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1 805 放射生物学阿帕替尼对食管癌 Kyse 150 细胞放射敏感性影响的实验研究孙菲孙志强汪建林王坚胡莉钧周梦耘封悦孔泽华秋于静萍南京医科大学附属常州第二人民医院放疗科通信作者 : 于静萍, yujingping700420@ sina. com DOI: / cma. j. issn 摘要目的观察阿帕替尼对食管癌 Kyse 150 细胞放射敏感性的影响, 并初步探讨其作用机制方法将食管癌 Kyse 150 细胞分为空白对照组阿帕替尼组单纯照射组阿帕替尼联合照射组 CCK 8 法检测不同浓度阿帕替尼 ( μmol / L) 对细胞增殖的影响 ; 克隆形成法检测不同浓度阿帕替尼 ( μmol / L) 对细胞放射敏感性的影响 ; 流式细胞术分析阿帕替尼 (20 μmol / L) 联合射线 (4 Gy) 对细胞周期和细胞凋亡的影响结果阿帕替尼能抑制 Kyse 150 细胞的增殖, 且呈剂量时间依赖性 (r = 0 89 ~ 0 96,P < 0 05); 随着阿帕替尼浓度的增加,Kyse 150 细胞的放射生物学参数 D 0 SF 2 值逐渐减小, 而放射增敏比 SER D0 值逐渐增加阿帕替尼联合照射组分别与空白对照组单纯照射组及阿帕替尼组比较, 细胞凋亡率均显著增加, 差异具有统计学意义 (t = , P < 0 05) 与空白对照组比较, 阿帕替尼组单纯照射组及阿帕替尼联合照射组 G 2 / M 期比例均增高, 差异均具有统计学意义 (t = ,P < 0 05) 阿帕替尼组阿帕替尼联合照射组分别与空白对照组及单纯照射组相比,S 期比例均增高, 差异均具有统计学意义 (t = ,P < 0 05) 而阿帕替尼组与阿帕替尼联合照射组相比,S 期比例差异无统计学意义 (P > 0 05) 结论阿帕替尼能增加食管癌 Kyse 150 细胞的放射敏感性, 其机制可能与抑制细胞增殖促进细胞凋亡及诱导细胞周期再分布有关关键词食管癌 ; 放射敏感性 ; 阿帕替尼 ; 细胞凋亡 ; 细胞周期基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) Radiosensitizing effect of apatinib on esophageal cancer cell line Kyse 150 Sun Fei, Sun Zhiqiang, Wang Jianlin, Wang Jian, Hu Lijun, Zhou Mengyun, Feng Yue, Kong Ze, Hua Qiu, Yu Jingping Department of Radiotherapy, Changzhou No. 2 People s Hospital, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Changzhou , China Abstract Objective To evaluate the radiosensitization effect of apatinib on esophageal cancer cell line Kyse 150, and to investigate the underlying mechanism. Methods Cells were divided into four groups: control group, apatinib treatment group, X ray radiation group, and the combination group treated with X rays plus apatinib. The effect of apatinib with different concentrations on the cell proliferative and radiosensitivity were evaluated by CCK 8 kit and colony formation assay. Flow cytometry method was adopted to detect the effect of apatinib on cell cycle progress and apoptosis induction. Results Apatinib inhibited the proliferation of Kyse 150 cells in time and dose dependent manners (r = , P < 0 05). With the increase of apatinib concentration, D 0, D q and SF 2 value of Kyse 150 cells decreased and SER D0 value increased. Compared with control group, apatinib alone group, and radiation alone group, the cell apoptosis rate significantly increased in the combination group (t = , 5. 