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1 微生物学通报 JAN 20, 2009, 36(1): 64~70 Microbiology 研究报告 2009 by Institute of Microbiology, CAS 两种包装市售冷却牛肉中微生物多样性 的比较分析 * 李正堂李柏林赵勇欧杰 ( ) 摘要 : 本文比较分析了相同销售条件下的未包装冷却牛肉与保鲜膜包装冷却牛肉中的微生物群落结构 采用 16S rdna 的 V3 区片段进行 PCR-DGGE( 变性梯度凝胶电泳 ), 同时利用 16S rdna 全长序列, 通过克隆文库技术对两个样品的微生物群落结构进行研究 研究发现 : 微生物群落结构表现出较大的差异 保鲜膜包装冷却牛肉共有 6 个 OTU (Operational Taxonomic Unit), 主要为 Lactococcus( 乳球菌属, 28%), Lactobacillus( 乳杆菌属, 26%), Carnobacterium( 肉品杆菌属, 18%) 和 Brochothrix( 索丝菌属, 10%); 未包装冷却牛肉则共得到 18 个 OTU, 主要是 Lactococcus( 乳球菌属, 28%), Brochothrix( 索丝菌属, 18%) 和 Acinetobacter( 不动杆菌属, 11%) 结果表明, 保鲜膜包装对于葡萄球菌属以及冷杆菌属等一些细菌都起到了一定的抑制作用 本研究为肉类加工生产中微生物的控制提供一定的理论依据 关键词 : 冷却牛肉, 16S rdna 克隆文库法, PCR-DGGE, 微生物群落结构 The Comparative Analysis of Microorganism Diversity in Two Kinds of Packaged Chilled Beef on Sale LI Zheng-Tang LI Bai-Lin ZHAO Yong OU Jie * (College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai , China) Abstract: This research is for the purpose of comparative analysis of the microbial flora structure in the chilled beef with no packing and cling film, which under the same terms of sale. It was used the V3 area fragment of 16S rdna to carry on PCR-DGGE, Meanwhile used the 16S rdna sequence to analysis the microbial flora structure of the two samples, according to the technology of clone.the research discovered that the flora structure displays a biggish difference; there was 6 OTU in the chilled beef with cling film, mainly was that Lactococcus(28%), Lactobacillus (26%), Carnobacterium(18%) and Brochothrix (10%); but there was 18 OTU in the chilled beef with no packing, mainly was that Lactococcus(28%), Brchothrix(18%), Acinetobacter (11%). The result indicates that cling film played a certain inhibitory action regarding the Staphylococcus as well as the cold pole bacteria and such bacterium. And it can provide a certain theory basis for the meat processing in the department of microorganism s control. Keywords: Chilled beef, 16S rdna clone library analysis, PCR-DGGE, Microbial flora structure 基金项目 : (No. 2007BAD52B05); (No. T1102) * 通讯作者 :Tel: ; : jou@shou.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 : 65,,,,,, [1,2], [3,4],,, [5],,,,, 1 材料和方法 1.1 样品采集 主要试剂和仪器 PCR ; Biospin DNA Biospin; pgem-t Easy ; DH5α Promega ; Eppendorf AG Hamburg PCR 1.3 DNA 的提取 [6] Biospin DNA DNA 1.4 变性梯度凝胶电泳分析 PCR-DGGE 的 V3 可变区 PCR 扩增 : 16S rdna V3 V ATTA CCGCGGCTGCTGG-3 V CGCCCGCCGC GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCC TACGGGAGGCAGCAG-3 25 μl 10 PCR 2.5 μl, MgCl 2 (25 mmol/l)1.5 μl, dntp 2 μl, 27f 1492r 1 μl, 1 μl, Taq (1000U, 5 U/mL)0.3 μl, 15.2 μl PCR 95 C 3 min; 95 C 1 min, 55 C 1 min, 72 C, 25 ; 72 C 10 min 1.0%, 变性梯度凝胶电泳 : 35%~55% V3 DGGE [7] DNA 10 μl Dcode DGGE (Bio Rad), 1 TAE, 120 V 4 h, SYB green I (1 TAE, ) 60 min,, ddh 2 O 5 min, UVP S rdna 克隆文库分析 S rdna 的 PCR 扩增 : DNA, 16S 27f 5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3, 1492r 5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 PCR V3 DNA PCR 克隆文库构建 [8] : 16S rdna pgem-t Easy, CaCl 2 DH5α, X-gal(40 μg/ml) IPTG(40 μg/ml) Ap(50 μg/ml) LA, [9] SP6 T7 PCR, 1.6 克隆序列测定及比对, 16S rdna( 1500 bp), Blast GenBank ( /blast), 90% (OTU, Operational Taxonomic Unit) Bioedit MEGA4, 1.7 文库库容的评价, 16S rdna

