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1 五 肿 瘤 淋 巴 相 关 ( 一 ) Apcmin 小 鼠 肠 道 息 肉 肿 瘤 的 检 测 片 机 PBS 4% 多 聚 甲 醛 苏 木 精 伊 红 体 视 镜 显 微 镜 包 埋 机 切 片 机 展 不 同 背 景 下 的 Apc min/+ 小 鼠, 其 表 型 并 不 一 致, 最 好 选 择 C57BL/6 背 景 的 小 鼠 进 行 实 验 C57BL/6J-Apc Min/+ 小 鼠 具 高 度 自 发 肠 内 腺 瘤 正 常 饮 食 的 Apc min/+ 小 鼠 约 7 月 龄 死 亡 ; 高 脂 饲 料 喂 养 的 小 鼠 约 4 月 龄 死 亡 C57BL/6J-Apc Min/+ 小 鼠 因 肠 道 出 血 会 导 致 贫 血, 雌 鼠 约 20% 具 自 发 乳 腺 肿 瘤 Apc Min/+ 雄 鼠 可 育, 但 Apc min/+ 的 雌 鼠 因 为 健 康 问 题 不 能 维 持 妊 娠, 因 而 采 用 Apc min/+ 的 雄 鼠 进 行 繁 育 和 保 种 引 物 1. 小 鼠 鉴 定 Primer Sequence 5' -> 3' Primer Type oimr0033 GCC ATC CCT TCA CGT TAG Wild type oimr0034 TTC CAC TTT GGC ATA AGG C Common oimr0758 TTC TGA GAA AGA CAG AAG TTA Mutant 反 应 体 系 Reaction Component Volume (µl) Total Volume (µl) 10 X PCR Buffer mm dntp 3 10 um oimr um oimr um oimr U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 DNA 3 ddh 2 O 35.7 PCR 程 序 Step # Temp C Time Note min sec sec min repeat steps 2-4 for 35 cycles min hold PCR 结 果 157

2 2. 小 鼠 准 备 : 每 组 实 验 ( 如 不 同 基 因 型 或 给 药 组 ) 小 鼠 数 量 不 得 少 于 6 只, 对 照 组 必 须 是 同 年 龄 同 性 别 的 小 鼠 3. 处 死 小 鼠, 分 离 肠 管, 用 1XPBS 冲 净 肠 管 的 排 泄 物 / 消 化 物 残 渣 操 作 尽 量 小 心, 防 止 因 病 变 韧 性 变 差 的 肠 壁 破 裂 息 肉 / 肿 瘤 从 管 壁 的 脱 落 4. 纵 剖 开 肠 管, 粘 膜 层 朝 上, 平 铺 滤 纸 上, 以 4% 多 聚 甲 醛 固 定 约 3h 5. 体 视 镜 在 10 视 野 下 检 测 息 肉 数 目 及 直 径,( 图 A, 箭 头 示 息 肉 / 腺 瘤 ) 6. 固 定 后 的 肠 管, 卷 成 同 心 环 状 (Swiss roll method), 脱 水, 包 埋, 切 片 后 H&E( 图 B-E, 箭 头 示 息 肉 及 腺 瘤 )/ 免 疫 组 化 / 免 疫 荧 光 染 色 以 进 行 组 织 学 检 查 7. 统 计 分 析 : 肿 瘤 发 病 率 每 组 有 肠 道 肿 瘤 小 鼠 的 只 数 肿 瘤 的 多 发 性 每 只 小 鼠 平 均 息 肉 数 目 肿 瘤 大 小 息 肉 平 均 直 径 单 因 素 方 差 分 析,P< 0.05 认 为 具 有 显 著 性 差 异 158