99, ,P < 0 05). Compared with control group, the percentages of cells in G 2 / M phase were all significantly increased in apatinib group, radiation group and combination group ( t = 8. 81, , ,P < 0 05). Compared with radiation alone group and control group, the percentage of cells in S phase significantly increased in apatinib alone group and combination group ( t = 6 06, 3 82, 8 81, 6 24, P < 0 05 ). Conclusions Apatinib can increase radiosensitivity of esophageal cancer cell line Kyse 150 possibly by inhibiting cell proliferation, inducing cell apoptosis and causing redistribution of cell cycle. Key words Esophageal cancer; Radiosensitivity; Apatinib; Apoptosis; Cell cycle Fund program: National Natural Science Foundation of China ( )

2 806 中华放射医学与防护杂志 2017 年 11 月第 37 卷第 11 期 Chin J Radiol Med Prot, November 2017,Vol. 37,No. 11 放射治疗是中晚期食管癌的主要治疗手段, 尽管技术有了长足的进步, 但食管癌放射治疗后 5 年生存率仍仅有 10% ~ 39%, 失败率在 85% 以上 [1] 因此, 如何增加食管癌细胞的放射敏感性, 以提高放疗疗效, 一直是研究的热点和难题已有文献报道, 具有抗血管生成作用的药物如沙利度胺重组人血管内皮抑素尼妥珠单抗等能增加食管癌细胞的放射敏感性 [2 6], 且在临床放射治疗中取得了一定的治疗效果甲磺酸阿帕替尼 ( YN968D1) 是我国自主研发的多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂, 研究证实, 阿帕替尼可抑制 VEGFR 2 的活性, 阻断其与 VEGF 结合后的信号转导因此, 推测阿帕替尼也可抑制肿瘤的血管生成 [7 8], 具有潜在的放疗增敏作用本研究旨在观察阿帕替尼对食管癌细胞放射敏感性的影响, 并初步探讨其作用机制材料与方法 1. 主要试剂与仪器 : RPMI 1640 培养基含 0 25% EDTA 的胰酶青霉素链霉素双抗 ( 美国 GIBCO 公司 ), 胎牛血清 ( 杭州四季青产品 ), 阿帕替尼溶剂 ( 美国 MCE 公司 ), 浓度为 10 mmol / L 实验前以 RPMI 1640 培养基稀释 CCK 试剂盒 ( 日本同仁研究所 ), 结晶紫染色液 Annexin V FITC 细胞凋亡检测试剂盒细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒均由江苏碧云天公司提供 ; X 射线辐照装置 ( 德国西门子 Primus H 型医用直线加速器 ), 吸收剂量率 1 Gy / min, 源靶距 100 cm 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ) 2. 