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1 安捷伦应用解决方案 用于营养标签的食品基质中脂溶性维生素的分析 应用报告 食品 1 Agilent 12 Infinity 作者 1 Siji Joseph Agilent Technologies, Inc. Bangalore, India min 4 2 Agilent 12 Infinity min 摘要 本应用报告描述了两种不同食品基质中脂溶性维生素的定性和定量分析 同时本文建立了一种耐用的可同时测定 种脂溶性维生素的反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 采用 Agilent Poroshell EC-C1 色谱柱在 Agilent 12 Infi nity LC 系统上实现了 种脂溶性维生素的分离和定量 具有多波长选择特性的 Agilent 12 Infi nity 二极管阵列检测器 (DAD) 可有效实现在各种维生素的最大吸收波长处对其进行检测 该方法用于常规营养标示分析, 通过部分验证确定其耐用性, 并通过分析两种不同食品基质中的维生素 D 进行方法学验证 最后, 采用 Agilent 12 Infi nity LC 系统, 将该 HPLC 法有效转移至耗时较短的超高压液相色谱 (UHPLC) 上

2 引言 维生素是维持机体健康生长且必须从食物中获取的微量营养物质 维生素一般被分为两类, 水溶性维生素和脂溶性维生素 由于食品中存在从纳克到微克级不同含量水平的维生素, 因而像婴幼儿配方奶粉中的维生素, 需要标示其含量是美国食品药品监督管理局 (FDA) 的一项强制性规定 各维生素化学性质的差异使得所有维生素的共同提取和分析极具挑战 基于此, 水溶性和脂溶性维生素的分析通常分别进行 之前的一篇安捷伦应用解决方案 1 提供了同时分析 1 种水溶性维生素的方法 本研究探讨了同时分析 种脂溶性维生素的方法, 所涉及的维生素包括维生素 A D E 和 K, 这些都是食品中常见的脂溶性维生素 尽管各种脂溶性维生素的提取步骤不尽相同, 但文中建立的分析方法可通过一次 LC 运行对分析物定量, 从而降低了分析难度 本文采用 UV 检测, 建立了耗时大约 15 min 灵敏度高 耐用性好的方法, 可同时分析 种脂溶性维生素, 并可将该 HPLC 法转换为耗时仅 3.5 min 的 UHPLC 法, 满足了特别需要短分析时间的用户 实验部分 仪器和软件 采用包含以下模块的 Agilent 12 Infi nity 四元泵 LC 系统 : 集成真空脱气机的 Agilent 12 Infinity 四元泵 (G1311B) Agilent 12 Infi nity 高效自动进样器 (G13E) Agilent 12 Infi nity 柱温箱 (G131C) 配备 mm 光程流通池的 Agilent 12 Infinity 二极管阵列检测器 (G4212B) 采用包含以下模块的 Agilent 12 Infi nity LC 系统建立并实现 UHPLC 分析 : 集成真空脱气机的 Agilent 12 Infi nity 二元泵 (G422 A) 及 1 µl Jet Weaver 混合器 Agilent 12 Infi nity 高效自动进样器 (G422A) Agilent 12 Infinity 柱温箱 (G131C) 配备 1 mm 光程流通池的 Agilent 12 Infi nity 二极管阵列检测器 (G4212A) 色谱柱 : 试剂和材料所有化学药品和溶剂均为色谱级 高纯水由 Milli Q 水纯化系统 (Millipore Elix 1,Millipore,USA) 制备 超梯度级的乙腈和甲醇购自 Lab-Scan 公司 ( 泰国曼谷 ),Biotech 级的四氢呋喃 (THF) 购自 Sigma 公司 ( 德国 ) 洗脱液添加剂醋酸购自 Fluka 公司 ( 德国 ), 本研究所用的其它化学品均为 Aldrich 公司 ( 印度 ) 产品 标准品 : 甲萘醌 (K 3 ) 亚麻酸 (-ω 脂肪酸 ) 视黄醇( 维生素 A 的醇形式 ) 视黄酸( 维生素 A 的酸形式 ) - 顺视黄醛 ( 维生素 A 的醛形式 ) 维生素 K 2 胆骨化醇 (D 3 ) 生育酚( 一种维生素 E) 维生素 K 1 均购自 Aldrich 公司 ( 印度 ) 用于本研究中回收率测定和营养标示分析的婴幼儿配方奶粉和复合维生素片均购自当地 Agilent Poroshell 12 EC-C1 色谱柱, 内径 2.1 mm, 柱长 5 mm, 填料粒径 2. µm(5-2) Agilent Poroshell 12 EC-C1 色谱柱, 内径 3. mm, 柱长 15 mm, 填料粒径 2. µm(35-32) 软件 : 安捷伦化学工作站 (B.4.2 版 ) 2

