核酸扩增检测结果的分析及阳性结果的确认程序

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施孙
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1 核酸扩增检测结果的分析及阳性结果的确认程序卫生部临床检验中心王露楠

2 血站与医院临床核酸扩增检测的差异血站临床实验室目的缩短检测窗口期感染性疾病的诊断和治疗监测测定下限定性测定, 越低越好定性或定量测定测定策略单人份或多人份混合单人份技术 PCR 和 TMA PCR+ 产物分析 ( 测序杂交等 ) 对标本制备的要求对标本必须进行核酸纯化, 且必须自动化对核酸纯化要求低, 多为手工操作对加样量和反应体积的要求应尽可能大, 决定了检测的敏感性稍低些 ( 相对于血站 ) 服务对象受血者被检者 ( 患者 )

3 血站核酸扩增检测国内目前所用的试剂及方法特点上海科华上海浩源中山达安 ROCHE Grifols 方法实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 多重实时荧光 PCR TMA 内标有有有有有 HBV HCV HIV 检测模式各指标分管检测 1) 分管检测 ; 2) 一管内多重 PCR, 但直接检测三项指标各指标分管检测一管内多重 PCR, 不能区分是何指标一管内联合检测先不区分, 反应性样本再行单个指标检测检测系统的组成 HAMILTON 混样仪提取仪实时荧光 PCR 仪 HAMILTON 混样仪提取仪实时荧光 PCR 仪 chemagicst AR 全自动核酸提取仪实时荧光 PCR 仪 HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor 混样仪 COBAS AmpliPrep Instrument 全自动核酸提取仪 COBAS TaqMan Analyzer 和 the Pooling and Data Management (PDM) Software TECAN 混样仪 ( 如混合样本 ) TMA 检测仪 ( 一管内完成提取扩增及杂交发光检测 )

4 实时荧光定量 PCR 检测的结果分析报告

5 线性基线期 (Linear base-line phase) 指数期初期 (The beginning of exponential phase) 指数期 (Exponential phase) 平台期 (Plateau phase)

6 Ct 值 (threshold cycle) 或 CP 值 (crossing point) 指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数

7 有内标的实时荧光 PCR

8 核酸实时荧光 PCR 检测结果三管三项 (HBV HCV HIV) 检测 : 分别报告阳性 ( 反应性 ) 或阴性 ( 非反应性 ) 一管三项检测 :(1) 不明确鉴别何种病毒报告反应性或非反应性 (ROCHE);(2) 多重多色荧光检测, 直接报告 HBV HCV 和 HIV-1 阳性或阴性

9 需要明确的几个概念检测下限灵敏度检测限 ( 最低检出限 )Limit of Detection,LoD 样本中可能被检出的分析物的最低数量 ( 通常指在常规的实验室条件下 >95% 的样本可被检出 ) 定量范围精密度准确度试剂检测系统

10 核酸检测 --- 检测系统的性能指标 HBV DNA Concentration (IU/mL) Number of Reactives Number of Individual Tests % Reactives 95% Lower Confidence Limit (one-sided) % 98.4% % 96.1% % 93.2% % 90.9% % 58.5% % 19.5%

11 TMA 结果 Relative Light Units (RLU) S/CO 比值 1.00 为反应性 ( IC 650,000 RLU ); S/CO 比值 < 1.00 为无反应 ( IC IC Cutoff, 同时, IC 650,000 RLU)

12 进一步鉴别检测应采用具有相应检测下限的试剂, 对不能鉴别 HBV HCV 和 HIV 检测反应性样本进行鉴别检测在目前情况下, 建议采用国产核酸扩增检测试剂进行鉴别检测

13 核酸检测 --- 检测系统的性能指标 HBV DNA Concentration (IU/mL) Number of Reactives Number of Individual Tests % Reactives 95% Lower Confidence Limit (one-sided) % 98.4% % 96.1% % 93.2% % 90.9% % 58.5% % 19.5%

14 乙型肝炎标志物检测结果分析面临的问题疾病本身 1. 感染的人口比例 :HBsAg 阳性 7.18% 2. 感染状态 : 多样性易变性 3. 预后 : 非活动性病毒携带者发展为慢性乙肝, 可能进展为肝硬化肝细胞性肝癌 ; 乙型肝炎病毒感染相关终末期肝病或肝细胞性肝癌导致每年万人死亡, 并且 5-10% 进行肝移植 4. 影响因素 : 宿主和病毒的因素, 包括和其他病毒的共感染饮酒肥胖都是影响疾病进程和治疗效果的重要因素

