1088 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 每年都有不同程度的养殖病害发生 除本身的种质 退化 生理性不适 环境等因素外, 病原菌感染也是引起紫菜病害的重要原因 例如坛紫菜叶状体细菌性 [3 - 红烂病由海科贝特菌

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1 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 53(10) : ; 4 October 2013 ISSN ; CN / Q http: / / journals. im. ac. cn / actamicrocn Research Paper 研究报告 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性 沈梅丽, 杨锐 *, 骆其君, 王淑刚, 任继锐 宁波大学海洋学院, 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波大学海洋生物工程重点实验室, 宁波 摘要 : 目的 坛紫菜是我国江浙海区栽培地主要经济藻类 观察紫菜养殖过程中藻际微生物的群落特点及变化, 研究藻际环境中的微生物因素在紫菜栽培中的作用, 为保证紫菜健康生长及病害防治提供理论与实验基础 方法 采用传统纯培方法和 PCR-DGGE 技术分离归类坛紫菜养殖周期中的藻际微生物, 并利用 16S rdna ( 细菌 ) 和 18S rdna ( 真菌 ) 序列测定及在线 BLAST 比对鉴定到属, 比较分析不同生长阶段 不同养殖海区及养殖过程的坛紫菜藻际微生物的多样性特点 结果 在坛紫菜养殖过程中总共分离到 467 株细菌, 共 41 个属 分类结果显示藻际细菌归属于变形菌门 ( Alphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria) 放线菌门 ( Actinobacteria) 厚壁菌门 ( Firmicutes) 和拟杆菌门 ( Bacteroidetes), 优势菌群为 α- 变形菌纲和 γ- 变形菌纲 分离到 55 株真菌, 共 15 个属 分类结果显示绝大多数真菌归属于子囊菌门 ( Ascomycota), 仅 1 株归属于担子菌门 ( Basidiomycota) 伞菌纲 ( Agaricomycetes) 细菌多样性大于真菌 坛紫菜藻际细菌有 19 个特异菌属, 对照海水细菌有 13 个特异菌属 ; 从丝状体中分离到大部分真菌和放线菌, 坛紫菜养殖丝状体和不同叶状体养殖阶段的藻际微生物类别差异明显 在分离的坛紫菜藻际微生物中发现了与引起细菌性红烂病的海科贝特菌 ( Cobetia marina) 引起白斑病的紫菜茎点菌 ( Phoma porphyrae) 高度相似的菌株, 以及与典型的腐霉如镰孢霉菌 ( Fusarium sp. ) 和曲霉 ( Aspergillus sp. ) 高度相似的菌株 结论 坛紫菜养殖过程中藻际微生物的多样性受到紫菜生长形态 养殖时间及养殖环境等因素的影响 在藻际微生物中发现与紫菜致病菌高度相似的微生物, 作为潜在致病微生物应得到重视 关键词 : 坛紫菜, 细菌, 真菌, 多样性, 养殖周期中图分类号 :X172 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) 坛紫菜 ( Pyropia haitanensis) [1] 是中国浙江和福建海区的地方种, 也是该地区主要的紫菜栽培品种, 每年创造数 10 亿产值 坛紫菜养殖周期分为海区养殖 ( 叶状体阶段 ) 和苗场育苗 ( 丝状体阶段 ) 两大阶段 坛紫菜采用分期采割, 叶长 15 cm - 20 cm 即可采收 1 次, 从秋后开始可持续到翌年 3-5 月, 其中初 期从 9 月中旬到 11 月下旬, 中期从 12 月上旬到翌年 2 月下旬, 后期从 3 月上旬到 4 月上旬 采苗季节在 4 月初, 进行采果孢子或者接种自由丝状体, 然后平育或吊育, 直到 9 月初再采壳孢子苗到网帘并下海培育 [2] 随着紫菜人工养殖面积的不断增加, 养殖环境的恶化, 养殖管理的人为疏漏及养殖密度不断增加, 基金项目 : 国家公益性行业 ( 海洋 ) 科研专项经费项目 ( , ) ; 国家公益性行业 ( 农业 ) 科研专项经费项目 ( ) ; 浙江省自然科学基金 ( LY12D06003) ; 宁波市自然科学基金 (2012A610140) * 通信作者 Tel: ; Fax: ; yangrui@ nbu. edu. cn 作者简介 : 沈梅丽 ( ), 女, 浙江绍兴人, 硕士研究生, 主要从事藻际微生物研究 layaritsuka@ 163. com 收稿日期 : ; 修回日期 :

