<4D F736F F F696E74202D D4ADBACBC9FACEEFB5C4BBF9D2F2B1EDB4EFD3EBB5F7BFD820A3A8B6FEA3A92E >

Size: px

Start display at page:

Download "<4D F736F F F696E74202D D4ADBACBC9FACEEFB5C4BBF9D2F2B1EDB4EFD3EBB5F7BFD820A3A8B6FEA3A92E >"

湫深康
5 years ago
Views:

1 分子生物学第七章基因的表达与调控 ( 上 ) 原核基因表达调控模式第二节乳糖操纵子与负控诱导系统夏玉琼 12/14/2017 西安电子科技大学生命科学技术学院

2 操纵子学说关于原核生物基因结构及其表达调控的学说法国巴斯德研究所著名科学家 Jacob 和 Monod 在 1961 年首先提出 10 年内经许多科学家的补充和修正 2

3 目录乳糖操纵子的结构负控诱导系统的实验证据操纵子模型的主要内容操纵子模型的其它问题 3

4 大肠杆菌乳糖操纵子的结构调节基因阻遏子 I 启动区 promoter 将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖结构基因启动子 P 控制子 O Z Y A 必需操纵区 operator 转录方向和范围 β- 半乳糖苷透过酶 β- 半乳糖苷酶 β- 半乳糖苷乙酰基转移酶使乳糖进入细胞内西安电子科技大学 4 使乳糖形成乙酰半乳糖生命科学技术学院

5 半乳糖苷酶的作用半乳糖苷酶乳糖 5 半乳糖葡萄糖西安电子科技大学生命科学技术学院

6 目录乳糖操纵子的结构负控诱导系统的实验证据操纵子模型的主要内容操纵子模型的其它问题 6

7 lac 体系受调控的证据不含乳糖及 β- 半乳糖苷的培养基 lac + 基因型大肠杆菌细胞内,β- 半乳糖苷酶和透过酶的浓度低,1-2 个分子 / 细胞无葡萄糖的培养基中, 加入乳糖酶,10 5 个分子 / 细胞西安电子科技大学 7 生命科学技术学院

8 酶的诱导 lac 体系受调控的证据 mrna 或酶的量 1 min 在无葡萄糖培养基中加入乳糖 lac mrna 去掉乳糖 β- 半乳糖苷酶透过酶时间 /min 西安电子科技大学 8 32 P 标记的 mrna 与模板 DNA 杂交来检测蛋白质半衰期长而较为稳定生命科学技术学院

9 乳糖诱导生成酶的实验设计乳糖用含硫的乳糖类似物代替乳糖进行实验安慰性诱导物, 不是半乳糖苷酶的底物, 但能诱导酶合成西安电子科技大学 IPTG 异丙基巯基半乳糖苷生命科学技术学院 TMG 巯甲基半乳糖苷 9 显色底物 ONPG O- 硝基半乳糖苷

10 IPTG 能模拟乳糖的作用 IPTG 不存在, 阻遏蛋白结合乳糖操纵子 35%, 酶不合成 IPTG 存在, 阻遏蛋白不结合乳糖操纵子, 诱导酶合成西安电子科技大学生命科学技术学院 10

11 乳糖诱导生成酶的实验设计证实诱导物的作用是诱导新酶合成, 不是已存在的酶前体转化成有活性的酶同位素示踪实验大肠杆菌放在 35 S 标记的氨基酸但没有任何半乳糖苷诱导物的培养基中繁殖几代, 保证已有的酶都是放射性的这些细菌转移到无放射性的, 有半乳糖苷诱导物的培养基中, 新合成的酶都无放射性分离纯化 β- 半乳糖苷酶, 无放射性, 证明是新合成的 11

12 目录乳糖操纵子的结构负控诱导系统的实验证据操纵子模型的主要内容操纵子模型的其它问题 12

13 操纵子模型的主要内容 Z Y A 基因的产物由同一条多顺反子的 mrna 分子编码该 mrna 的启动区 P 位于 I 和 O 之间, 不能单独起始酶的表达操纵区 O 是 DNA 上的一小段序列 (26bp), 是阻遏物的结合位点阻遏物与操纵区结合,lac mrna 的转录起始被抑制诱导物通过与阻遏物结合, 改变其三维构象, 使之不能与操纵区结合, 从而激发 lac mrna 的合成 13

14 多顺反子和单顺反子多顺反子 : 见于原核生物, 意指一个 mrna 分子编码多个多肽链这些多肽链对应的 DNA 片断则位于同一转录单位内, 享用同一对起点和终点单顺反子 (monocistron): 真核基因转录产物为单顺反子, 即一条 mrna 模板只含有一个翻译起始点和一个终止点, 因而一个基因编码一条多肽链或 RNA 链, 每个基因转录有各自的调节元件西安电子科技大学生命科学技术学院 14

