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良笃蓟
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1 # 薜荔榕小蜂的分子遗传关系研究 ** 孙伶俐, 毛健萍, 刘燕, 陈友铃 ( 福建师范大学生命科学学院, 福州 ) 5 摘要 : 本实验用核糖体 28SrDNAD1-D3 区基因部分序列, 对采自福建不同样地的薜荔传粉小蜂和三个不同品系的栽培爱玉子的传粉小蜂进行分析, 结果表明 :(1) 薜荔传粉小蜂和爱玉子传粉小蜂的核糖体 28S 序列的碱基组成中 A,T,G,C 四种含量较平均,C+G 的平均含量 (56%) 稍高于 A+T 的含量 (44%) 28S 序列的薜荔传粉榕小蜂个体间遗传距离为 , 爱玉子传粉小蜂各样本间平均遗传距离为 0; 薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂群体间遗传距离为 , 两群体间的遗传距离大于群体内各样本之间的遗传距离, 以 28S 序列用 NJ(Neighbor-joining) 法建立系统发育树显示, 爱玉子传粉小蜂三个样本和薜荔传粉小蜂两个样本各自先汇聚成一支, 再汇聚到一起, 表明薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂群体之间已经产生了一定的变异, 表明薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂可能为两个不同的种关键词 : 薜荔, 爱玉子, 榕小蜂, 28S 中图分类号 :Q Studies on the Molecular Genetic Relationship of Wiebesia pumilae SUN Lingli, MAO Jianping, LIU Yan, CHEN Youling (College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou , China) Abstract: In the present studies, we used three molecular markers including 28SrDNA D1-D3 genes to investigate the genetic relationship of these two pollinators. The pollinator samples were collected from Ficus pumila var. pumila at three different locations as well as three cultivars of Ficus pumila var. awkeotsang. The data are summarized as follows: (1) The distribution of the four bases including A, T, G, C in the 28SrDNA sequence from the pollinators of Ficus pumila var. pumila and Ficus pumila var. awkeotsang is relatively akin. The average content of C + G (56%) is slightly higher than the average content of A+T (44%). The average genetic distance of the 28S sequence of each sample within Ficus pumila var. pumila or Ficus pumila var. awkeotsang is or 0, while the average genetic distance between the two wasp populations is Since the genetic distance between the two wasp groups are significantly greater than the genetic distance within the respective group, these data suggest that the two groups of fig wasps have differentiated during the evolution and reached to the level of species identification, namely the pollinators of Ficus pumila var. pumila and Ficus pumila var. awkeotsang are the two different wasp species. Key words: Ficus pumila var. pumila, Ficus pumila var. awkeotsang, fig wasps, 28S 0 引言 40 薜荔 (Ficus pumila var. pumila) 隶属桑科榕属, 为攀援或匍匐灌木, 主要分布于福建江西浙江安徽江苏台湾湖南广东广西贵州云南东南部四川及陕西等地, 基金项目 : 福建省自然科学基金项目 (2011N0014); 福建师范大学生命科学学院生物学拔尖生培养计划项目作者简介 : 孙伶俐 (1988-), 女, 研究生, 研究方向 : 生化与分子生物学通信联系人 : 陈友铃 (1966-), 男, 教授, 研究方向 : 动物学. chenyouling2000@126.com - 1 -

离为 0.00170.0048, 爱玉子传粉小蜂各样本间平均遗传距离为 0; 薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂群体间遗传距离为 0.