2 1088 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 每年都有不同程度的养殖病害发生 除本身的种质 退化 生理性不适 环境等因素外, 病原菌感染也是引起紫菜病害的重要原因 例如坛紫菜叶状体细菌性 [3 - 红烂病由海科贝特菌 (Cobetia marina) 引起 4] ; 紫菜叶状体绿斑病的致病菌多数为假单胞菌属 (Pseudomonas) [5-6], 其中条斑紫菜的主要病原菌为 柠檬假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas citrea) [7] ; 紫菜叶状体赤腐病主要由紫菜腐霉菌 (Pythium porphyrae) 引起 [8] ; 紫菜叶状体壶疫病由拟油壶菌属 ( Olpidiopsis [9 - spp. ) 引起 10] ; 条斑紫菜丝状体黄斑病的致病菌可能为河豚毒素交替假单胞菌 ( Pseudoalteromonas tetraodonis) [11] ; 条斑紫菜丝状体白斑病可能由紫菜茎 点菌 (Phoma porphyrae) 引起 [12] 1972 年 Bell 和 Mitchell [13] 提出了 藻际微环 境 这一概念, 为揭示藻类健康生长提供了新的视点 藻类不断向周围环境释放氨基酸及其他代谢产物, 为 共生 共栖或寄生的藻际微生物提供营养, 并进行筛 [14 - 选 15] ; 同时藻际微生物也为藻类提供生长调节因 子或营养素 [16] 藻类和微生物相互选择 相互依存 甚至相互拮抗, 处于动态平衡之中, 各取所需, 协同发展 ; 一旦环境变化或物种入侵导致正常的藻菌相互体 系受到破坏, 微生物群落失衡, 则有可能造成藻类病 [17] 害 陈国耀等连续 2 年对条斑紫菜叶状体附生菌及病原菌做了研究, 发现黄色和橘红色菌落占优势, 健康养殖紫菜和周围海水的细菌数量保持稳定, 而病 [18] 烂紫菜上有较多的降解琼脂细菌 杨锐等研究了 4 地条斑紫菜叶状体和丝状体的细菌遗传多样性, 发 现在健康样品中存在的假交替单孢菌并未从病烂样 品中分离到, 提示假交替单孢菌可能与紫菜健康生长有密切关系 通过观察紫菜养殖过程中藻际微生物的群落特点及变化, 或追踪潜在的致病菌, 可能为紫 菜健康栽培及病害防治提供有力的微生态依据 本文在坛紫菜养殖的 2 个阶段 4 个时间点采样, 研究坛紫菜养殖过程中的藻际微生物多样性, 有助于了解坛紫菜养殖过程中的微生物组成变化, 为优化紫菜养殖环境和预测防治紫菜病害提供理论依据, 并为后续藻菌互作研究提供关键菌株 1 材料和方法 1. 1 主要试剂和仪器 Zobell 2216E 海水培养基 ( 酵母粉 1 g, 蛋白胨 5 g, 柠檬酸铁 0. 1 g, 琼脂 g, 陈海水定容至 1000 ml,ph ), 马铃薯海水 ( PDA) 培养基 ( 马铃薯 200 g, 蔗糖 20 g, 琼脂 g, 陈海水定容至 1000 ml,ph 自然 ),PCR 反应试剂 ( TaKaRa), 变性梯度凝胶电泳及银染试剂 ( 上海捷瑞生物工程有限公司 ),Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒 ( 生工生物工程上海有限公司 ),Biospin 真菌基因组 DNA 抽提试剂盒 ( 杭州博日科技有限公司 ), 显微镜 ( Olympus),PCR 扩增仪 ( Eppendoff), 电泳仪及紫外凝胶成像系统 ( BIO-RAD), 变性梯度凝胶电泳系统 ( BIO-RAD) 等 1. 2 采样与微生物的分离纯化 采样 : 本实验室从浙江温州紫菜养殖区采集了健康坛紫菜 ( P. haitanensis ) 丝状体阶段 ( 和 ) 和叶状体阶段 ( 和 ) 共 4 个时段的贝壳丝状体 紫菜叶状体及其环境海水样品, 测定海区温度 盐度和 ph 值 ( 表 1), 现场处理得到海水样品 ( SW) 贝壳研磨滤液 ( C) 紫菜振荡悬液 ( S) 和紫菜研磨悬液 ( G), 方法参考文献 [18] 表 1. 采样时间地点 环境因子和分离微生物数 Table 1. Sampling time,location,environmental factors and isolates number Sampling Environmental factors Bacterial isolates Fungal isolates Time Location No. Temperature / ph Salinity / number number Cangnan,Wenzhou( 温州苍南 ) Cangnan,Wenzhou( 温州苍南 ) Pingyang,Wenzhou( 温州平阳 ) Pingyang,Wenzhou( 温州平阳 ) Total 分离微生物将上述 4 种悬液分别涂布于 Zobell 2216E 海水培养基和马铃薯海水 ( PDA) 培养 基 30 倒置培养 细菌培养 2-3 d, 真菌培养 5-7 d, 按菌落形态特征挑取不同单菌落, 分区划线

3 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 次进行分离纯化, 革兰氏染色并显微镜镜检后接种于相应斜面培养基 4 保存和部分细菌甘油管 (10% - 20% ) - 20 保种 分离到的菌株统一编号,B 代表细菌,F 代表真菌,W 1-4 代表温州代表采样的时间顺序,Ph 代表来自于坛紫菜, 如 BW1SW1 表示分离自第 1 次温州采样的海水细菌,FW2PhS1 表示分离自第 2 次温州采样的坛紫菜振荡处理真菌 1. 3 细菌 16S rdna 和真菌 18S rdna 基因序列分析 基因组 DNA 的抽提 : 取 30 培养 h 的细菌 1-3 ml, 用 Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒提取基因组 DNA 取 30 培养 2-3 d 的真菌 ( 出现菌丝球 )1-3 ml, 充分研磨后用 Biospin 真菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取基因组 DNA 取 5 μl DNA 样品进行 1% 含溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳 (100 V,40 min), 在紫外凝胶成像系统下拍照检测 提取的基因组 DNA 保存于 - 20 备用 PCR- 变性梯度凝胶电泳 ( PCR-DGGE) 分析 :PCR 反应条件 :95 8 min;95 30 s,58 45 s, 72 2 min,35 个循环 ;72 10 min 取 5μL PCR 产物进行 1% 含溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳 (100 V,40 min), 在紫外凝胶成像系统下拍照检测并保存于 - 20 备用 采用细菌通用引物 GC + 338F 和 518R( 表 2) [19] 和真菌通用引物 GC + FR1 和 FF390 ( 表 2) [20] 分别对 16S rdna 的 V3 区和 18S rdna 可变区进行扩增, 用于变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 分析 变性梯度凝胶电泳采用 8% 聚丙烯酰胺凝胶, 变性剂尿素和甲酰胺的变性梯度为 40% - 55% [21] 点样量为 8 μl PCR 产物和 8 μl 2 上样缓冲液, 电压 180 V, 温度 55, 电泳 6 h 后银染拍照比对条带 表 2. 引物序列 Table 2. Primer sequences of Polymerase Chain Reaction ( PCR) Target sequence Sequence length / bp Primer sequences (5' 3') GC-Clamp + 338F:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGCGGGGCACGGGGGGCCTA Variable region of 16S rdna About 180 CGGGAGGCAGCAG 518R: ATTACCGCGGCTGCTGG 16S rdna About F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA GC-Clamp + FR1:CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGAICCATT Variable region of 18S rdna About 400 CAATCGGTAIT FF390: CGATAACGAACGAGACCT 18S rdna About1800 GeoA2: CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC Geo11: ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC 基因序列测定及同源性分析 : 采用细菌通用引物 27F 和 1492R ( 表 2 ) [22] 和真菌通用引物 GeoA2 和 Geo11( 表 2) [23] 分别对 16S rdna 和 18S rdna 进行扩增,PCR 产物直接移交上海英俊生物技术有限公司进行测序 PCR 反应体系和条件同 , 送测体积为 50 μl 得到的序列通过 National Center for Biotechnology Information( NCBI) 的 GenBank 数据库进行在线 BLAST 相似性比对, 得到相似度最高的序列, 鉴定到属水平 通过 Cluster W 和 MEGA 4 软件构建系统发育树 细菌序列登录号为 KC KC012879,KC KC012886, KC01288-KC012898, KC KC012906,KC KC012909, 真菌序列登录号为 JX JX 结果 2. 1 分离纯化与菌落形态坛紫菜养殖过程中总共分离纯化得到细菌 467 株, 真菌 55 株, 真菌少于细菌 根据菌落特征和菌体形态将细菌归类为 100 个表型, 淡乳黄短杆状为优势形态细菌类群 其中 B1-B5(5 类, 表 3) 在 4 次的采样分离细菌中都有存在, 占总分离细菌的 % ;B6-B18(13 类, 表 4) 在 3 次的采样分离细菌中有存在, 占 % ;B19-B36(18 类 ) 在 2 次的采样分离细菌中有存在, 占 % ; 剩余的 B37- B100 都只在 1 次的采样分离细菌中有存在, 占 % 真菌形态归类为 23 个表型, 除 F1-F5 ( 5