细胞系与细胞培养 : 人食管鳞癌细胞系 Kyse 150 购自中国科学院细胞库 ( 目录号 :TCHu230), 用含 10% 胎牛血清 1% 青霉素链霉素双抗的 RPMI 1640 培养基配成培养液, 于 37 5% CO 2 的培养箱中培养细胞单层贴壁, 每 2 ~ 3 天传代 1 次, 选取指数生长期细胞用于实验 3. CCK 8 法检测阿帕替尼对食管癌 Kyse 150 细胞增殖能力的影响 : 取指数生长期细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 以每孔个接种于 96 孔细胞培养板中, 待细胞贴壁后, 阿帕替尼组更换含阿帕替尼终浓度为和 40 μmol / L 的培养液 200 μl, 空白对照组仅加入不含阿帕替尼的完全培养液各组设 6 个平行孔, 每板分别于 37 5% CO 2 的培养箱中孵育和 72 h 后, 每孔加入 10 μl CCK 8 溶液, 继续培养 4 h, 用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度 ( A) 值, 计算抑制率细胞增殖抑制率 (% ) = 1 - ( 实验组 A 值 - 空白组 A 值 ) / ( 对照组 A 值 - 空白组 A 值 ) 100% 求出 50% 细胞生长抑制浓度 (IC 50 ) 独立实验重复 3 次 4. 克隆形成实验测定细胞存活分数 : 实验分空白对照组单纯照射组 (2 4 6 和 8 Gy) 阿帕替尼组 (10 20 和 40 μmol / L), 阿帕替尼联合照射组 ( 阿帕替尼浓度同阿帕替尼组,X 射线剂量同单纯照射组 ) 取指数生长期细胞, 胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液, 以 500 个细胞接种于培养皿中, 贴壁培养 24 h 后换液, 阿帕替尼组及联合组加入终浓度分别为 μmol / L 的含阿帕替尼培养液, 继续培养 48 h 后进行 X 射线照射照射后所有组立即更换为不含阿帕替尼的培养液, 继续培养 8 d 后磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂洗,4% 多聚甲醛固定, 结晶紫染色, 以显微镜下计数 50 个以上的细胞计算集落形成率 (PE),PE(% ) = 集落数 / 细胞接种数 100% ; 细胞存活分数 (SF) = 克隆数 / 相同条件下接种的细胞数 PE 应用 Graphpad Prism 5 0 软件, 以单击多靶模型,SF = 1 - (1 - e - D/ D 0 ) 拟合细胞存活曲线, 测定计算 N D 0 SF 2 等多个放射生物学参数, 计算放射增敏比独立实验重复 3 次 5. 流式细胞仪检测细胞周期分布 : 实验分空白对照组单纯照射组 ( 4 Gy ) 阿帕替尼组 (20 μmol / L) 和阿帕替尼联合照射组细胞培养及阿帕替尼处理时间同克隆形成实验 X 射线照射后换液继续培养 24 h, 胰酶消化离心半径 20 cm r / min 离心 5 min 收集培养皿中贴壁及悬浮细胞,PBS 洗涤, 加入 75% 乙醇固定,4 保存过夜离心半径 20 cm r / min 离心 5 min, 去除乙醇, PBS 洗涤后离心获取细胞, 细胞重悬于含 RNase (1 87% ) 的碘化丙啶 (PI) 溶液中染色,37 避光温浴 30 min 后上机检测, 用 Flowjo 软件对细胞周期分布进行计算独立实验重复 3 次 6. Annexin V FITC 和 PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡率 : 实验分组及细胞培养同细胞周期分布检测 X 射线照射后换液继续培养 24 h, 用不含 EDTA 的胰酶消化各组细胞, 计数, 制成细胞密度 / L 的悬液, 按 Annexin V FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作, 用流式细胞仪检测, 用 Flowjo 软件对样品的细胞凋亡率进行计算独立实验重复 3 次 7. 统计学处理 : 采用 SPSS 20 0 软件进行数据