3 159

4 ( 二 ) 带 荧 光 素 标 记 的 肿 瘤 细 胞 的 肿 瘤 实 验 带 荧 光 素 标 记 的 肿 瘤 细 胞 系 及 培 养 所 需 试 剂 等 荧 光 素 底 物 (D-Luciferin,15 mg/ml) 标 准 手 术 器 械 及 注 射 器 等 动 物 实 验 所 需 其 他 常 用 试 剂 ( 麻 醉 剂,4% 多 聚 甲 醛,PBS 等 等 ) 小 动 物 生 物 发 光 活 体 成 像 系 统 (Photon Imager) 1. 小 鼠 准 备 : 每 组 实 验 小 鼠 数 量 不 得 少 于 6 只, 对 照 组 必 须 是 同 年 龄 同 性 别 的 小 鼠 根 据 所 使 用 肿 瘤 细 胞 系 的 不 同 选 择 不 同 品 系 的 小 鼠 进 行 实 验, 例 如 人 来 源 的 肿 瘤 细 胞 需 要 使 用 免 疫 缺 陷 型 的 裸 鼠 或 者 SCID 小 鼠, 鼠 来 源 的 肿 瘤 细 胞 则 选 择 其 来 源 的 小 鼠 品 系 2. 培 养 并 收 集 肿 瘤 细 胞 用 于 皮 下 或 者 尾 静 脉 接 种 每 个 小 鼠 接 种 约 细 胞, 细 胞 悬 液 体 积 分 别 为 : 皮 下 接 种 120ul, 尾 静 脉 接 种 200ul 3. 纪 录 肿 瘤 大 小 ( 主 要 指 皮 下 接 种 的 肿 瘤 ), 等 小 鼠 出 现 明 显 肿 瘤 之 后 开 始 定 期 观 测 肿 瘤 大 小, 使 用 游 标 卡 尺 测 量 肿 瘤 大 小 并 纪 录 4. 肿 瘤 小 鼠 分 析 : 注 意 : 肿 瘤 小 鼠 的 分 析 时 间 根 据 不 同 肿 瘤 细 胞 系 的 不 同 而 有 所 差 异 分 析 步 骤 : 1) 腹 腔 注 射 荧 光 素 底 物 (D-Luciferin,15 mg/ml), 每 个 小 鼠 150 ul 2) 10 分 钟 之 后, 麻 醉 小 鼠 3) 5 分 钟 之 后 ( 底 物 注 射 15 分 钟 之 后 ), 将 小 鼠 放 入 活 体 成 像 系 统 进 行 成 像 4) CO2 窒 息 法 处 死 小 鼠, 采 集 小 鼠 组 织 以 用 于 组 织 学 分 析 5) 对 活 体 成 像 的 图 像 数 据 进 行 统 计 分 析 160