4 1090 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 类, 表 4) 在 2 次采样分离真菌中有存在, 占总分离 真菌的 % ; 其余 F6-F23 类都只在 1 次的采样 分离真菌中存在, 占 % 除了普遍存在的形 态类群外, 各个时期都有独特的形态类群, 直观地反 映了坛紫菜藻际微生物在不同养殖时期的群落动态变化 表 3. 细菌优势形态类群 Table 3. Dominant populations based on bacterial morphology Bacterial Cell Colony Colony Colony Colony Isolates morphological Colony color Colony edge Colony surface shape shape size moisture transparency number No. B1 Short rod Pale yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 34 B2 Rod Pale yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 29 B3 Rod milky-white Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 15 B4 Short rod Pale yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 18 B5 Rod Pale yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 17 B6 Short rod Pale yellow Round Small dry Complete Salient,smooth Opaque 6 B7 Rod Pale yellow Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 7 B8 Short rod Pale yellow fraction Round Large Moist Complete Flat,smooth Opaque 7 B9 coccus Pale yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 13 B10 Short rod Pink Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 5 B11 Rod Orange Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 6 B12 Short rod milky-white Irregular Large Few wet Incomplete Eminence,smooth Opaque 4 B13 Short yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Opaque 14 B14 Short rod Pale yellow Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 13 B15 Short rod Pink Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 8 B16 Short rod Orange Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 14 B17 Rod Orange Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 36 B18 Rod yellow fraction Round Small Moist Complete Salient,smooth Transparent 9 B B37-B Total 467 表 4. 真菌优势形态类群 Table 4. Dominant populations based on fungal morphology Fungal morphological Hypha Growth Isolates Front color Back color Surface Pigment No. height density number F1 green,white edge Yellow Short Thick Powder No 3 F2 Dark green,white edge Dark green,white edge Short Thick Down,verrucous No 6 F3 White Yellow,white edge Short Thick Down No 4 F4 Orange Orange Short Thick Down,radial No 5 F5 Orange Orange Short Thick Down,radial No 2 F6-F23 35 Total 变性梯度凝胶电泳分析细菌 16S rdna 的 V3 区和真菌 18S rdna 可变区 PCR 产物用于变性梯度凝胶电泳, 银染后得到清晰条带进行比对分析 ( 图 1 为细菌 DGGE 银染典型条带, 图 2 为真菌 DGGE 银染典型条带 ) 理论上 DGGE 可分辨 1 个碱基差异的条带, 本实验将拥有相同条带的菌株暂归为同一型 [24] 细菌分型数按采样先后依次为 和 18, 真菌分型数为 20, 结合测序结果最终确定微生物的种属

5 沈梅丽等: 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性 / 微生物学报(2013)53(10) 1091 图 1 细菌 16S rdna DGGE 典型图 Figure 1 Tipical denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE) fingerprint of bacterial 16 S rdna Lane 1 BW1PhC10 ; lane 2 BW2 PhC21; lane 3 BW2PhC9 ; lane 4 BW2 SW44 ; lane 5 BW1 PhC24-1 ; lane 6 BW1 PhC24-3 ; lane 7 BW2 SW30; lane 8 BW2 SW45 ; lane 9 BW1 SW6 ; lane 10 BW1SW39-4 no band; lane 11 BW2SW10 ; lane 12 BW1PhC46-1 ; lane 13 BW1SW28-1 ; lane 14 BW1SW28-2 ; lane 15 BW2 PhC43 ; lane 16 BW1SW21 ; lane 17 BW1SW20 ; lane 18 BW1 SW38-1 图 2 真菌 18S rdna DGGE 典型图 Figure 2 Tipical denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE) fingerprint of fungal 18S rdna Lane 1 FW3 PhS1 ; lane 2 FW4SW1 ; lane 3 FW1 PhC4-1 ; lane 4 FW2SW3 ; lane 5 FW2SW2 ; lane 6 FW4 PhS1 ; lane 7 BFW3 PhG2 ; lane 8 FW3PhG3; lane 9 FW3 SW1; lane 10 FW3PhG1 ; lane 11 FW2SW1 ; lane 12 FW1 PhC5-1 ; lane 13 FW1PhC5-2 ; lane 14 FW2SW9 ; lane 15 FW2PhG1 ; lane 16 FW1SW4 ; lane 17 FW1 SW1 ; lane 18 FW1SW 微生物的分子鉴定及群落特征 差异进行比较 发 现 ( 1 ) 芽 胞 杆 菌 属 ( Bacillus) 和 副 综合 DGGE 分析和测序比对 结 果 总 共 得 到 99 球菌属( Paracoccus) 普 遍 存 在 于 坛 紫 菜 养 殖 的 各 个 株基因型不同的细菌 分 属 41 个 属 ( 表 5 ) 20 株 基 阶段中; 和 的 2 个 时 期 都 分 离 到 冷 因型不同的真菌 分属 15 个属( 表 6) 从 丝状 体分 杆菌属( Psychrobacter) 节杆 菌 属 ( Arthrobacter) 和 喜 离到的细菌 Cobetia spp 与 前 文 提 到 的 坛 紫 菜 叶 状 盐芽胞杆菌 属 ( Halobacillus) 这 可 能 与 当 时 初 春 海 体红烂病致病菌归属 相 同 真 菌 Phoma spp 与 条 斑 水温度较低有关 (2) 坛 紫 菜 共 附 生 细 菌 和 对 照 海 紫菜丝状体白斑病致病菌归属相同 对细菌的分布 水细菌存在明显差异:坛紫菜 共 附 生 细 菌 分 布 于 28