3 色谱参数 反相液相色谱法和 UHPLC 法所用的色谱参数见表 1 脂溶性维生素标准溶液的配制 称取约 5 mg 维生素标准品 ( 甲萘醌 亚麻酸 视黄醇 视黄酸 视黄醛 维生素 K 1 K 2 D 3 生育酚 ), 分置于 25 ml 量瓶中, 加入流动相 B, 制成 2. mg/ml (2 ppm) 的标准储备液, 必要时超声处理 将脂溶性维生素标准储备液用铝箔包裹, 于 4. C 避光保存备用 混标和线性梯度浓度样品的配制 精密量取各标准溶液约 1 µl, 制成脂溶性维生素的混合标准溶液 1 µl, 各种维生素的浓度均为 2 ppm 然后用流动相 B 作稀释剂, 将此 2 ppm 的混合标准溶液逐级稀释制备成各线性浓度水平, 标准溶液的线性范围为 5 pg/µl~ 1 ng/µl(1 浓度水平, 平行测定 次 ) 用于营养标示分析和回收率测定样品的制备 两种不同类型的样品 : 婴幼儿配方奶粉和维生素片用于营养标示分析和回收率研究 本研究以维生素 D 作为分析物评估回收率并进一步进行营养标示分析 5 g 婴幼儿配方奶粉中的维生素 D 以碱水解法提取, 采用氢氧化钾的乙醇溶液, 回流约 45 min 2, 并在回流时加入邻苯三酚作抗氧剂 样品皂化后, 以 1 ml 己烷 - 乙醚 (1:1) 混合液提取维生素 D 取 1. ml 该有机层连续水洗后蒸发至干, 再用 2 µl 流动相 B 复溶,HPLC 进样, 进行营养标 参数 Agilent 12 Infinity 四元泵 LC 系统 Agilent 12 Infinity LC 系统 柱温 : 45 C 45 C 采集速率 : 2 Hz Hz 数据采集波长 : nm nm 流通池 : mm 光程 mm 光程 进样体积 : 5 µl( 洗针, 冲洗端口 5 s) 1 µl ( 洗针, 冲洗端口 3 s) 恒温进样器 : 5 C 5 C 流动相 A: 水 :THF 为 5:5 ( 含.5% 醋酸 ) 水 :THF 为 5:5( 含.5% 醋酸 ) 流动相 B: 乙腈 : 甲醇 :THF 为 5:25:5( 含.35% 醋酸 ) 梯度程序 : min & 3%B 3 min & 5%B min & 1%B 15 min & 1%B 15.1 min & 3%B 后运行时间 : 5 min 1 min 乙腈 : 甲醇 :THF 为 5:25:5( 含.35% 醋酸 ) min & 5%B. min & 5%B 1. min & 1%B 3.4 min & 1%B 3.5 min & 5%B 流速 :. ml/min. ml/min 表 1 Agilent 12 Infinity LC 系统和 Agilent 12 Infinity LC 系统所用的色谱参数 示分析 采用加标和不加标的婴幼儿配方奶粉进行回收率研究, 进样浓度为 25 ng 的维生素 D 标准品用于样品加标 提取步骤同上 对于复合维生素片, 仅用一片进行回收率和营养标示研究 注意事项 众所周知, 维生素对光和热高度敏感 为了延长其在溶液中的稳定性, 所有制备的溶液都用铝箔包裹, 放入冰箱, 于 4 C 冷藏避光保存备用 温度可控的自动进样器样品盘在分析时也保持在 4 C 样品中维生素 D 提取时需避光操作 操作步骤 进样 5 µl 流动相 B 作为空白, 然后进样各线性浓度水平的标准溶液, 平行测定 次 计算每一浓度水平峰面积和保留时间 (RT) 的标准偏差 (SD) 和相对标准偏差 (RSD) 通过进样分析较低线性浓度水平的样品, 确定 LOD 和 LOQ 以每一浓度水平维生素样品的平均峰面积对其浓度作图绘制标准曲线 通过改变 个关键的方法参数来评估该方法的耐用性 并且混合加标溶液平行测定 次, 数据也用于耐用性研究 对于营养标示分析, 将婴幼儿配方奶粉和复合维生素片中含有的维生素 D 进行定量分析并与标示值比较 3

