低柱效和增加压力 1

11 结论虽然当前 FDA 和 USP 建议的方法调整是允许在 ±25% 范围内改变柱尺寸, 但已提议的 USP 修订版在假设线性流速恒定的情况下允许根据需要调整柱内径 (ID)[2] 该提案记录于 USP 3 第二期增补版中, 药典论坛 34(5)(PF34 (5)), 预计将于 29 年底正式审定新的指导原则将在此时之后用于各种方法 [4] 在上述提案中还有对粒度调整许可范围的改变在当前的方法调整中, 粒度最多只能减小 5%, 即将 5µm 变成 3.5 µm 粒度填料, 从 3.5 µm 改成 1.8 µm 填料而从 5µm 变成 1.8 µm 则变动过大, 需要对方法进行再验证 29 年 12 月以后确定的方法中, 在 3.5 µm 柱上开发的方法既可以进行增大粒度也可以进行减小粒度的调整 ( 只要能保持性能 ), 并在的指导原则范围内 [4] 在本文中介绍的 Agilent SL 型 12 系统上很轻松地将 USP 辛伐他汀片分析方法转化为使用 4.6 mm 1 mm, 3.5 µm 色谱柱或 4.6 mm 5 mm, 1.8 µm 色谱柱的调整方法所有案例中, 都超出了柱效要求的 1% 根据柱体积调整了进样体积使用 Eclipse Plus C18 RRHT 色谱柱时, 可缩短时间和节省溶剂用量 8%, 压力系统均在 4 bar 以下最后, 该色谱柱连续进样 1 次仍无柱效降低或压力增加, 证明 4.6 mm 5 mm, 1.8-µm Eclipse Plus C18 色谱柱是辛伐他汀分析的最佳选择参考文献 1. American Heart Association (cholesterol lowering drugs). 2. USP Simvastatin Tablet Method. "United States Pharmacopeia 31 NF 26" Rockville, MD USP Method Validation Guidance. "United States Pharmacopeia XXX Supplement 2: System Suitability Testing, Rockville, MD. 27, Chapter <621>. 4. USP 3 Second Supplement Revisions, PF34 (5), in process and expected to be final Dec 29. 更多信息如需了解我们产品和服务的更多信息, 请访问我们的网站 11

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5990-7492CHTW_5989_5672.qxd 使用 Poroshell 1 EC-C18 管柱快速分析 Cefepime 及相關雜質應用備註製藥作者 William J. Long Agilent Technologies, Inc. 8 Centerville Road Wilmington, DE 1988 USA 緒論頭孢菌素 (Cephalosporin) 為最常使用的抗生素