6 1092 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 个属, 多于海水细菌分布的 20 个属 Sulfitobacter Phaeobacter Roseivivax Loktanella 副球菌属 ( Paracoccus ) 赤杆菌属 ( Erythrobacter ) Ahrensia Robiginitomaculum Sphingopyxis 芽单胞菌属 ( Blastomonas) 寡养单胞菌属 ( Stenotrophomonas) 溶杆菌属 ( Lysobacter) Rheinheimera Cobetia 考克氏菌属 ( Kocuria ) Oceanobacillus Maribacter Vitellibacter 和 Gelidibacter 共 19 个属的细菌是坛紫菜特有的共附生菌群, 未从对照海水中分离到 小红卵菌属 ( Rhodovulum ) 假红杆菌属 ( Pseudorhodobacter ) 海细菌属 ( Marinobacterium ) Reinekea Alishewanella 科尔韦尔氏菌属 ( Colwellia) Idiomarina 戈登氏菌属 ( Gordonia ) 微小杆菌属 ( Exiguobacterium ) 动球菌属 ( Planococcus ) Pontibacter Zobellia 和 Salinimicrobium 共 13 个属的细菌仅在对照海水中里分离到 在坛紫菜上和对照海水中都有分布的只有 10 个属的细菌 坛紫菜藻际微环境含有丰富化合物, 相比之下海水属于寡营养环境, 流动性较大, 不同的生长环境很可能导致两者细菌组成的差异 (3) 坛紫菜不同养殖时期的细菌存在差异 : 只在丝状体育苗时期分离到的细菌有 Sphingopyxis 假红杆菌属 ( Pseudorhodobacter) 寡养单胞菌属 ( Stenotrophomonas) Rheinheimera 科尔韦尔氏菌属 ( Colwellia) Idiomarina Cobetia 产丝菌属 ( Myceligenerans ) Salinibacterium 戈登氏菌属 ( Gordonia) 考克氏菌属 ( Kocuria ) 微小杆菌属 ( Exiguobacterium ) Zobellia 和 Gelidibacter 共 14 个属, 而且归属于放线菌门的细菌基本集中在丝状体时期 只在叶状体海上养殖时期分离到的细菌有 Phaeobacter 小红卵菌属 ( Rhodovulum ) Ahrensia Loktanella 红杆菌属 ( Rhodobacteraceae) 赤杆菌属 ( Erythrobacter ) Robiginitomaculum 芽单胞菌属 ( Blastomonas) 溶杆菌属 ( Lysobacter ) 海细菌属 ( Marinobacterium ) Reinekea Alishewanella Gilvimarinus Oceanobacillus Pontibacter Maribacter Vitellibacter 和 Salinimicrobium 共 18 个属 不同养殖时期, 温度 盐度 营养物质 养殖场区的开放性和其他人为干扰在很大程度上影响着细菌群落 此外, 同一时期不同的处理方式也使得坛紫菜共附生细菌存在差异 比较紫菜真菌的分布差异发现 (1) 分离的真菌大部分集中在丝状体育苗时期, 共有 14 个属, 叶状体时期只分离到枝顶孢属 ( Acremonium ) 枝孢属 ( Cladosporium ) 青霉属 ( Penicillium ) 和曲霉属 ( Aspergillus ) 共 4 个属的真菌 除曲霉属 ( Aspergillus) 是叶状体时期独有的, 其他 3 个属是分离真菌数量最多的, 为优势菌群 丝状体时期育苗池相对封闭, 容易沉积积累有机物, 且海水温度 盐度等控制较稳定, 为真菌提供了较好地营养基质和生长环境 ; 相比之下叶状体时期海区温度偏低 海水流动性很大以及海水的寡营养性都不利于真菌的生长和聚集 (2) 坛紫菜共附生真菌和对照海水真菌存在明显差异 : 镰孢霉属 ( Fusarium ) Ophiosphaerella 茎点霉属 ( Phoma ) 裂褶菌属 ( Schizophyllum) 和粒毛盘菌属 ( Lachnum) 共 5 个属只分离自坛紫菜 粉瘤菌属 ( Lycogala) 节菱孢属 ( Arthrinium ) Toxicocladosporium Neophaeosphaeria 和 Paraphaeosphaeria 共 5 个属只分离自对照海水 表 5. 细菌 16S rdna 序列比对结果 Table 5. Results of bacterial 16S rdna sequence alignment Sample groups BW1SW BW1PhC BW2SW BW2PhC BW3SW BW3PhS BW3PhG BW4SW BW4PhS BW4PhG Genera Pseudorhodobacter, Alteromonas, Psychrobacter, Arthrobacter, Salinibacterium, Exiguobacterium, Halobacillus, Planococcus, Bacillus,Zobellia and Cellulophaga Sulfitobacter,Paracoccus,Stenotrophomonas,Rheinheimera,Cobetia,Gelidibacter and Salinibacterium Idiomarina,Psychrobacter,Myceligenerans,Gordonia and Bacillus Roseivivax,Sphingopyxis,Myceligenerans,Kocuria and Bacillus Rhodovulum,Rhodobacteraceae,Marinobacterium,Reinekea and Gilvimarinus Sulfitobacter,Phaeobacter,Roseivivax,Ahrensia,Loktanella,Rhodobacteraceae,Erythrobacter and Bacillus Phaeobacter,Ahrensia,Loktanella,Rhodobacteraceae,Paracoccus,Erythrobacter,Robiginitomaculum,Blastomonas,Lysobacter, Gilvimarinus,Bacillus and Vitellibacter Rhodovulum,Alishewanella,Psychrobacter and Bacillus Paracoccus,Psychrobacter,Arthrobacter,Oceanobacillus,Halobacillus and Cellulophaga Bacillus,Maribacter and Cellulophaga