15 多顺反子和单顺反子西安电子科技大学生命科学技术学院 15

16 乳糖操纵子模型示意图一没有乳糖时 RNA 聚合酶操纵区 laci O lacz lacy laca P 阻遏蛋白西安电子科技大学活性阻遏蛋白四聚体生命科学技术学院 16

17 乳糖操纵子模型示意图二有乳糖时 RNA 聚合酶 laci lacz lacy laca P 乳糖和阻遏物结合形成非活性阻遏蛋白 O β- 半乳糖苷透过酶 β- 半乳糖苷酶 β- 半乳糖苷乙酰基转移酶 17 负控诱导系统西安电子科技大学生命科学技术学院

18 操纵子模型的具体内容 lac 操纵子的本底表达大肠杆菌对乳糖的反应阻遏物 laci 基因产物及功能葡萄糖对 lac 操纵子的影响 camp 与代谢物激活蛋白 18

19 lac 操纵子的本底水平表达乳糖进入细胞依赖于透过酶第一个诱导物 ( 乳糖 ) 是如何达到细胞的? 细胞内原本有少量透过酶真正的诱导物异构乳糖的形成依赖 β- 半乳糖苷酶异构乳糖一开始是怎么形成的? 细胞内原本有少量半乳糖苷酶 19

20 20 乳糖异构化成异构乳糖

21 大肠杆菌对乳糖的反应 ( 考虑本底水平 ) 诱导后水平本底水平本底水平加诱导物 lac mrna 水平滞后滞后去掉诱导物 β- 半乳糖苷酶活性 21 本底水平合成乳糖存在下的负控诱导过程西安电子科技大学乳糖撤去后的恢复生命科学技术学院

22 大肠杆菌对乳糖的反应 ( 考虑本底水平 ) 本底水平表达每个细胞内有几个分子的 β- 半乳糖苷酶和透过酶乳糖存在下的负控诱导合成单个透过酶使少量乳糖进入细胞内单个半乳糖酶将乳糖催化成异构乳糖异构乳糖结合阻遏物, 使之失活,lac mrna 开始合成 mrna 编码大量的 β- 半乳糖苷酶和透过酶, 大量乳糖涌入细胞乳糖撤去的恢复乳糖撤去, 已有的乳糖被消耗完毕, 阻遏物仍在不断合成活性的阻遏物浓度超过异构乳糖的浓度 lac mrna 合成被抑制 22

23 阻遏子 lac I 基因产物及阻遏物 lac 操纵子阻遏物 mrna 在弱启动子控制下组成型合成 23

24 阻遏子 lac I 基因产物及阻遏物阻遏蛋白有四个相同亚基, 每个亚基含有 347 个氨基酸残基, 每个亚基能与一分子 IPTG( 乳糖类似物 ) 结合 I - 突变株细胞提取中缺少阻遏物, 证明阻遏物是蛋白质若 lac I 基因由弱启动子突变成强启动子, 细胞内不可能产生足够的诱导物克服阻遏状态,lac 操纵子变得不可诱导 24

25 阻遏基因 I 的功能部分二倍体的大肠杆菌一个野生型乳糖操纵子一个阻遏基因突变的乳糖操纵子没有乳糖存在时, 不产生相应酶西安电子科技大学生命科学技术学院 25

26 葡萄糖对 lac 操纵子的影响如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中, 大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发 lac 操纵子葡萄糖对 lac 操纵子表达的抑制是间接的一些突变的大肠杆菌在葡萄糖存在时,lac mrna 也可被诱导合成 : 该类大肠杆菌在糖酵解途径中不能将 6- 磷酸葡萄糖转化为下一步代谢中间物葡萄糖的某些降解产物抑制了 lac mrna 的合成, 26 因此葡萄糖效应称为代谢物阻遏效应

27 camp 与代谢物激活蛋白 camp 环腺苷酸广泛存在动植物组织中在腺苷酸环化酶的作用下由 ATP 转变而来在真核生物激素调节中起重要作用大肠杆菌中, 受到葡萄糖代谢的调节 27

28 camp 与代谢物激活蛋白葡萄糖对 camp 的调节缺乏碳源的培养基中培养细菌,cAMP 浓度高含葡萄糖的培养基中培养细菌,cAMP 浓度低只有甘油或乳糖等不进行糖酵解的碳源, camp 的浓度高推测糖酵解途径中的某些代谢产物抑制了腺苷酸环化酶的活性 28

29 camp 与代谢物激活蛋白代谢物激活蛋白 CAP 又称环腺苷酸受体蛋白 CRP, 由 Crp 基因编码 CAP 和 camp 都是合成 lac mrna 必需的 E.g. Crp 及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成 lac mrna 29

30 camp 与代谢物激活蛋白 CRP 蛋白形成二聚体 camp 装配到 CRP 二聚体上, 形成 camp- CRP 复合物复合物结合到 lac 操纵子的 CAP 位点上 CAP 位点在转录起始位点上游 60bp 处, 紧邻启动子区 RNA 聚合酶也可以结合 CAP 位点, 复合物能帮助 RNA 聚合酶结合到启动子区 30