2 被广泛用于园林的绿化 [1, 2], 爱玉子 (Ficus pumila var. awkeotsang) 为薜荔的变种, 是我国特有的植物, 原产自台湾, 在福建浙江等地少量的野生分布, 目前在台湾和大陆长江以南有广泛栽培 [1, 3] 薜荔和爱玉子在植株性状茎叶形态花与花序的形态结构等方面均十分相似, 二者究竟是原变种与变种的关系, 拟或为不同的两个种, 长期以来争论不休李和惠用 trnt-trnl 序列和核内 NIA-i3 和 ITS2 序列对薜荔和爱玉子植株进行研究发现, 核内 NIA-i3 和 ITS2 序列两者之间不存在差异,trnT-trnL 序列上存在微小差异, 认为两者为同一个种 [4] 而林贊標的研究表明, 爱玉子瘦果中的果胶甲酯酶的活性 (95.8 活性单位 ) 比薜荔 (4.8 活性单位 ) 高很多, 且爱玉子果胶甲酯酶有两个亚型, 在薜荔果胶甲酯酶只有一个亚型 [5], 暗示薜荔和爱玉子可能是亲缘关系很近的两个不同的种长期以来, 人们一直认为薜荔与爱玉子的传粉小蜂为同一种传粉榕小蜂 (Wiebesia pumilae (Hill)) [6, 7] 由于薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂之间的形态差异极其细微, 仅依赖传统的形态标记分类方法, 难以将它们区别开来薜荔传粉小蜂和爱玉子传粉小蜂究竟是同种? 还是两个不同的种? 或是互为隐种关系? 这一直是悬而未决的问题分子标记技术的快速发展, 给这一难题的解决带来希望本文用核糖体 28SrDNAD1-D3, 以及线粒体 COI 和 Cytb 三种分子标记对分类地位模糊的薜荔和爱玉子传粉小蜂进行鉴定, 明确薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂之间的分子遗传关系, 以期在爱玉子的经济栽培中起到指导性作用 1 材料和方法样本的采集及保存从 2010 年 3 月至 2012 年 12 月间于福建省福州市莆田市等地采集实验小蜂, 样本及采集地点 ( 见表 1) 将采集来的榕小蜂存放入含有无水乙醇保存液的 1.5 ml 的离心管中, 使小蜂迅速死亡, 置于 -20 保存 65 表 1 实验材料及采集地及其登陆号 Table 1 Origin of the tested wasps materials 宿主 Ficus host 小蜂种类 Wasp Species 采集地点 Sampling locality 样品编码 Code 28S 登录号 Accession Number 爱玉子 Wiebesia pumilae 莆田 Putian WiePum21 KC 爱玉子 Wiebesia pumilae 莆田 Putian WiePum74 KC 爱玉子 Wiebesia pumilae 莆田 Putian WiePum156 KC 薜荔 Wiebesia pumilae 福州长安山 Changan Mountain WiePumLQ KC 薜荔 Wiebesia pumilae 福州坟崹山 Fenti Mountain WiePumFT KC 高榕 Eupristina altissima 福州旗山 Qishan EupAltQS KC 黄葛树 Sycoscapter sp 福州旗山 Qishan SycSpQS KC 基因组 DNA 的提取,PCR 及测序取 95% 的酒精 -20 下储存的榕小蜂样品, 用酚氯仿抽提法进行基因组 DNA 提取用提取的基因组 DNA 进行目的片段 PCR 扩增 : 28S 序列上游引物 28S-F:5 -ACCCGCTGAATTTAAGCATAT S 序列下游引物 28S-R:5 -TAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3 28S 序列扩增条件为 94 预变性 3 min,94 变性 60 s,60 退火 50 s,72 延伸 70 s, 34 个循环后 72 延伸 7 min 结束,4 保温 - 2 -

者究竟是原变种与变种的关系, 拟或为不同的两个种, 长期以来争论不休李和惠用 trnt-trnl 序列和核内 NIA-i3 和 ITS2 序列对薜荔和爱玉子植株进行研究发现, 核内 NIA-i3 和 ITS2 序列两者之间不存在差异,trnT-trnL 序列上存在

3 对 PCR 扩增的产物直接进行测序, 所有 PCR 产物均送至生工生物公司进行测序将测序所得序列上传 GenBank 上 1.3 数据处理得到测序序列后, 在 NCBI 上用 BLAST 进行相似性检索, 确定所得的序列确实为目的片段将这些片段用 CLUSTAL X 1.83 进行序列比对, BioEdit 3.3 校正比对结果, 截取相同长度的序列进行分析, 运用 MEGA 4.0 软件计算不同序列的碱基组成及碱基替换, 用邻接法 (Neighbor-Joining) 构建系统进化树并进行系统进化分析, 计算 K2P 遗传距离 80 2 结果 2.1 榕小蜂核糖体 28S 序列分析榕小蜂 28S 序列组成分析对榕小蜂 28S 序列, 用 CLUSTAL X 1.83 软件进行序列比对, 截取对准的 941 pb 序列进行分析, 用 Mega4.0 软件中的 Data explore 软件进行各小蜂的碱基组成分析在 28S 序列中, 不变位点 702 个, 变异位点 233 个, 简约信息位点 91 个, 自裔位点 140 个, 变异性为 24.8% 各样品的碱基组成分析见表 2, 由表 2 可知, 所有的小蜂样本碱基组成都比较平均, C+G 的含量在 55.7% -58.4%,C+G 的含量略大于 A+T 的含量表 2 榕小蜂 28S 序列的碱基组成 Table 2 The base frequency of 28S sequence 小蜂种类 Wasp Species A% G% T% C% C+G% WiePum WiePum WiePum WiePumLQ WiePumFT EupAltQS SycSpQS Average 榕小蜂核糖体 28S 序列的遗传距离分析用 Mega4.0 软件中的 K2P 法计算遗传距离 ( 见表 3) 所有样品间的遗传距离在之间, 爱玉子传粉小蜂样品间的遗传距离为 ; 薜荔传粉小蜂样品间遗传距离为 ; 两群体间的平均遗传距离为表 3 基于 Kimura 双参数模型榕小蜂 28S 序列的遗传距离 - 3 -

0 软件计算不同序列的碱基组成及碱基替换, 用邻接法 (Neighbor-Joining) 构建系统进化树并进行系统进化分析, 计算 K2P 遗传距离 80 2 结果 2.1 榕小蜂核糖体 28S 序列分析 85 2.1.1 榕小蜂 28S 序列组成分析对榕小蜂 28S 序列, 用 CLUSTAL X 1.