7 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 1093 表 6. 真菌 18S rdna 序列比对结果 Table 6. Results of fungal 18S rdna sequence alignment Sample groups BW1SW BW1PhC BW2SW BW2PhC BW3SW BW3PhS BW3PhG BW4SW BW4PhS BW4PhG Genera Acremonium,Neophaeosphaeria,Phaeosphaeria,Paraphaeosphaeria and Cladosporium Ophiosphaerella,Phoma,Phaeosphaeria,Cladosporium,Penicillium,Lachnum and Schizophyllum Lycogala,Arthrinium,Acremonium,Toxicocladosporium,Cladosporium and Penicillium Fusarium Cladosporium Penicillium Acremonium and Cladosporium Aspergillus Cladosporium None 本文对每次采样细菌 ( 图 3 - 图 6) 和全部 4 次 采样的真菌 ( 图 7) 的代表菌株构建系统发育树 3 讨论 传统的分离方法和 PCR-DGGE 技术是分析微 [25 - 生物群落结构最常用的方法之一 26], 本研究分离 的 467 株细菌归属于变形菌门 ( Alphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria ) 放线菌门 ( Actinobacteria) 厚壁菌门 ( Firmicutes) 和拟杆菌门 ( Bacteroidetes), 优势菌群为 α- 变形菌纲和 γ- 变形 [27 - 菌纲, 与很多藻类共附生细菌群落研究类似 29] 有研究表明细菌群落和藻类之间普遍存在宿主特异 性 [30] 本研究中有 37 个属的细菌是坛紫菜藻际及 海水中特有的, 只有芽胞杆菌属 ( Bacillus) 节杆菌 属 ( Arthrobacter) 考克氏菌属 ( Kocuria) 和动球菌属 ( Planococcus) 在条斑紫菜藻际及海水中分离到 [18] 有报道称假交替单胞菌会引起紫菜病害 [7,11], 本研 [18] 究中未分离到该属细菌, 此结果与杨锐等在该海 区的研究结果相一致 此外我们还分离到了可能引 [3-4] 起条斑紫菜细菌性红烂病的科贝特菌属细菌 ( GenBank 序列号 AY ), 相似度高达 99% 的菌株 分离的 55 株真菌大部分归属于子囊菌门 ( Ascomycota), 包括粪壳菌纲 ( Sordariomycetes) 座 囊菌纲 ( Dothideomycetes ) 和锤舌菌纲 ( Leotiomycetes ), 1 株归属于担子菌门 ( Basidiomycota) 伞菌纲 ( Agaricomycetes) 枝顶孢 属 ( Acremonium) 节菱孢属 ( Arthrinium) 镰孢霉属 ( Fusarium ) 茎点霉属 ( Phoma ) 枝孢属 ( Cladosporium ) 青霉属 ( Penicillium ) 和曲霉属 ( Aspergillus) 是常见的陆生真菌, 也普遍存在于海藻 中 [31-34] 其中, 如镰孢霉属 ( Fusarium ) 曲霉属 ( Aspergillus) 等腐霉具有分解作用, 病害发生时藻体常常溃烂解体, 这类真菌很可能作为病害的预警因 子 在坛紫菜真菌中发现与引起条斑紫菜丝状体白 斑病的茎点霉形态极为相似的真菌 [12] 据 Zuccaro 和 Mitchell [35] 报道, 归属于 Spathulospora Chadefaudia Haloguignardia Retrostium Histopidicarpomyces 和 Pontogenia 的真菌都是藻类特异真菌, 而本研究并未分离到相关真菌 此外本研究中坛紫菜真菌的数量和种类明显少于藻际细菌, 支持海洋真菌多样性低于细菌多样性的观点 [36-38] 比较微生物群落结构, 我们发现坛紫菜藻际微生物和相应海区的海水微生物存在明显差异 同样 的情况也出现在绿藻 Ulva australis 和 Ulvacean sp. 的藻际和海水微生物群落之间 [39-40] 这很可能与 两者所处环境差异有关 藻类不断向藻际微环境释放各种碳源和营养物质, 并且为藻际微生物提供蔽 护 ; 而海水中的营养物质浓度低, 且海水中的游离微生物还需抵御各种生物与非生物胁迫 [39] 另有研究表明海水中的无机营养盐对藻际微生物群落变化 无显著影响 [41], 藻体分泌的化合物可能成为菌群结 [42 - 构的选择性压力 45] 此外藻体表面容易形成生物膜, 紧密的菌菌互作也可能进一步影响微生物群 [46] 落结构 Kanagasabhapathy 等从 9 种红藻包括条 斑紫菜中分离了 92 株细菌, 其中 33% 具有抗菌活 性 方文雅 [47] [18] 杨锐等也发现紫菜藻际细菌中有 28% 以上菌株具有较强的抑菌活性, 而且从健康 紫菜上分离的细菌较病烂紫菜或周边海水中分离的

8 1094 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 图 采样分离细菌的系统发育树 Figure 3. Phylogenetic tree of bacterial isolates sampled in Aprial The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighborjoining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. Bacterial isolates are indicated with BW1,and the highest homology species are reflected in parentheses. The others represent stardand strains and the numbers in parentheses are the accession numbers of sequences.