31 31 camp 与代谢物激活蛋白

32 camp-crp 的正调控体系 camp 与 CRP 形成复合物,cAMP 或 CRP 突变的细胞株均不能合成 lac mrna camp-crp 复合物是独立的不同于阻遏物的正调控因子 32

33 gal lac ara camp-crp 还调控其它体系 CRP 结合位点 CRP 结合位点启动子区转录起点葡萄糖存在下, 这些操纵子都不表达, 都是降解物敏感型操纵子西安电子科技大学生命科学技术学院 33

34 camp-crp 与启动子结合的开放结构 camp-crp 复合物与启动子的结合是 lac mrna 合成起始所必需的复合物结合于启动子上游, 使 DNA 弯曲形成稳定的开放型启动子 - 聚合酶结构阻遏物阻止形成开放结构, 抑制 RNA 聚合酶的功能 34

35 lac 操纵子 DNA 的调控区域 :P O 区 P 区 ( 启动子区 ) 一般是从 I 基因结束到 mrna 转录起始位点下游 5-10 bp O 区位于 -7~+28 bp, 对称轴 +11 bp lac 启动子区 (P) +1 转录起点阻遏物结合区 (O) 西安电子科技大学生命科学技术学院 35

36 其它操纵子的 P 区和 O 区 gal aroh 36 阻遏物与 O 区的结合影响了 RNA 聚合酶与启动区结合形成转录 trp 起始复合物的效率 trpr lac 启动子区启动子区 (P) +1 转录起点西安电子科技大学启动子区阻遏物结合区 (O) 生命科学技术学院

37 控制子 O 的功能部分二倍体大肠杆菌一个野生型乳糖操纵子一个控制子突变的乳糖操纵子没有乳糖存在时, 不产生相应酶西安电子科技大学没有乳糖存在时, 产生相应酶生命科学技术学院 37 控制子突变只影响同一条链上的操纵子, 为顺式突变 O c

38 目录乳糖操纵子的结构负控诱导系统的实验证据操纵子模型的主要内容操纵子模型的其它问题 38

39 Lac 操纵子的其它问题 laca 基因及其生理功能 lac 基因产物数量上的比较操纵子的融合与基因工程 39

40 laca 基因及其生理功能 A 基因的功能 ( 善后 ) A 基因编码半乳糖苷乙酰基转移酶转移酶把乙酰基从供体上转移到半乳糖苷分子上自然界中存在的半乳糖苷分子的分解产物不能被进一步代谢, 在体内积累, 有害实验表明 I - O c A - 大肠杆菌的生长慢于相应的 A + 株系功能 :A 基因产物抑制 β- 半乳糖苷酶产物的有害衍生物在体内积累 40

41 lac 基因产物数量上的比较半乳糖苷酶 / 透过酶 / 转移酶 = 1/0.5/0.2 反映了以 β- 半乳糖苷为唯一碳源时细胞的需要翻译水平上受到调节 41

42 lac 基因产物数量上的比较两种调节方式 lac mrna 可能与核糖体脱离, 从而终止翻译, 因此存在从 mrna 的 5 端到 3 端的蛋白质合成梯度大多数多顺反子 mrna 都有该现象 A 基因比 Z 基因容易受内切酶进攻发生降解 42

43 操纵子的融合与基因工程操纵子在自然条件下可能发生融合 lac 操纵子和 pur 操纵子 ( 负责嘌呤合成 ) 的偶联 5 3 Lac: I P O Z Y A tsx 基因 pur 操纵子突变 Lac: I P O Z Y pur 操纵子西安电子科技大学基因工程 :lac 启动子是强启动子, 融合后增加其它蛋白质的合成量生命科学技术学院 43

44 小结乳糖操纵子的结构负控诱导系统的过程操纵子模型的具体内容本底水平的表达代谢物阻遏效应 camp-crp 复合物的作用 44

45 作业十五画出乳糖操纵子的结构示意图在不含葡萄糖和乳糖的培养基中, 下列两种突变型大肠杆菌是否可以表达出半乳糖苷酶 :I - 大肠杆菌和 O c 大肠杆菌, 并说明理由 45

<4D F736F F F696E74202D D4ADBACBC9FACEEFB5C4BBF9D2F2B1EDB4EFD3EBB5F7BFD820A3A8CBC4A3A9>

<4D F736F F F696E74202D D4ADBACBC9FACEEFB5C4BBF9D2F2B1EDB4EFD3EBB5F7BFD820A3A8CBC4A3A9> 分子生物学第七章基因的表达与调控 ( 上 ) 原核基因表达调控模式夏玉琼 2013-10-31 2 目录半乳糖操纵子阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白 LexA 的降解与细菌中的 SOS 应答二组分调控系统和信息传导多启动子调控的操纵子 3 半乳糖操纵子概述控制不同营养条件下是否利用半乳糖通常情况下, 不利用半乳糖, 半乳糖操纵子的结构基因不表达半乳糖多, 无葡萄糖时, 半乳糖操纵子的结构基因表达,