4 往 5 g 婴幼儿配方奶粉或单片复合维生素片中加入 25 ng 维生素 D 标准品, 通过加标和不加标样品分析进行回收率研究 该方法可有效转移至 UHPLC 本文中评价了各种维生素的 LOD LOQ 和线性关系, 并通过峰面积和保留时间的 RSD 评价方法的精密度, 同时绘制了所有维生素的线性曲线 结果与讨论 分离与检测 采用 Agilent Poroshell 12 EC-C1 (3. mm x 15 mm,2. µm) 色谱柱使 种脂溶性维生素 13 min 内得到极佳的分离 基于分子结构的差异, 不同维生素的最大吸收波长不同 种维生素的色谱洗脱模式见图 1, 各维生素及其最大吸收波长如表 2 所示 21 nm 所检测色谱图中的基线漂移是因为在梯度运行中流动相改性剂的比例发生了变化 采用化学工作站软件中的峰纯度检测功能考察每个色谱峰的纯度, 然后评价方法的专属性 本文中方法学验证内容包括了精密度 线性范围 准确度 专属性 回收率和耐用性实验 12 4 DAD1A, Sig = 21 DAD1D, Sig = > > min 图 1 采用 15 cm 的 Agilent Poroshell 12 EC-C1 色谱柱分离 种脂溶性维生素 插入图中显示三种不同形式的维生素 A 得到极佳的分离 序号名称异名最大吸收波长 保留时间 1 甲萘醌维生素 K 亚麻酸 -ω 脂肪酸 < 视黄醇 维生素 A 醇 视黄酸 维生素 A 酸 顺视黄醛 维生素 A 醛 3.55 维生素 K 2 维生素 K 胆骨化醇 维生素 D 生育酚 一种维生素 E < 维生素 K 1 维生素 K 表 2 本文研究的维生素及各维生素的最大吸收波长列表 4

5 检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ) LOD 是指信噪比 (S/N)> 3 时分析物的浓度,LOQ 是指 S/N > 1 时分析物的浓度 各维生素测得的 LOD 和 LOQ 值如表 3 所示 例如, 图 2 为胆骨化醇 ( 维生素 D) 的 LOD LOQ 及空白样品的叠加色谱图 线性 所制备的各线性浓度水平的样品均平行测定 次, 本研究中每种维生素的线性曲线都从 LOQ 浓度水平到极高浓度水平, 并以峰面积响应值对其浓度值绘制线性曲线 这个线性范围涵盖了当前常见食品基质中维生素的含量 所有维生素测得的回归系数如表 3 所示 其中以胆骨化醇的线性曲线为例所作线性曲线图, 见图 LOQ LOD DAD1 C, Sig = 2 LEVEL 5 PG_LOQ DAD1 C, Sig = 2 LEVEL 25 PG_LOD DAD1 C, Sig = 2, BLANK min 图 2 胆骨化醇 ( 维生素 D) 的 LOD(25 pg) 和 LOQ(5 pg) 及空白样品的叠加色谱图 序号名称 LOD(ng) LOQ(ng) 线性范围 (ng) 柱上量 R 2 值 浓度水平, 平行测定次数 = 线性方程 1 甲萘醌 y = x 亚麻酸 y =1.122 x 视黄醇 y = x 视黄酸 y = x 视黄醛 y = x 维生素 K y = x 胆骨化醇 y = 1.24 x 5.24 生育酚 y =.413 x 维生素 K y = x 表 3 种维生素的 LOD LOQ 及线性结果 5