9 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 1095 图 采样分离细菌的系统发育树 Figure 4. Phylogenetic tree of bacterial isolates sampled in September The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbor- joining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. Bacterial isolates are indicated with BW2,and the highest homology species are reflected in parentheses. The others represent stardand strains and the numbers in parentheses are the accession numbers of sequences. 细菌具有更强的抑菌活性和更多的菌株数, 这些细菌很可能通过释放抗菌物质抑制其他共生菌以维持自己的生存地位 坛紫菜丝状体和叶状体阶段藻体形态差异较大, 其藻际微生物群落结构也存在较大差异 大部分真菌分离自丝状体 丝状体附着的贝壳微孔同样利于丝状真菌的附着且能提供一定的蔽护作用, 叶状体细胞细胞壁较厚, 在健康状态下不利于菌丝的侵染 4 个采样时期的海水温度 盐度和 ph 值差异较大 ( 表 2), 这些环境因素也在一定程度上影响微生物群落的变化 丝状体时期苗场的 ph 低于海区 ph, 温度基本在 15-30, 利于真菌等微生物生 长繁殖 叶状体栽培在开放海区进行, 海水温度的 变化成为较大的选择性压力 叶状体时期海区温度 普遍偏低且 ph 接近 8, 不利于真菌生长 Dziallas 和 Grossart [15] 研究发现仅不同培养温度下的蓝藻 Microcystis aeruginosa 藻际微生物群落明显不同 [40] Tujula 等研究海洋绿藻 Ulvacean sp. 外生细菌群 落多样性随地理位置和季节演替,α- 变形菌纲和拟 杆菌纲作为优势菌群处于较稳定状态, 可能发挥着 [30] 维持群落功能的重要作用 Lachnit 等研究 Fucus vesiculosus Gracilaria vermiculophylla 和 Ulva intestinalis 3 种海藻上的外生细菌发现群落结构具 有藻类特异性且随季节变化

10 1096 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 图 采样分离细菌的系统发育树 Figure 5. Phylogenetic tree of bacterial isolates sampled in November The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighborjoining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. Bacterial isolates are indicated with BW3,and the highest homology species are reflected in parentheses. The others represent stardand strains and the numbers in parentheses are the accession numbers of sequences.

11 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 1097 图 采样分离细菌的系统发育树 Figure 6. Phylogenetic tree of bacterial isolates sampled in March The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbor- joining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. Bacterial isolates are indicated with BW4,and the highest homology species are reflected in parentheses. The others represent stardand strains and the numbers in parentheses are the accession numbers of sequences.

12 1098 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) 图 7. 4 次采样分离真菌的系统发育树 Figure 7. Phylogenetic tree of fungal isolates in all sampling times. The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbor- joining analyses of 1000 sample date sets. The scale bar represents the estimated number of base changes per nucleotide sequence position. Fungal isolates are indicated with FW,and the highest homology species are reflected in parentheses. The others represent stardand strains and the numbers in parentheses are the accession numbers of sequences.

13 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 1099 综上, 坛紫菜藻际和周围海水微生物受宿主和环境影响, 虽有发现与致病菌高度相似的微生物, 但并未引发病害 ; 可见, 良好的藻际微环境能够维持藻类和微生物间的动态平衡, 即使有潜在致病微生物的存在也不一定引起藻体病烂 然而, 当环境剧变, 如高温导致藻类发生生理不适或病烂, 个别藻际微生物菌群可能趁机爆发, 加剧藻体死亡, 继而引发病原性病烂 近年有研究表明结合环境因素和微生物分子生物学分析可以用种群分布模型 ( species [48 - distribution model,sdm) 预测微生物多样性 49] 坛紫菜养殖虽然有人为控制苗场和天然开放海区两个明显不同的环境, 但是这些环境因素均可监测, 通过大量环境和微生物数据收集整理, 有望绘制坛紫菜养殖周期的微生物生态图 关注正常的藻际微生物群落变化以及可能引起紫菜病害的相关微生物和分解作用的腐霉, 在种类和数量上归纳养殖微生物指标, 可能最终实现智能化条件控制和病害预防 参考文献 [1 ] Sutherland JE, Lindstrom SC, Nelson WA, Brodie J, Lynch MDJ,Hwang MS,Choi HG,Miyata M,Kikuchi N,Oliveira MC,Farr T,Neefus C,Mols-Mortensen A, Milstein D,Müller KM. A new look at an ancient order: generic revision of the Bangiales ( Rhodophyta). Journal of Phycology,2011,47(5) : [2 ] Luo Q,Xu Z,Wang C. Effect of high temperature on seedling conchocelis of Porphyra haitanensis. Journal of Ningbo University ( NSEE),2004,17(4) : ( in Chinese) 骆其君, 徐志标, 王常青. 高温时期坛紫菜纯系育苗的对策. 宁波大学学报 ( 理工版 ),2004,17(4) : [3 ] Yan X,Huang B,Zhou X,Li L. Study on a bacterial red-rotting disease of Porphyra haitanensis ( Bangiales, Rhodophyta ). Journal of Fishery Sciences of China, 2008,15(2) : ( in Chinese) 严兴洪, 黄林彬, 周晓, 李琳. 坛紫菜叶状体的细菌性红烂病研究. 中国水产科学,2008,15 ( 2 ) : [4 ] Huang B, Yan X. Study on the redrotting disease of Porphyra blades. Journal of Shanghai Ocean University, 2010,19(2) : ( in Chinese) 黄林彬, 严兴洪. 紫菜叶状体的红烂病研究. 上海海洋大学学报,2010,19(2) : [5 ] 陈马马, 于义德, 杨肇惠. 栽培紫菜叶状体绿烂病因的研究 / / 中国藻类学会. 第一届中国藻类学术讨论会论文集. 北京 : 科学出版社,1983: [6 ] Ding H. Study on development process of green spot disease in Porphyra yezoensis. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2008,36 ( 11 ) : ( in Chinese) 丁怀宇. 条斑紫菜绿斑病发病进程研究. 安徽农业科学,2008,36(11) : [7 ] Yan Y, Ma J, Xu P, Sun Q, Wang H. Pseudoalteromonas citrea, the causative agent of greenspot disease of Porphyrae yezoensis. Journal of Fishery Sciences of China,2002,12,9 ( 4 ) : ( in Chinese) 闫咏, 马家海, 许璞, 孙其焕, 王汉清. 1 株引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌. 中国水产科学, 2002,12,9(4) : [8 ] Takahashi M,Ichitani T,Sasaki M. Pythium porphyrae Takahashi et Sasaki,sp. nov. causing red rot of marine red algae Porphyra spp.. Transactions of the Mycological Society of Japan,1977,18(3) : [9 ] Sekimoto S, Yokoo K, Kawamura Y, Honda D. Taxonomy, molecular phylogeny, and ultrastructural morphology of Olpidiopsis porphyrae sp. nov. ( Oomycetes, straminipiles ), a unicellular obligate endoparasite of Bangia and Porphyra spp. ( Bangiales, Rhodophyta). Mycological Research, 2008,112 ( 3 ) : [10] Klochkova TA,Shim JB,Hwang MS,Kim GH. Hostparasite interactions and host species susceptibility of the marine oomycete parasite, Olpidiopsis sp., from Korea that infects red algae. Journal of Applied Phycology, 2012,24(1) : [11] Wang H,Li X,Xia Y,Yan B. Isolation,identification and biological pathogen of yellow spot disease in conchocelis of Porphyra yezoensis. Marine Environmental Science,2011,30(30) : ,408. ( in Chinese) 王洪斌, 李信书, 夏亚明, 阎斌伦. 条斑紫菜丝状体黄斑病病原体分离鉴定及生物学特性研究. 海洋环境科学,2011,30(30) : ,408. [12] 李金波. 条斑紫菜丝状体白斑病病原菌的分离鉴定. 华中农业大学的学位论文,2006. [13] Bell W,Mitchell R. Chemotactic and growth responses of marine bacteria to algal extracellular products. The Biological Bulletin,1972,143(2) : [14] Weinberger F. Pathogen-induced defense and innate