5 ( 三 ) 裸 鼠 肿 瘤 异 植 实 验 I. 建 立 裸 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 ( 以 贴 壁 细 胞 为 例 ) 肿 瘤 细 胞 和 该 肿 瘤 细 胞 适 用 的 细 胞 培 养 基,0.25% 胰 酶, 台 盼 蓝 染 液,4% 多 聚 甲 醛, 细 胞 计 数 板, 细 胞 计 数 器,1ml 注 射 器,0.45mm 注 射 用 针 头 1. 用 处 于 对 数 生 长 期 的 细 胞 进 行 注 射, 如 细 胞 状 态 不 好, 将 影 响 肿 瘤 形 成 2. 肿 瘤 细 胞 皮 下 接 种 量 为 每 只 小 鼠 2 105, 根 据 具 体 的 实 验 要 求 配 置 合 适 的 细 胞 浓 度 悬 液 贴 壁 培 养 的 肿 瘤 细 胞 消 化 后 在 1 PBS 磷 酸 缓 冲 液 中 配 成 10 悬 液,2 106/ml 3. 实 验 前 计 数 每 15cm 培 养 皿 中 细 胞 长 满 时 的 数 量, 从 而 估 算 模 型 建 立 需 要 培 养 多 少 盘 细 胞 4. 若 细 胞 重 悬 到 注 射 间 隔 的 时 间 大 于 15 分 钟, 建 议 将 细 胞 悬 液 置 于 冰 上 5. 注 射 时 可 将 裸 鼠 皮 肤 拎 起, 以 免 针 刺 入 肌 肉 层, 影 响 肿 瘤 的 分 离 进 针 需 较 深, 退 针 缓 慢, 防 止 细 胞 悬 液 溢 出 6. 皮 下 移 植 瘤 的 内 部 容 易 发 生 坏 死, 因 此 分 离 瘤 体 时 不 要 损 伤 包 膜 因 固 定 剂 较 难 透 过 瘤 体 的 包 膜, 用 4% 多 聚 甲 醛 固 定 的 时 间 要 大 于 1 周 1. 培 养 肿 瘤 细 胞 至 足 够 数 量 2. 培 养 的 细 胞 用 0.25% 胰 酶 37 度 消 化 3 分 钟, 用 含 10%FBS 的 培 养 基 终 止 反 应, 用 移 液 器 吹 打 分 离 成 单 个 细 胞 3. 吸 取 100 微 升 细 胞 悬 液 到 EP 管 内, 加 入 100 微 升 台 盼 蓝 染 色 液, 轻 轻 吹 打 混 匀,3-5 分 钟 ( 染 色 时 间 不 宜 过 长 ) 后 取 10ul 滴 板 计 数 于 大 方 格 内 计 数 未 被 蓝 染 的 细 胞 总 数 ( 蓝 染 细 胞 为 死 亡 细 胞 ) 即 为 活 细 胞 数 4. 将 余 下 的 细 胞 以 1000rpm 的 速 度 离 心 3 分 钟 后, 去 上 清 依 据 步 骤 3 计 算 的 细 胞 浓 度, 用 不 含 血 清 的 培 养 基 重 悬 细 胞 至 2.5x107/ml 浓 度 5. 将 细 胞 悬 液 分 装 于 灭 菌 的 EP 管 中,200ul/EP, 另 外 余 50ul 细 胞 悬 液 用 于 填 满 1ml 注 射 的 死 腔 ( 这 部 分 液 体 残 留 在 注 射 器 中 ) 161

6 6. 选 取 体 重 相 近 的 4~6 周 大 小 的 裸 鼠, 于 两 侧 皮 下 注 射 200ul 细 胞 悬 液 7. 小 鼠 皮 下 肿 瘤 接 种 : 将 小 鼠 从 笼 子 中 取 出, 轻 放 于 铁 网 格 之 上, 拎 起 颈 部 与 尾 巴 轻 轻 将 小 鼠 抓 起, 放 置 在 水 平 台 面 上 用 1 毫 升 注 射 器 吸 取 100 微 升 细 胞 悬 液, 注 射 于 裸 鼠 背 部 右 侧 皮 下 操 作 尽 量 轻 柔, 使 小 鼠 不 至 于 过 度 惊 吓 8. 接 种 完 毕, 将 裸 鼠 放 置 笼 中 独 立 喂 养 2 周 9. 每 隔 3~4 天 测 量 肿 瘤 的 最 长 直 径 (a) 和 最 短 直 径 (b), 按 照 公 式 :M=ab2/2 计 算 肿 瘤 大 小 10. 实 验 结 束 后, 处 死 小 鼠, 切 开 裸 鼠 皮 肤, 小 心 剥 离 皮 下 的 肿 瘤 组 织, 不 要 破 坏 肿 瘤 表 层 的 包 膜, 将 组 织 于 4% 多 聚 甲 醛 中 固 定 162