4 Table 3 Genetic distances of 28S sequences banse on Kimura 2-parameter of fig wasps WiePum21 WiePum74 WiePum156 WiePumLQ WiePumF T EupAltQS WiePum21 WiePum WiePum WiePumLQ WiePumFT EupAltQS SycSpQS SycSpQS 榕小蜂核糖体 28S 序列系统发育树的构建在 NCBI 网站上对实验中的 28S 序列进行同源性检索, 下载 4 种前人研究过的榕小蜂 28S 序列 ( 见表 4) 进行分析表 4 GenBank 上下载的榕小蜂 28S 序列 Table 4 28S sequences of fig wasps download from GenBank 小蜂种类 Wasp Species 代码 Code 登陆号 Accession Number Eupristina verticillata EupVer AY Eupristina koningsbergeri EupKon HM Sycoscapter australis SycAus AJ Sycoscapter roxburghi SycRox HE 用 Mega4.0 软件对实验所得与 GenBank 中下载的榕小蜂 28S 序列用 NJ (Neighbor-joining) 法, 同时用重复抽样 1000 次检验分子系统树各分支的置信值, 建立系统发育树见图 1 图中显示, 相同属的小蜂汇聚到一起, 显示出较近的亲缘关系, 爱玉子传粉小蜂三个样本和薜荔传粉小蜂两个样本各自先汇聚成一支, 再汇聚到一起, 表明薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂群体之间已经产生了一定的变异图中显示每个属的小蜂都能够明显的区分开来, 这说明 28S 序列可以做为小蜂分子分类的鉴定依据 97 WiePum156 WiePum74 99 WiePum21 WiePumLQ 85 WiePumFT 92 EupVer EupKon EupAltQS SycAus 100 SycRox SycSpQS 0.01 图 1 邻接法构建的榕小蜂 28S 序列系统发育树 Fig.1 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on 28S sequence of fig wasps - 4 -

5 3 结论遗传标记序列分析结果表明,28S 序列中四种碱基的含量较为平均,G+C 碱基的平均含量为 56%, 比 A+T 的含量稍高, 符合 Campbell 小蜂总科 28SD2 序列对小蜂总科及各科间的系统发育关系进行研究时得出的 28SD2 序列 G+C 碱基的含量偏高的结论 [8] 基于 28S 序列所得的结果显示, 福建地区的薜荔传粉小蜂和爱玉子传粉小蜂各自群体内部的遗传距离都很小, 没有隐存种的分化, 但二者群体之间的遗传距离达到了种间分异的水平, 加之 Chen 等人研究显示福建地区的薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂之间已存在生殖隔离 [9], 因此薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂可以被认为是两个不同的种 [ 参考文献 ] (References) [1] 张秀实, 吴征镒, 曹子余. 中国植物志 ( 第二十三卷. 第一分册 ). 北京 : 科学出版社, 1998: [2] 吴文珊, 陈友铃. 爱玉子 (Ficus awkeotsang) 不同品系的繁殖生态学比较. 生态学报. 2008, 28 (10): [3] 陈友铃, 吴文珊. 爱玉子花序挥发物成分以及对其传粉小蜂的吸引作用. 生态学报. 2010, 30 (8): [4] 李和惠. 薜荔和爱玉子及其传粉小蜂之遗传分化 [D]. 台湾大学昆虫学研究所, [5] 林赞标, 刘哲政, 杨居源, 黄瑞祥, 李永生, 张森永. 爱玉与薜荔隐花果形态与其生化特性比较. 林业试验所研究报告季刊, 1990, 5: [6] 陈勇, 李宏庆, 马炜梁. 薜荔和爱玉及其传粉昆虫繁殖特性. 植物生态学报, 2002, 26 (1): [7] 陈勇, 李宏庆, 马炜梁. 栽培爱玉的传粉生态. 应用生态学报, 2006, 17 (12): [8] Campbell B, Steffen Campbell J, Werren J. Phylogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer (ITS2) and 28S rdna sequences. Insect Molecular Biology. 1994, 2 (4):

研究显示福建地区的薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂之间已存在生殖隔离 [9], 因此薜荔传粉小蜂与爱玉子传粉小蜂可以被认为是两个不同的种 [ 参考文献 ] (References) 130 135 140 [1] 张秀实, 吴征镒, 曹子余.

简报要点 ESI 共有 22 个学科门类, 江苏高校目前只有 16 个学科门类进入了世界 1%, 分别是一般社会科学临床医学农业科学分子生物学和遗传学动植物科学化学地球科学工程

简报要点 ESI 共有 22 个学科门类, 江苏高校目前只有 16 个学科门类进入了世界 1%, 分别是一般社会科学临床医学农业科学分子生物学和遗传学动植物科学化学地球科学工程江苏高等院校 ESI 学科评估简讯 2016 年第 2 期 2016-03-17 ESI(Essential Science Indicators, 基本科学指标 ) 是基于 Web of Science 权威数据建立的分析型数据库, 将全球学科分成 22 个大学科, 来自于 Web of Science 的 10 年