3 66 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 (Library Size), Good [10] Coverage C Coverage C 16S rdna, Coverage C=[1 (n/n)] 100 (1), n, N Coverage C 2 结果 2.1 样品 DNA 的提取 DNA 1%, 23 kb ( 1), DNA 1~ 4, 1 2 图 2 两种牛肉样品的 16S rdna 电泳图谱 Fig. 2 PCR amplification of 16S rdna derived from the two samples 图 3 两种牛肉样品 V3 可变区 PCR 扩增结果 Fig. 3 PCR amplification products of V3 region from the two samples 图 1 两种牛肉样品总 DNA 电泳图谱 Fig. 1 Electrophoresis analysis of total DNA from the two simples S rdna 和 V3 可变区 PCR 扩增 27f 1492r PCR,, 1500 bp( 2) 16S rdna V3 ( GC ) PCR, 1%, 200 bp, 3, PCR, DGGE 2.3 PCR-DGGE 结果 DGGE DNA,, DGGE,, DGGE ( 4) DGGE,, 15, 13, 5, 4 a b c d e DGGE, 1 1, 5,

4 : 67 图 4 两种牛肉样品变性梯度凝胶电泳图谱 Fig. 4 DGGE profile of the two samples DGGE,, DGGE, 41%~49%, 45% bandscan, a b d e,, c, 2.4 未包装冷却牛肉与保鲜膜包装冷却牛肉的微生物群落结构特征 100, 100, Blast 97% (OTU) ( M ) 18 OTU, OTUM1 OTUM18, ( N ) 6 OTU, OTUN1 OTUN6 Good, M Coverage C 82%, N Coverage C 88%, OTU NCBI Blast, ( 6), (Lactococcus, 11%), (Brochothrix, 18%), (Acinetobacter, 9%), (Pseudomonas, 8%), (Carnobacterium), (Lactobacillus), (Shewanella), 图 5 两种牛肉样品群落多样性分析 Fig. 5 Community diversity of the two samples A: ; B:. Note: A: Chilled beef with no packing; B: Chilled beef with cling film.

5 68 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 Fig. 6 图 6 两种牛肉样品克隆的整体分布 Percentage of clones in the two samples and their relationship to different genera (Staphylococcus), (Rahnella), (Kocuria), (Bacillus subtilis), (Psychrobacter), (Microbacterium), (Stenotrophomonas), (Streptococcus) (Vagococcus salmoninarum), (Lactococcus, 28%), (Lactobacillus, 26%), (Carnobacterium, 18%), (Brochothrix, 16%), (Streptococcus) (Lactococcus), (Brochothrix), (Carnobacterium), (Streptococcus) (Lactobacillus), [12] (Lactococcus), (Lactobacillus) (Brochothrix),, [11] 2.5 系统发育分析 OTU NCBI Blast, ( 1), NCBI GenBank, M EU EU N EU EU M BLAST, OTUM6 OTUM7 OTUM11 OTUM14 OTUM18 N BLAST ; OTUN1 (Lactobacillus sakei), OTUN2 (Streptococcus agalactiae), OTUN6 (Brochothrix thermosphacta) 3 讨论 Lactobacillus Lactococcus Streptococcus Carnobacterium,,,, [12],,,,, (Brochothrix),, (Pseudomonas) (Shewanella),,, ;,, H 2 S TMAO,, (Shewanella) SSO(Specific Spoilage Organisms) [3],