3 807 分析数据以 x ± s 表示两组间比较经正态性检验符合正态分布, 采用独立样本 t 检验, 多个样本均数间比较经方差齐性检验, 采用单因素方差分析 (one way ANOVA ) P < 0 05 为差异有统计学意义结果 1. 阿帕替尼对食管癌 Kyse 150 细胞的增殖抑制作用 :CCK 8 检测结果示, 不同浓度的阿帕替尼作用于食管癌 Kyse 150 细胞和 72 h 后, 均可抑制细胞的生长, 且 IC 50 值分别为 (26 53 ± 0 61) (18 86 ± 0 42) 和 (11 15 ± 0 26) μmol / L, 提示阿帕替尼对食管癌细胞的增殖抑制作用具有剂量时间依赖性, 表 1 为不同浓度阿帕替尼处理和 72 h 后 Kyse 150 细胞的增殖抑制率以下实验均选取 48 h 作为药物处理时间, 以其 IC 50 作为药物浓度选取标准射剂量的增加而下降, 与空白对照组相比, 阿帕替尼浓度越高, 存活分数越低按照单击多靶模型拟合 Kyse 150 细胞的存活曲线 ( 图 1), 获得 D 0 及 SF 2 等参数 ( 表 2), 放射增敏比 SER D0 = 对照组 D 0 / 实验组 D 0 随着阿帕替尼浓度的增加, 食管癌 Kyse 150 细胞的 D 0 及 SF 2 值逐渐减少, 且具有浓度依赖性阿帕替尼组与空白对照组比较,Kyse 150 细胞的 D 0 及 20 和 40 μmol / L 浓度时差异有统计学意义 ( t = , P < 0 05), 在 40 μmol / L 时 SF 2 值各组差异均有统计学意义 ( t = 12 88,P < 0 05), 在 20 μmol / L 浓度时, SER D0 SER Dq 分别为 ; 在 40 μmol / L 浓度时,SER D0 SER Dq 分别为表 1 不同浓度阿帕替尼处理后不同时间的 Kyse 150 细胞的增殖抑制率 (%, x ± s) Table 1 Cell proliferation inhibition rate of Kyse 150 cells treated with different concerntrations of apatinib at different time(%, x ± s) 药物浓度 (μmol / l) 样本数 24 h 48 h 72 h ± 1 56 a ± a ± 2 87 ac ± 1 10 a ± a ± 4 12 abc ± 2 20 a ± a ± 2 91 abc ± 1 29 a ± ab ± 9 60 abc ± 3 58 a ± a ± 2 82 ab 注 : 与同时间点 0 μmol / L 比较, a t = , P < 0 05; 与同浓度 24 h 比较, b t = , P < 0 05; 与同浓度 48 h 比较, c t = , P < 阿帕替尼联合照射对食管癌 Kyse 150 细胞存活分数的影响 : Kyse 150 细胞的存活分数随着照图 1 Kyse 150 细胞的存活曲线 Figure 1 The survival curve of Kyse 150 cells 3. 阿帕替尼联合照射组对 Kyse 150 细胞周期分布及凋亡的影响 : 流式细胞仪分析结果显示, 阿帕替尼组单纯照射组及阿帕替尼联合照射组细胞凋亡率较空白对照组增加, 差异均有统计学意义 (t = , P < 0 05) 阿帕替尼组单纯照射组及阿帕替尼联合照射组 G 2 / M 期比例分别为 (26 27 ± 3 30)% (68 79 ± 2 77)% (47 27 ± 3 59)%, 与空白对照组比较, 差异均有统计学意义 (t = , P < 0 05), 其中, 单纯照射组 G 2 / M 期细胞比例最高, 而阿帕替尼联合照射表 2 不同药物浓度时 Kyse 150 细胞的放射增敏参数及增敏比 ( x ± s) Table 2 The radiosensitization parameters and sensitization ratio of Kyse 150 cells treated with different concentrations of apatinib( x ± s) 药物浓度 (μmol / L) 样本数 D 0 D q SF 2 SER D0 SER Dq ± ± ± ± 0 1 ± ± ± ± ± ± ± 0 34 a 3 ± 0 13 a 0 84 ± ± 0 36 a 1 35 ± 0 11 a ± 0 17 a 1 38 ± 0 23 a 0 66 ± a 1 36 ± 0 27 a 2 96 ± 0 3 a 注 : 与同指标 0 μmol / L 比较, a t = ,P < 0 05