15 120 试剂方法的改进与局限 s-s- Loop 1 of a determinant 126 疫苗逃逸突变株 : F Y T126S M133L D144E 诊断逃逸突变株 : P120T/A/Q T131K T131N K141E G145R D144A G145R s--s s-s s-s G R D 144 E Loop 2 of a determinant (Carman, W. J Viral Hepatitis : 11-20, modified) 164 D E 210 抗病毒耐药突变株 I195M M198I M 198 W196S I 195 M W 196 S I

16 试剂方法的改进与局限核酸检测定性检测定量检测主要通过对乙肝患者血中 HBV DNA 基线水平和变化情况的监测, 用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测最低检出限 :95% 以上阳性检出率的病毒水平作为最低检出限线性范围? 准确定量的范围?

17 检测项目的意义

18 慢乙肝中 HBsAg 和 HBV DNA 的意义不同 HBV DNA HBsAg 检测物 Dane 颗粒 Dane 颗粒和亚病毒颗粒病毒学反映 HBV 病毒的复制情况反映的是 cccdna 的水平临床意义是否抑制病毒复制感染的肝细胞的免疫清除

19 HBV 隐匿性感染的定义肝脏有 HBV DNA 复制且血清中未检测到 HBsAg( 血清中 HBV DNA 或有或无 ) 有别于窗口期一般都为 HBcAb 阳性 ( 其中约 50%HBsAb 也为阳性 ) 很少一部分为单独 HBsAb 阳性没有抗体的初期隐匿性感染 Raimondo et al, J Hepatol 2009

20 HBV 感染后血液中指标的出现

21 隐匿性 HBV 感染的不同状况 1. 既往 HBV 感染可表现为 HBV DNA 和抗 HBS 阳性 ; 或 HBV DNA 和抗 HBc 阳性, 但抗 HBS 水平低于可检测水平 2. 急性 HBV 感染恢复期 HBsAg 阴性, 但抗 HBS 尚未出现, 此时仅抗 HBc 阳性. 3. 慢性 HBV 感染 HBV DNA 阳性, 但存在免疫逃逸突变, 不能被患者体内的抗 HBs 及常规诊断试剂中的抗 HBs 单克隆抗体识别 ; 或者无免疫逃逸突变, 但血清学标志物均为阴性, 而 HBV DNA 阳性 4. 无症状 HBV 携带者, 无免疫逃逸突变, 但抗 HBc 阳性, 抗 HBe 阳性或阴性 ; 或 HBV DNA 阳性, 但血清学标志物均为阴性

22 实验室检测指标 HBcAb 和 HBV DNA HBV DNA 含量全部阴性单独 HBsAb 阳性 HBcAb 阳性 IU/ml IU/ml IU/ml IU/ml 56( IU/ml) 11 ( IU/ml) 20 ( IU/ml)

23 实验室检测指标 HBcAb? HBV DNA 结果全部阴性单独 HBsAb 阳性 HBcAb 阳性阳性例数 % 阴性例数 %

24 乙型肝炎标志物检测结果分析表面抗原阳性核酸阳性表面抗原阴性没有表面抗原核酸阳性可能为多种感染状况 : 窗口期慢性乙肝.. 血清学检测是重要的验证和补充实验 HBsAb 和 HBcAb 是重要指标

丙型肝炎标志物检测结果分析 HCV RNA 阳性和阴性的样本的化学发光检测结果 S/Co 分布 400 350 300 250

25 丙型肝炎标志物检测结果分析 HCV RNA 阳性和阴性的样本的化学发光检测结果 S/Co 分布 RNA 阳性总数 RNA 阴性总数 >20

27 HCV 感染的特点我国一般人群抗 -HCV 阳性率为 3.2%; 各地抗 -HCV 阳性率有一定差异, 以长江为界, 北方高于南方 ; 随年龄增长而逐渐上升 ; 男女间无明显差异 HCV 传染源包括患者和隐性感染者, 传播途径多种多样, 包括 : 1. 血液传播, 如注射毒品输血或血制品血液透析器官移植等 2. 经破损的皮肤和黏膜传播, 这是目前最主要的传播方式 3. 母婴传播 4. 性接触传播部分 HCV 感染者的传播途径不明接吻拥抱喷嚏咳嗽食物饮水共用餐具和水杯无皮肤破损及其他无血液暴露的接触一般不传播 HCV

28 中国部分农村地区 HCV 流行率亦较高

29 HCV 感染者的疾病进展与预后丙肝起病隐匿, 部分患者无明显症状, 30% 慢性丙肝患者 ALT 正常丙肝感染的慢性化率非常高, 并且将导致肝硬化肝癌等严重后果 50~ 80% 慢性 HCV 感染 60~ 70% 慢性肝脏病变 5~20% 肝硬化 1~5% 死亡 FAQs for Health Professionals.