7 II. 裸 鼠 皮 下 接 种 肿 瘤 病 理 学 组 织 学 分 析 冰 冻 切 片 包 埋 游 标 卡 尺, 天 平, 手 术 剪, 镊 子, 多 聚 甲 醛,20% 蔗 糖 /PBS 溶 液,OCT 1. 肿 瘤 取 样 时 应 把 连 带 肿 瘤 的 皮 肤 一 起 保 留, 皮 肤 可 作 为 组 织 学 分 析 的 阳 性 对 照 区 2. 包 埋 肿 瘤 的 时 候 应 该 从 中 间 剪 开, 将 剖 面 向 下 包 埋 OCT, 这 样 的 切 面 既 有 靠 近 皮 肤 的 外 侧, 也 有 肿 瘤 内 侧 3. 固 定 液 的 选 择 应 该 根 据 具 体 的 实 验 要 求 来 确 定 多 聚 甲 醛 是 很 常 用 的 固 定 液, 适 合 进 行 免 疫 组 化, 免 疫 荧 光 等 方 面 的 实 验 ; 如 果 只 是 进 行 形 态 的 观 察 (HE 染 色 ), 可 以 选 用 Bouin s 固 定 液 ; 如 果 要 进 行 电 镜 分 析 的 小 体 积 样 品, 则 建 议 采 用 戊 二 醛 进 行 固 定 4. 肿 瘤 脱 水 时 间 应 达 到 24 小 时, 否 则 冰 冻 切 片 易 碎 1. 肿 瘤 体 积 测 定 : 用 游 标 卡 尺 分 别 测 量 肿 瘤 的 长 短 径, 利 用 公 式 V = π [d2 D] / 6 计 算 肿 瘤 体 积, 其 中 d 为 肿 瘤 的 短 直 径,D 为 肿 瘤 的 长 直 径 2. 肿 瘤 质 量 测 定 : 将 小 鼠 用 引 颈 法 处 死, 用 手 术 剪 和 镊 子 将 皮 下 肿 瘤 连 皮 肤 一 起 剪 下, 天 平 称 重 3. 肿 瘤 分 离 小 鼠 后, 放 入 至 少 10 倍 肿 瘤 体 积 4% 多 聚 甲 醛 在 4 固 定 过 夜 (8-12h) 4. 将 固 定 好 的 肿 瘤 样 本 放 入 装 有 1 PBS 的 50ml 试 管 中 进 行 清 洗, 清 洗 过 程 中 可 以 将 管 子 放 于 脱 色 摇 床 上, 用 较 低 的 速 度 轻 轻 摇 动, 摇 动 速 度 不 应 过 高 总 共 清 洗 3-4 次, 每 次 10-15min 5. 将 清 洗 完 毕 的 肿 瘤 放 入 至 少 10 倍 体 积 的 20% 蔗 糖 /PBS 中 脱 水, 在 4 度 放 置 小 时, 观 察 到 肿 瘤 沉 入 管 底 即 为 脱 水 完 成 6. 将 脱 水 好 的 肿 瘤 样 本 置 于 OCT 中 进 行 包 埋 包 埋 前, 使 用 铝 箔 折 成 小 盒 子, 包 埋 时 注 意 去 除 气 泡 将 纵 剪 开 肿 瘤 组 织 切 面 向 下 放 入 盒 底, 加 入 OCT 浸 没 过 肿 瘤,-80 度 冰 箱 存 放 163

8 III. 裸 鼠 接 种 肿 瘤 的 组 织 学 分 析 肿 瘤 的 冰 冻 切 片 APES OCT 载 玻 片 冰 冻 切 片 机 (Leica) 1. 在 切 片 时, 如 果 出 现 碎 片 的 情 况, 有 可 能 是 因 为 刀 片 不 太 锋 利 引 起 的, 所 以 我 们 一 边 建 议 选 择 新 的 刀 片 2. 为 了 更 好 观 察 肿 瘤 细 胞 形 态, 建 议 冰 冻 切 片 的 厚 度 选 在 8-10 微 米 3. 有 特 殊 观 察 需 要 的 片 子, 比 如 观 察 肿 瘤 内 血 管 的 形 态, 建 议 选 择 20 微 米 的 冰 冻 切 片 1. 将 冰 冻 的 包 买 好 的 肿 瘤 组 织 块 用 液 态 的 OCT 黏 在 切 片 机 样 品 架 上, 放 置 于 切 片 机 上 的 相 应 位 置, 安 装 上 新 的 刀 片, 根 据 切 片 的 要 求 调 整 角 度 位 置 等 2. 调 整 切 片 的 厚 度 至 实 验 所 需 的 厚 度, 对 于 肿 瘤 的 组 织 学 分 析, 一 般 选 用 8-10 m 厚 度 的 切 片 即 可, 调 整 防 卷 板 位 置 3. 选 用 8μm 厚 度 进 行 切 片, 将 2-3 个 连 续 的 切 片 放 置 于 APES 预 处 理 过 的 载 玻 片 上 4. 重 复 步 骤 3, 一 般 来 说, 连 续 切 取 10 片 冰 冻 切 片 即 可 5. 将 切 好 的 肿 瘤 切 片 置 于 室 温 晾 干 2 小 时 后, 置 于 -80 度 冰 箱 中 保 存, 以 待 用 来 进 行 一 系 列 的 组 织 学 实 验 164