4 中华放射医学与防护杂志２０１７年１１月第７卷第１１期８０８表Ｔａｂｌｅ组别单纯照射组Ｇ２ＭＳ６０５ ± ０９１２１４ ± ２１１７７９ ± ２２２ａ６８７９ ± ２７７ａ阿帕替尼联合照射组Ｇ１阿帕替尼组不同实验组细胞周期分布比例及凋亡率ｘ ± ｓＴｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｘ ± ｓ样本数空白对照组ＣｈｉｎＪＲａｄｉｏｌＭｅｄＰｒｏｔＮｏｖｅｍｂｅｒ２０１７Ｖｏｌ７Ｎｏ１１５２２ ± ６ａ２６２７ ± ０ａ１９１５ ± ２５０ａ４７２７ ± ５９ａ２２８８ ± ２６凋亡率４９ ± ０７４４７８ ± ５０１ａ１７６５ ± １１５１５６５ ± １５４ａ８０ ± １１８ａ５９５ ± ４９５ａ１９７０ ± １６６ａ注与同周期空白对照组相比ａｔ０９１８８１１６４７８８１９６９２０６１６０６８２１２６５９９１５４７Ｐ００５图２各实验组细胞凋亡的流式细胞仪分析Ｆｉｇｕｒｅ２Ａ空白对照组Ｂ阿帕替尼组Ｃ单纯照射组Ｄ阿帕替尼联合照射组ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓＡＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐＢＡｐａｔｉｎｉｂｇｒｏｕｐＣＲａｄｉａｔｉｏｎｇｒｏｕｐＤＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＸｒａｙｓｐｌｕｓａｐａｔｉｎｉｂ组次之阿帕替尼组阿帕替尼联合照射组细胞Ｓ期比例明显增高与空白对照组比较差异有统计学意义ｔ６０６８２Ｐ００５与单纯照射组比讨论阿帕替尼是一种以ＶＥＧＦＲ２为靶点的抗血管较差异也有统计学意义ｔ８８１６２４Ｐ生成治疗靶向药物已有学者研究发现阿帕替尼异无统计学意义Ｐ００５单纯照射组与空白对肝内胆管细胞癌细胞等肿瘤细胞的增殖促进其凋００５但阿帕替尼组与阿帕替尼联合照射组比差照组相比Ｓ期比例差异无统计学意义Ｐ００５见表图２为Ｋｙｓｅ１５０细胞各组细胞凋亡图可见与空白对照组相比所有实验组ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ染色阳性并且ＰＩ染色阴性的细胞即凋亡细胞明显增加右下象限ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ和ＰＩ染色双阳性的细胞即坏死细胞也有所增加右上象限能抑制结肠癌ＨＣＴ１１６细胞白血病ＨＬ１６０细胞亡及增加化疗敏感性９１１但阿帕替尼是否对肿瘤细胞具有放射增敏作用及其相关机制的研究较少本实验主要研究阿帕替尼对食管癌细胞放射敏感性的影响并初步探讨其作用机制细胞增殖抑制曲线显示阿帕替尼能明显抑制食管癌细胞的增殖且呈剂量时间依赖性药物作用７２ｈ后抑制效应较２４和４８ｈ明显增加推测阿

5 809 帕替尼在直接杀伤细胞的同时, 也通过促进细胞凋亡进一步杀伤肿瘤细胞细胞存活曲线表明 :Kyse 150 细胞的存活分数随辐射剂量的增高呈指数性降低, 且随着阿帕替尼浓度的增加,Kyse 150 细胞的放射生物学参数 D 0 SF 2 值逐渐减小, 而放射增敏比 SER D0 逐渐增加放射增敏比越高, 说明放射敏感性越强可见阿帕替尼可通过抑制细胞亚致死损伤修复来增加 Kyse 150 细胞的放射敏感性流式细胞术结果显示, 阿帕替尼既可直接诱导食管癌细胞凋亡, 也可促进射线诱导的食管癌细胞的凋亡细胞处于不同时相其放射敏感性不同, 其中, G 2 M 期对射线最为敏感 [12] 细胞周期结果分析显示, 阿帕替尼能显著增加食管癌 Kyse 150 细胞 G 2 / M 期比例, 与 X 射线联合后 24 h,g 2 / M 期比例更高, 而 G 1 期比例显著下降, 这可能与射线损伤细胞的 DNA 双链, 诱导细胞由 G 1 期向 G 2 / M 期分化相关由此推测, 阿帕替尼诱导细胞凋亡, 导致食管癌 Kyse 150 细胞发生 G 2 / M 期阻滞, 加速 G 2 / M 期细胞死亡, 从而诱导细胞周期再分布可能是其对放疗增敏的机制之一同时, 经阿帕替尼处理过的细胞 S 期比例明显增加, 而射线对细胞 S 期比例的改变无明显影响, 表明阿帕替尼可诱导食管癌细胞发生 S 期阻滞, 此现象提示, 如果阿帕替尼联合对 S 期较为敏感的细胞周期特异性化疗药物如氟尿嘧啶等, 治疗食管癌患者, 可能效果较好, 这将为临床食管癌的治疗提供一个新思路阿帕替尼是我国自主研发的一类新药, 各期临床试验已发现其在很多晚期肿瘤如晚期胃癌结直肠癌非小细胞肺癌乳腺癌等的治疗中显现出较好的疗效 [13 15], 但阿帕替尼在细胞内的具体作用机制及其联合作用靶点还未明确本实验发现阿帕替尼能抑制食管癌 Kyse 150 细胞增殖, 与 X 射线联合能明显抑制细胞存活率, 并通过诱导其凋亡及细胞周期再分布来增加食管癌细胞的放射敏感性推测其增敏作用可能与调控凋亡相关蛋白, 如 PRAP,Caspase 3 Caspase 9 等的表达有关, 这将为进一步明确阿帕替尼作为放疗增敏剂治疗食管癌的具体机制提供新的思路, 也为临床食管癌的综合治疗提供理论依据及新的策略利益冲突本研究还接受常州市科技支撑社会发展项目 (CE ) 常州市高层次卫生人才项目(2016C2BJ007) 