30 中国临床报告丙肝病例逐年递增中国报告的丙肝例数近 9 年增长 8 倍

31 丙型肝炎面临的挑战全球性的公共卫生的问题肝脏疾病的最重要的原因全球性流行性疾病不确定的传播方式输血, 不洁注射, 母婴传播, 医源性感染, 性传播等 30% 感染者感染途径不明隐匿的杀手 50-90% 感染者无症状 >30% 感染者 ALT 正常通常在筛查中发现进行性疾病 55-85% 的感染者会发展为慢性感染

32 HCV 感染后血液中指标的出现 HCV Ag HCV Ag 图片来自 ABBOTT

33 HCV 感染的诊断指标诊断急性和慢性 HCV 感染通常需要检测特异性血清抗 - HCV 和 HCV RNA 急性与慢性 HCV 感染的鉴别主要依靠临床表现 : 即症状或黄疸的出现时间, 既往是否有 ALT 升高史及其持续时间目前尚无证据说抗 -HCV 是保护性抗体, 抗 -HCV 存在仅表明有 HCV 的感染 HCV RNA 为丙型肝炎早期诊断最有效指标在急性丙型肝炎过程中,HCV RNA 可以由阳性转阴性

34 HCV 感染诊断实验的选择方法筛查确诊治疗否疗效评估持久性应答预测 ALT Anti-HCV RIBA HCV RNA 基因分型

35 HCV 感染诊断的实验选择血清学检测 -- 目前主要开展的是检测抗 -HCV 1. 筛选试验 : 主要采用 ELISA 法, 用重组或合成丙肝病毒多肽 ( 如 C22 NS3 NS4 NS5 非结构蛋白 ) 作为包被抗原第三代 ELISA 试剂盒是以 C22 C33 以及 NS5 区的 3 种蛋白为抗原, 敏感性和特异性得以提高, 但仍未解决在 ALT 正常者健康献血者存在假阳性问题抗 -HCV ELISA 阳性反应者, 特别是一些不具明显危险因素者, 需用确认试验来排除假阳性反应

36 HCV 感染诊断的实验选择 2. 确认试验 : 目前常用的是条带免疫法 (Strip Immunoassay, SIA), 或者是重组免疫印迹法 (Recombinant Immunoblot Assay, RIBA) 该实验主要用于 ELISA 初筛检测可疑者, 能帮助区别特异性 HCV 抗体和非特异性反应该法将 HCV 重组抗原以条带的形式包被在硝基纤维素膜上, 分别与待检血清和酶标抗体温育, 显色判断第三代 RIBA 试剂增加了 HCV 抗原表位, 如果两条带或以上阳性反应, 则确认试验为阳性目前美国 CDC 推荐的策略是检测 HCV RNA

37 建议确认流程

38 丙型肝炎标志物检测结果分析核酸无法取代弱抗体阳性的检测抗体弱, 核酸含量低或没有窗口期感染不一定伴随 ALT 升高后续随访和就诊建议是对献血者最好的关爱

39 HIV 标志物检测结果的分析 HIV-RNA HIV RNA +, anti-hiv window period 164 (2.53%) 6280 (96.8%) HIV RNA +, anti-hiv + concordant anti-hiv HIV RNA, anti-hiv + elite controller 43 (0.66%) 63/164 (38.4%) HIV-Ag HIV-Ag-, RNA+ infections avoided (1:37,619) 39 in first time donors (0.81%)* 3 in lapsed donors (0.36%) 1 in repeat donor (0.12%)* * p=0.029 (preseroconversion interval 310 days)

40 典型的初发 HIV 感染

41 典型的初发 HIV 感染

42 HIV 标志物检测结果的分析窗口期感染 : 检测另一来源的样本 ( 随访 ) 单试剂阳性 / 双试剂阳性 : 单人份检测核酸来确认

DNA PCR 3 3. TaqMan 2 SYBR

DNA PCR 3 3. TaqMan 2 SYBR PCR PCR 1996 Applied Biosystems PCR PCR PCR. PCR PCR PCR PCR 1. PCR Ct C Cycle t threshold Ct 1 1. Ct 2. threshold PCR 15 3-15 10 threshold = 10 SD cycle 6-15 3. Ct Ct 1 Ct Ct 2 Ct 2. 4. PCR 2 1 TaqMan