9 IV. 裸 鼠 接 种 肿 瘤 的 组 织 学 分 析 H&E 染 色 Harris 氏 苏 木 素 染 液, 伊 红 染 液,0.25% 氨 水, 中 性 树 胶 ( 上 海 标 本 模 型 厂 ), 奥 林 巴 斯 正 置 显 微 镜 1. 苏 木 素 染 色 的 时 间 一 般 为 1-3min, 伊 红 的 染 色 时 间 一 般 为 30s, 但 要 根 据 染 液 使 用 的 时 间 长 久 来 决 定, 最 好 的 做 法 是 先 做 预 实 验 来 确 定 具 体 染 色 的 时 间 2. 所 有 操 作 在 通 风 橱 中 进 行 3. 所 有 染 缸 使 用 完 应 盖 紧 防 止 液 体 蒸 发 a) 肿 瘤 的 冰 冻 切 片 从 -80 度 冰 箱 中 取 出, 室 温 晾 干 2 小 时 1 PBS 洗 3 次, 每 次 10min b) 用 苏 木 素 溶 液 染 色 1-3min, 具 体 的 染 色 时 间 根 据 预 实 验 确 定 c) 将 切 片 用 自 来 水 洗 涤 2 次, 每 次 30s d) 将 切 片 放 入 0.25% 的 氨 水 中 返 蓝 30s, 在 碱 性 的 条 件 下, 苏 木 素 染 色 会 变 成 蓝 色 e) 将 切 片 用 自 来 水 洗 涤 2 次, 每 次 30s f) 切 片 通 过 不 同 浓 度 的 各 级 乙 醇 脱 水, 具 体 操 作 为 :50% 乙 醇 1min 75% 的 乙 醇 1min 85% 乙 醇 1min 95% 乙 醇 1min g) 将 切 片 放 入 伊 红 溶 液 中, 染 色 30s, 具 体 的 染 色 时 间 根 据 预 实 验 确 定 h) 将 切 片 继 续 脱 水, 具 体 操 作 为 :95% 乙 醇 1min 100% 的 乙 醇 1min 100% 乙 醇 1min i) 将 切 片 置 于 二 甲 苯 中 透 明 : 二 甲 苯 (A)2min 二 甲 苯 (B)2min j) 用 中 性 树 胶 封 片 封 片 时, 先 将 盖 玻 片 用 二 甲 苯 浸 泡, 然 后 再 封 片, 避 免 气 泡 k) 奥 林 巴 斯 正 置 显 微 镜 拍 照, 如 下 图, 为 4 10 倍 镜 检 照 片 165

10 ( 四 ) 血 管 淋 巴 管 染 色 实 验 I. 小 鼠 卵 黄 膜 (Yolk Sac) 血 管 染 色 PECAM-1 抗 体 Hamster anti mouse PECAM-1 monoclonal antibody (Chemicon, MAB1398Z), Cy3 or Cy5 (Jackson) conjugated secondary antibodies 标 准 手 术 器 械 动 物 实 验 所 需 其 他 常 用 试 剂 ( 麻 醉 剂,4% 多 聚 甲 醛,1XPBS 等 等, 牛 奶,Triton-X-100) 荧 光 体 视 镜 或 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 1. 怀 孕 9.5 到 15.5 天 孕 鼠, 解 剖 取 出 卵 黄 膜, 剪 一 小 块 留 用 Genotyping 2. 4% 多 聚 甲 醛 于 4 固 定 2 小 时 3. PBS 洗 两 次, 每 次 30 分 钟 4. 在 封 闭 液 (3% 牛 奶 在 0.3% PBS-TX 中 ) 中 室 温 处 理 1~2 小 时 5. 一 抗 4 孵 育 过 夜 :(PECAM-1 抗 体 1:1000 稀 释 于 封 闭 液 中 ) % PBS-TX 洗 4 次, 每 次 30 分 钟 7. 二 抗 稀 释 于 0.3% PBS-TX 中 (1:1000), 室 温 4 小 时 % PBS-TX 洗 4 次, 每 次 30 分 钟 9. 用 50% 甘 油 封 片 并 拍 照 166