6 保留时间 (RT) 和峰面积的精密度 计算进样量为 5 ng 的 种维生素的保留时间 (RT) 和峰面积的相对标准偏差 (RSD) 以评价方法的精密度 测得峰面 = 1.24*Amt 积的 RSD 最大值为.35%, 保留时间的 RSD 最大值为.4% 种维生素的峰面积和保留时间的 RSD 值如图 4 所示 4 耐用性通过刻意改变六个关键的方法参数评价该方法的耐用性, 同时计算所产生的峰面积和保留时间的偏差, 并与原方法结果进行比较 例如, 维生素的加标混合样品平行测定 次, 保留时间和峰面积的允许偏差分别为 ± 3% 和 ± 5% 耐用性研究结果汇总见表 4 耐用性研究考察了增大流速 改变流动相组成及柱温, 结果表明保留时间的偏差均在允许的限度内 但是, 洗脱梯度斜率变化的影响较大, 测得的保留时间偏差超过了限度 除了维生素 K 2, 种维生素峰面积的偏差在大多数实验中均在允许的限度内 维生素 K 2 的峰面积受流速 梯度斜率 柱温 流动相组成和检测波长的影响很大 并且检测波长需严格控制 耐用性结果表明, 该方法对于常规检测是可靠的, 在很大程度上, 测定结果未受参数改变的影响 [ng] 图 3 浓度范围为.5 ng~5 ng( 进样浓度 ) 的胆骨化醇的线性曲线, 展现了极佳的相关系数 RT RSD.4 RSD.35 RSD.3 RT RSD 图 4 进样量为 5 ng 的 种维生素显示了极佳的保留时间和峰面积 RSD 值 K 2 K 1

7 序号参数 ( 实际值 ) 测量偏差修正值 RT 的偏差 ( 允许限度 ± 3.%) 峰面积的偏差 ( 允许限度 ± 5.%) 1 流速 (. ml/min) 2%.2 ml/min 达标 种化合物达标. ml/min 种化合物达标 种化合物达标 2 进样体积 (5 µl) 2% 5.1 µl 达标 种化合物达标 3 梯度斜度 (5,5 min 内由 5 1) 4 流动相组成 (5% 乙腈 ) 4. µl 达标 种化合物达标 1% 4.5(.5 to 1 in 5 minutes) 5 种化合物达标 ( 按原始梯度 程序洗脱,4 种化合物未达标 ) 5.5(2.5 to 1 in 5 minutes) 5 种化合物达标 ( 按原始梯度程序洗脱,4 种化合物未达标 ) 种化合物达标 种化合物达标 5% % 乙腈 (:15:5) 达标 种化合物达标 % 乙腈 (:25:5) 达标 种化合物达标 5 柱温 (45 C) 5% 4.2 C 达标 种化合物达标 波长 ( nm) 表 4 耐用性实验结果汇总 42. C 达标 种化合物达标 3 nm ( nm) 达标 种化合物达标 ( nm) 达标 5 种化合物达标 样品中维生素 D 的回收率复合维生素片和婴幼儿配方奶粉中维生素 D 的回收率实验采用标准加入法 3 所用维生素 D 标准溶液的浓度为 25 ng/µl 本研究分别测定加标样品 不加标样品及标准样品色谱图中维生素 D 的峰面积 通过加标样品 不加标样品检测响应值的差值与测得的标准样品谱图的响应值作对比, 以百分比表示回收率 复合维生素片和婴幼儿配方奶粉的回收率结果分别为 4% 和 2% 婴幼儿配方奶粉的回收率低可能是由于该基质含有大量蛋白质和脂肪, 因而维生素的提取是一项挑战 加标 不加标样品及维生素的标准样品谱图见图 5 图 DAD1 C Sig = min DAD1 C Sig = min DAD1 C Sig = min 复合维生素片的加标 不加标及标准样品谱图的叠加图