14 1100 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) immunity in Macroalgae. Biological Bulletin,2007,213 (3) : [15] Dziallas C,Grossart HP. Microbial interactions with the cyanobacterium Microcystis aeruginosa and their dependence on temperature. Marine Biology,2012,159 (11) : [16] Berg GM, Repeta DJ, LaRoche J. Dissolved organic nitrogen hydrolysis ates in axenic cultures of Aureococcus anophagefferens ( Pelagophyceae ) comparison with heterotrophic bacteria. Applied and Environmental Microbiology,2002,68(1) : [17] Chen G, Shen H, Zhu M, Xu P. Preliminary investigation on attaching bacteria and disease bacteria in thalli of Porphyra yezoensis. Journal of Aquaculture,1999 (1) : ( in Chinese) 陈国耀, 沈怀舜, 朱庙先, 徐璞. 条斑紫菜叶状体附生菌及病原菌初步调查. 水产养殖,1999(1) : [18] Yang R,Fang W,Shan Y,Chen H,Sun X,Ye Y. Genetic diversity of epiphytic bacteria in Porphyra yezoensis. Acta Oceanologica Sinica,2008,30 ( 4) : ( in Chinese) 杨锐, 方文雅, 单媛媛, 陈海敏, 孙雪, 叶央芳. 条斑紫菜外生细菌的遗传多样性. 海洋学报,2008,30 (4) : [19] Xiang T, Zhang F. Microbial diversity in petroleum reserviors analyzed by PCR-DGGE. Acta Ecologica Sinica,2005,25(2) : ( in Chinese) 向廷生, 张凡. PCR- DGGE 方法分析原油储层微生物群落结构及种群多样性. 生态学报,2005,25 ( 2 ) : [20] Vainio EJ,Hantula J. Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA. Mycological Research,2000, 104(8) : [21] Dar SA,Kuenen JG,Muyzer G. Nested PCR- denaturing gradient gel electrophores is approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2005,71(5) : [22] Holmstr m C, Kjelleberg S. Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biological active extracellular agents. FEMS Microbiology Ecology,1999,30(4) : [23] Schwarzott D,Schüler A. A simple and reliable method for SSU rrna gene DNA extraction, amplification and cloning from single AM fungal spore. Mycorrhiza,2001, 10(4) : [24] Gong L, Ren N, Xing D. Application of denaturing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis in microbial molecular ecology. Acta Microbiologica Sinica, 2004, 44 ( 6 ) : ( in Chinese) 宫曼丽, 任南琪, 邢德峰. DGGE / TGGE 技术及其在微生物分子生态学中的应用. 微生物学报,2004,44 (6) : [25] Sun S,Zhang D,Qian L,Pan Z,Chen W. Comparative investigation of the heterotrophic bacterial community in the surface sediment of Portunus trituberculatus rearing pond. Journal of Fisheries of China,2010,34( 5) : ( in Chinese) 孙苏燕, 张德民, 钱丽君, 潘志崇, 陈文桂. 三疣梭子蟹养殖塘表层底泥异养细菌群落比较研究. 水产学报,2010,34(5) : [26] Qian L,Zhang D,Xu X. Bacteria diversity in Portunus trituperculatus pond sediment estimated by denaturing gradient gel electrophoresis. Journal of Fisheries of China, 2007,31(2) : ( in Chinese) 钱丽君, 张德民, 徐小红. 应用 DGGE 分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性. 水产学报,2007,31 (2) : [27] Goecke F,Thiel V,Wiese J,Labes A,Imhoff JF. Algae as an important environment for bacteria-phylogenetic relationships among new bacterial species isolated from algae. Phycologia,2013,52(1) : [28] Longford SR, Tujula NA, Crocetti GR, Holmes AJ, Holmstrom C,Kjelleberg S,Steinberg PD,Taylor MW. Comparisons of diversity of bacterial communities associated with three sessile marine eukaryotes. Aquatic Microbial Ecology, (3) : [29] Lage OM,Bondoso J. Planctomycetes diversity associated with macroalgae. FEMS Microbiology Ecology,2011,78 (2) : [30] Lachnit T, Blumel M, Imhoff JF, Wahl M. Speci c epibacterial communities on macroalgae: phylogeny matters more than habitat. Aquatic Biology,2009,5: [31] Kohlmeyer J,Kohlmeyer E. Marine Mycology: The high fungi. New York: Academic Press,1979: [32] Kohlmeyer J, Volkmann-Kohlmeyer B. Marine ascomycetes from algae and animal hosts. Bot anica Marina,2003,46(3) : [33] Zuccaro A, Schoch CL, Spatafora JW, Kohlmeyer J,