常州市科技局应用基础研究项目 ( CJ ) 的资助全体作者无利益冲突, 排名无争议, 未因进行该研究而接受任何不正当的职务和财务利益作者贡献声明孙菲为实验和论文撰写主要完成者 ; 孙志强汪建林负责研究过程指导 ; 王坚负责数据统计指导 ; 胡莉钧提出修改意见 ; 周梦耘封悦孔泽华秋协助实验完成 ; 于静萍参与研究的酝酿和设计实验, 提出修改意见参考文献 [1] Napier KJ, Scheerer M, Misra S. Esophageal cancer: a review of epidemiology, pathogenesis, staging workup and treatment modalities[ J]. World J Gastrointest Oncol, 2014, 6 (5): DOI: / wjgo. v6. i [2] 于静萍, 孙志强, 倪新初, 等. 沙利度胺联合照射对人食管癌裸鼠移植瘤生长和肿瘤血管生成的影响 [ J]. 中华放射医学与防护杂志, 2013, 33 (6 ): DOI: / cma. j. issn Yu JP, Sun ZQ, Ni XC, et al. The growth and angiogenesis inhibition effects of thalidomide combined with radiation on the human esophageal carcinoma transplanted nude mice[ J]. Chin J Radiol Med Prot, 2013, 33(6): DOI: / cma. j. issn [3] 于静萍, 孙志强, 倪新初, 等. 沙利度胺联合放疗治疗食管癌的临床观察 [ J]. 中华放射医学与防护杂志, 2012, 32 (4): DOI: / cma. j. issn Yu JP, Sun ZQ, Ni XC, et al. Clinical effect observation of VEGF expression interfered by Thalidomide combined with radiotherapy in esophageal cancer treatment [ J]. Chin J Radiol Med Prot, 2012, 32(4): DOI: / cma. j. issn [4] 于静萍, 孙苏平, 孙志强, 等. 沙利度胺对食管癌 TE1 细胞 DNA 合成抑制作用和辐射敏感性的影响 [ J]. 中华放射医学与防护杂志, 2010, 30 (3 ): DOI: / cma. j. issn Yu JP, Sun SP, Sun ZQ, et al. Inhibition of DNA synthesis and radiosensization effects of thalidomide on esophageal carcinoma TE1 cells[ J]. Chin J Radiol Med Prot, 2010, 30(3): DOI: / cma. j. issn [5] 孙志强, 于静萍, 张志明, 等. 重组人血管内皮抑素对食管癌细胞的放射增敏作用及其机制 [ J]. 中华放射医学与防护杂志, 2013, 33 ( 4 ): DOI: / cma. j. issn Sun ZQ, Yu JP, Zhang ZM, et al. Effect of recombinant human endostatin on the radiosensitivity of esophageal carcinoma cells and underlying mechanism[ J]. Chin J Radiol Med Prot, 2013, 33 (4): DOI: / cma. j. issn [6] Zhao L, He LR, Xi M, et al. Nimotuzumab promotes radiosensitivity of EGFR overexpression esophageal squamous cell carcinoma cells by upregulating IGFBP 3 [ J]. J Transl Med, 2012, 10(1): 1 9. DOI: / [7] Tian S, Quan H, Xie C, et al. YN968D1 is a novel and selective ( 下转第 831 页 )

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