6 : 69 Table 1 表 1 未包装冷却牛肉和保鲜膜包装冷却牛肉 16S rdna 文库 OTU 的系统发育分析 Information of 16S rdna clone library constructed from chilled beef with cling film and no packing Type of OTU Number of Clone Accession No. Most closest sequences Accession number of most closest sequence Similarity (%) OTUM1 9 EU Uncultured bacterium AY OTUM2 2 EU Vagococcus salmoninarum Y OTUM3 9 EU Acinetobacter sp. AB OTUM4 18 EU Brochothrix sp. AM OTUM5 7 EU Psychrobacter EU OTUM6 4 EU Bacillus subtilis EF OTUM7 8 EU Pseudomonas fluorescens AF OTUM8 7 EU Carnobacterium AY OTUM9 5 EU Staphylococcus sp. AB OTUM10 5 EU Shewanella sp. AF OTUM11 6 EU Lactobacillus sake AB OTUM12 1 EU Exiguobacterium DQ OTUM13 1 EU Rahnella sp. AJ OTUM14 3 EU Streptococcus agalactiae AE OTUM15 11 EU Lactococcus sp. AY OTUM16 1 EU Stenotrophomonas sp. AM OTUM17 2 EU Microbacterium EU OTUM18 1 EU Kocuria rosea EF OTUN1 26 EU Lactobacillus sakei AB OTUN2 6 EU Streptococcus agalactiae AE OTUN3 28 EU Lactococcus sp. AY OTUN4 18 EU Carnobacterium EU OTUN5 6 EU Uncultured bacterium EU OTUN6 16 EU Brochothrix thermosphacta AY (Staphylococcus), (Psychrobacter) (Microbacterium) [13],,,, [14] (Shewanella) (Staphylococcus) (Psychrobacter) (Microbacterium),,, [10], 4 结论 1), 2) Lactococcus Brochothrix Acinetobacter Psychrobacter Pseudomonas, Lactococcus Lactobacillus Carnobacterium Brochothrix 3) Lactobacillus Lactococcus Carnobacterium Streptococcus Brochothrix

7 70 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 参考文献 [1].., 2002, 4: 29. [2],,.., 2001, 1: [3] Gill CO. Extending the storage life of meats. Meat Science, 1996, 43(1): [4] Gill CO, McGinnis, M. Badoni. Use of total or Escherichia coli counts to assess the hygienic characteristics of a beef carcass dressing process. International Journal of Food Microbiology, 1996, 31(1): [5],.., 2000, 26(3): 1 5. [6],,,. DNA., 2005, 24(5): [7] Gerard. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Current of Opinion Microbiology, 1999, 2(3), [8],,,.., 2008, 48(4): [9] Chun-Lin Huang, Jiang-Yong Hu. Denaturing gradient gel electrophoresis polymorphism for rapid 16S rdna clone screening and microbial diversity study. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(1): [10] Good IJ. The population frequencies of species and the estimation of population parameters. Biometrika, 1953, 40(1-3): [11],,,. ( )., 2006, 27(4): [12],.., 2002, 28(5): [13],. :, 2003, pp [14] Elisabeth Borch, Marie-Louise. Bacterial spoilage of meat and cured meat products. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1), 征订启事 2009 年中科院微生物所期刊联合编辑部联合征订全面启动! ( 4 ), 55.00, 660 ISSN ; CODEN WSHPA ; BM67 ( 25 ), 65.00, 780 ISSN ; CODEN SGXUED 82-13; BM5608 ( 20 ), 48.00, 576 ISSN ; CODEN WSWPDI 2-817; BM413 ( 15 ), 80, 480 ISSN ; CODEN JXUUAE 2-499; Q723,. (100101) B401 ; (010) ; bjb@im.ac.cn

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