15 沈梅丽等 : 坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性. / 微生物学报 (2013)53(10) 1101 Draeger S, Mitchell JI. Detection and identification of fungi intimately associated with the brown seaweed Fucus serratus. Applied and Environmental Microbiology,2008, 74(4) : [34] Ding L, Qin S, Li F, Chi X, Laatsch H. Isolation, antimicrobial activity, and metabolites of gungus Cladosporium sp. associated with red alga Porphyra yezoensis. Current Microbiology,2008,56(3) : [35] Zuccaro A,Mitchell JI. Fungal communities of seaweeds / / Deighton J, White JF, Oudemans P. The Fungal Community: Its organisation and role in the ecosystem. 3 rd eds. New York: Taylor & Francis,2005: [36] Kis-Papo T. Marine fungal communities / / Dighton J, White JF, Oudemans P. The Fungal Community: Its organisation and role in the ecosystem. 3 rd eds. New York: Taylor & Francis,2005: [37] Burgaud G,Le Calvez T,Arzur D,Vandenkoornhuyse P, Barbier G. Diversity of culturable marine lamentous fungi from deep-sea hydrothermal vents. Environmental Microbiology,2009,11(6) : [38] Richards TA,Jones MDM,Leonard G,Bass D. Marine fungi: their ecology and molecular diversity. Annual Review of Marine Science,2012,4: [39] Tujula NA,Crocetti GR,Burke C,Thomas T,Holmstr m C, Kjelleberg S. Variability and abundance of the epiphytic bacterial community associated with a green marine Ulvacean alga. The ISME Journal,2010,4: [40] Burke C,Thomas T,LewisM,Steinberg P,Kjelleberg S. Composition,uniqueness and variability of the epiphytic bacterial community of the green alga Ulva australis. The ISME Journal,2011,5: [41] Sapp M, Schwaderer AS, Wiltshire KH, Hoppe HG, Gerdts G, Wichels A. Species-specific bacterial communities in the phycosphere of microalgae? Microbial Ecology,2007,53(5) : [42] Lam C,Stang A,Harder T. Planktonic bacteria and fungi are selectively eliminated by exposure to marine macroalgae in close proximity. FEMS Microbiology Ecology,2008,63(3) : [43] Sala ün S, Barre SL, Santos-Goncalvez MD, Potin P, Haras D,Bazire A. Influence of exudates of the kelp on biofilm formation of associated and exogenous bacterial Epiphytes. Microbial Ecology,2012,64(2) : [44] Goecke F,Labes A,Wiese J,Imhoff JF. Dual effect of macroalgal extracts on growth of bacteria in Western Baltic Sea. Revista de Biología Marinay Oceanografía,2012,47 (1) : [45] Goecke FR,Labes,A,Wiese J,Imhoff JF. Chemical interactions between marine macroalgae and bacteria. Marine Ecology Progress Series,2010,409: [46] Kanagasahapathy M,Sasaki H,Nagata S. Phylogenetic identi cation of epibiotic bacteria possessing antimicrobial activities isolated from red algal species of Japan. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24 (10) : [47] Fang W,Yang R,Shan Y,Yan X. Antibacterial activity of Porphyra spp. epiphytic bacteria and polyketide synthase I gene screening. Acta Microbiologica Sinica, 2009,49(2) : ( in Chinese) 方文雅, 杨锐, 朱鹏, 单媛媛, 严小军. 紫菜外生细菌抑菌活性及其多聚酮合酶 ( PKSI) 基因筛选. 微生物学报,2009,49(2) : [48] Fierer N,Ladau J. Predicting microbial distributions in space and time. Nature Methods,2012,9(6) : [49] Larsen PE, Field D, Gilbert JA. Predicting bacterial community assemblages using an artificial neural network approach. Nature Methods,2012,9(6) :

16 1102 Meili Shen et al. / Acta Microbiologica Sinica(2013)53(10) Microbial diversity of Pyropia haitanensis phycosphere during cultivation Meili Shen,Rui Yang *,Qijun Luo,Shugang Wang,Jirui Ren Ministry of Education, Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology; Marine Biotechnology Laboratory, Ningbo University,Ningbo ,China Abstract:[Objective] Pyropia haitanensis is of great commercial importance and wildly cultivated in Zhejiang and Fujian provinces. To observe the characteristics and changes of phycosphere microbial communities during cultivation can help us monitor the potential pathogens and microbial factors affecting the health of cultivated seaweeds. [Methods] The morphological characteristics and the diversity of phycosphere and surrounding seawater microbes were studied by pure culture method and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis ( PCR-DGGE). Similarity analysis was carried out online with the 16S rdna ( bacteria) and 18S rdna ( fungi) sequences in GenBank. The phycosphere microbial diversity during different growth stages, cultivated areas and periods was studied. [Results] Totally 467 bacteria and 55 fungi were isolated during P. haitanensis cultivation. The diversity of fungi was smaller than that of bacteria. The bacteria were classified into 41 genera, belonging to Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes. The dominant bacterial communities were Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria. Most of the fungi were classified into Ascomycota,only one strain belonging to the Basidiomycota, Agaricomycetes. Bacteria of 19 specific genera were isolated from P. haitanensis while 13 specific genera were isolated from the surrounding seawater. Most actinomycetes and fungi were isolated from the conchocelis cultured indoors,which was different from the microbial communities of the thalli in intertidal zone. Within the isolated microbes,we found that some strains had very high similarity with those pathogens such as Cobetia marina ( C. marina,p. haitanensis red-rotting disease), Phoma porphyrae ( P. yezoensis disease ) and saprotrophic fungi Fusarium sp. and Aspergillus sp.. [Conclusion] The diversity of Pyropia phycoshpere microbes during cultivation was affected by the seaweed morphology, culture time and environmental factors. The strains that shared high similarity with Pyropia pathogens were found in this study,which would cause our great attention to these potential pathogens for Pyropia diseases. Keywords: Pyropia haitanensis,bacteria,fungi,diversity,cultivation ( 本文责编 : 王晋芳 ) Supported by the Special Fund for Marine Scientific Research in the Public Interest ( , ), by the Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest ( ),by the Nature Science Fund of Zhejiang ( LY12D06003 ) and by the Nature Science Fund of Ningbo (2012A610140) * Corresponding author. Tel: ; Fax: ; yangrui@ nbu. edu. cn Received: 21 January 2013 / Revised: 4 May 2013