11 II. 淋 巴 管 活 体 功 能 检 测 荧 光 解 剖 镜 (Leica MZFLIII), 异 硫 氰 酸 荧 光 素 偶 联 的 葡 聚 糖 (FITC-Dextran2000,Sigma), 三 溴 乙 醇 ( 麻 醉 剂 ),27G 注 射 器 ( 上 海 生 工 ), 热 台 小 鼠 耳 朵 较 薄, 注 射 时 需 小 心 谨 慎, 防 止 戳 穿 固 定 小 鼠 耳 朵 时, 不 能 太 紧, 防 止 血 液 淋 巴 液 不 流 通 三 溴 乙 醇 一 般 使 用 1.25% 的 工 作 溶 液, 使 用 剂 量 为 0.2ml/10g 小 鼠 体 重, 腹 腔 注 射, 防 止 过 度 麻 醉 致 死 如 果 需 要 长 时 间 拍 照, 需 要 用 热 台 保 持 小 鼠 体 温 1. 深 度 麻 醉 小 鼠 在 小 鼠 耳 朵 背 侧 远 端 注 射 2ul FITC-Dextran, 然 后 快 速 将 耳 朵 固 定 在 玻 璃 平 皿 上 在 小 鼠 尾 巴 近 尖 端 处 注 射 2ul FITC-Dextran, 将 小 鼠 尾 巴 自 然 放 置 2. 分 别 在 1 分 钟,5 分 钟,10 分 钟,20 分 钟,30 分 钟 时 在 荧 光 解 剖 镜 下 拍 照 167

12 III. 小 鼠 耳 朵 淋 巴 管, 淋 巴 管 瓣 膜 染 色 Rabbit-anti-mouse LYVE1 (Abcam), rabbit-anti-human Prox1 (Abcam), goat-anti-mouse Integrin-α9 (R&D), Alexa594-, Alexa488- orcy5-conjugated secondary antibodies (Molecular Probes) 三 溴 乙 醇,4% 多 聚 甲 醛,PBS, 牛 奶,Triton-X-100, 脱 毛 膏, 二 氧 化 碳 窒 息 机, 荧 光 解 剖 镜 (Leica MZFLIII), 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 (Olympus) 去 掉 耳 朵 中 间 的 软 骨 层 时, 一 定 要 剥 离 干 净, 防 止 抗 体 不 能 穿 透 脱 毛 时 间 不 要 超 过 五 分 钟, 防 止 破 坏 角 质 层, 造 成 多 聚 甲 醛 过 度 固 定 1. 二 氧 化 碳 窒 息 处 死 老 鼠, 取 下 耳 朵, 脱 毛 五 分 钟,PBS 洗 净,4% 多 聚 甲 醛 固 定 过 夜 2. 去 掉 耳 朵 中 间 的 软 骨 层, 固 定 在 平 板 上,PBS 洗 两 次, 每 次 30 分 钟 3. 封 闭 在 3% 牛 奶 ( 牛 奶 溶 解 在 0.3% PBS-TX) 中, 室 温 2 小 时 4. 一 抗 ( 稀 释 在 封 闭 液 中 )4 孵 育 过 夜 % PBS-TX 洗 8 次, 每 次 1 小 时 6. 二 抗 稀 释 于 0.3% PBS-TX 中, 室 温 4 小 时 % PBS-TX 洗 8 次, 每 次 一 小 时 8. 50% 甘 油 封 片 并 拍 照 168

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