8 营养标示 本研究通过峰面积响应值计算得到婴幼儿配方奶粉和复合维生素片中维生素 D 的含量并与标签上标示的浓度进行了对比 采用线性曲线所得的线性方程进行计算 采用 KOH 的乙醇溶液回流提取样品 婴幼儿配方奶粉和复合维生素片中维生素 D 的标示值分别为.3 µg/1 g 和 1 µg/ 片 而回收率校正后的样品中维生素 D 计算值分别为. µg/1 g 和 12. µg/ 片 结果显示该方法可很好地用于食品中维生素的定量分析 UHPLC 法本文建立了采用二极管阵列检测器的 UHPLC 法分离 种脂溶性维生素 与耗时 15 min 的 HPLC 梯度方法相比,UHPLC 法展现了极佳的分离度, 并可节省约 % 的分析时间和溶剂 ( 见图 ) 视黄醇色谱峰与视黄酸色谱峰在洗脱时稍有重叠 当然, 这基本不会影响维生素的实际分析, 因为在给定的样品中, 维生素 A 的醇形式 ( 视黄醇 ) 和酸形式 ( 视黄酸 ) 基本不会同时存在 除了视黄醇外, 采用 UHPLC 法确定了其余各维生素的 LOD LOQ 和线性关系 测得的 LOD LOQ 和线性关系结果如表 5 所示 图 显示维生素 D 的线性关系极为优异 同时, 计算了进样体积 1 µl, 进样浓度 1 ppm 溶液的保留时间和峰面积的 RSD 值 所测得的峰面积和保留时间的 RSD 最大值分别为 1.25% 和.12%, 结果如图 所示 峰面积和保留时间的 RSD 值较低表明该方法精密度良好 1 12 图 Agilent 12 Infinity LC Agilent 12 Infinity LC min 结果表明建立的 UHPLC 法具有可靠性和高灵敏度 本方法可用于食品的快速营养标示分析 采用 Agilent 12 infinity 的 HPLC 法和 Agilent 12 Infinity LC 系统的 UHPLC 法分离 种脂溶性维生素的叠加色谱图 序号名称 LOD(ng) LOQ(ng) 色谱峰 1. 甲萘醌 2. 亚麻酸 3. 视黄醇 4. 视黄酸 5. 顺视黄醛. 维生素 K 2. 胆骨化醇. 生育酚. 维生素 K 1 线性范围 (ng) 柱上量 R 2 值 1 甲萘醌 亚麻酸 视黄酸 视黄醛 维生素 K 胆骨化醇 生育酚 维生素 K 表 5 采用 Agilent 12 Infinity LC 系统的 UHPLC 法测得的 LOD 和 LOQ 值 min 浓度水平, 平行测定次数 =

9 54231 结论 本研究使用 Agilent Poroshell 12 EC-C1 色谱柱对 种脂溶性维生素进行分离和定量 先用 Agilent 12 Infi nity LC 系统建立了耐用 耗时 15 min 的 HPLC 梯度洗脱方法 该方法可成功地用于定量分析维生素, 如甲萘醌 亚麻酸以及不同形式的维生素 A D E 和 K 本方法的线性范围宽, 涵盖许多食品中这些维生素可能的浓度 梯度洗脱可确保更好的色谱分离 提高灵敏度并减少基质干扰 该方法简便 快速 专属性强 灵敏度高, 并具有良好的精密度 线性关系和回收率 通过婴幼儿配方奶粉和复合维生素片中维生素 D 的定量分析证实了该方法的高效性 之后, 将该方法转换为采用 Agilent 12 Infi nity LC 系统的 UHPLC 法, 其耗时仅 3 min, 并可节省 % 的分析时间和溶剂 采用 Agilent 12 Infi nity LC 系统和 Agilent 12 Infi nity LC 系统的方法可用于脂溶性维生素准确的常规营养标示分析 Area = 3.221*Amt [ng] 图 浓度范围为.5 ng ~ 5 ng 的维生素 D 的线性关系, 相关系数为.( 浓度水平, 平行测定 次 ), 进样体积为 1 µl RSD 1 ng RSD 1 RT RSD. %..4.2 K 2 K 1 图 除视黄醇外, 其余维生素采用 UHPLC 法测得的峰面积和保留时间的 RSD 结果, 进样浓度均为 1 ppm, 进样体积为 1 µl, 平行测定六次

10 参考文献 1. 用于营养标签的复合维生素片中的水溶性维生素的分析方法, 安捷伦应用报告, 出版号 :5-5CHCN, Leo M.L. Nollet, Food analysis by HPLC, Second edition revised and expanded, Chapter:, Page: Duncan Thorburn Burns, Klaus Danzer, and Alan Townshend, Use of the terms recovery and apparent recovery in analytical procedures, Pure Appl. Chem., Vol. 4, No. 11, pp , 22. 1

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12 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 月 1 日, 中国印刷出版号 5-CHCN

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