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1 密级 : 秘密学号 :T 硕士学位论 文 复方益精胶囊的药学研究 研究生指导教师学科专业所在学院毕业时间 于艳芳陆兔林教授中药学药学院 2010 年 6 月

2 Pharmaceutical Study of Compound Yijing Capsule A Dissertation Submitted for the Master s Degree Candidate: Adviser: Yu Yanfang Prof. Lu Tulin Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, China

3 学号 :T 硕士学位论文 复方益精胶囊的药学研究 作者姓名 于艳芳 申请学位级别 医学科学学位 指导教师姓名 陆兔林 职 称 教授 学科专业 中药学 研究方向 中药新药及复方质量标准研究 学习时间自 2007 年 09 月 01 日 起至 2010 年 06 月 20 日止 论文提交日期 2010 年 04 月 15 日 论文答辩日期 2010 年 06 月 05 日 学位授予单位南京中医药大学学位类型医学科学硕士学位

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5 原创性声明 本人郑重声明 : 所呈交的学位论文, 是本人在导师的指导下, 独立进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外, 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体, 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者 ( 需亲笔 ) 签名 : 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定, 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅 本人授权南京中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索, 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密, 在年解密后适用本授权书 本学位论文属于不保密 ( 请在以上方框内打 ) 学位论文作者 ( 需亲笔 ) 签名 : 年月日 导师 ( 需亲笔 ) 签名 : 年月日

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7 目录 中文摘要...I ABSTRACT...III 前言...V 第一部分绪论 少 弱精症概述 西医对少 弱精症的认识 中医对少 弱精症的认识 复方益精胶囊项目背景 复方益精胶囊各组成单味药研究概况...9 第二部分药学实验研究 复方益精胶囊原料来源及鉴定依据 复方益精胶囊制剂工艺研究 剂型选择 醇提工艺研究 水提工艺研究 精制工艺研究 浓缩工艺研究 干燥工艺研究 制剂成型工艺研究 中试工艺研究 工艺流程图 复方益精胶囊质量研究 性状 鉴别 检查 淫羊藿苷的含量测定 复方益精胶囊质量标准 ( 草案 ) 复方益精胶囊初步稳定性研究 加速稳定性试验研究 长期稳定性试验研究 第三部分小结 讨论与创新点 小结 讨论 创新点...71

8 第四部分参考文献...73 攻读硕士期间取得的学术成果...77 致谢...78

9 南京中医药大学硕士学位论文 复方益精胶囊的药学研究 中文摘要 少 弱精症是引起男性不育的主要原因 临床上西医多采用激素治疗, 疗效不理想且副反应较大 复方益精胶囊是选用临床用于少 弱精症治疗的多年验方, 根据处方药物所含的活性成分, 遵照医院制剂原方, 选择服用 携带 贮藏 运输 生产方便的胶囊制剂 本课题是在中医药理论的指导下, 按照国家食品药品监督管理局 (SFDA) 有关中药第 6 类新药技术要求, 对原料药 制剂工艺 质量标准和初步稳定性进行研究 制剂原料研究部分 : 按照 中国药典 2005 年版一部有关规定, 对制剂原料的来源及品质进行鉴定, 结果均符合规定 制剂工艺研究部分 : 以阿魏酸 黄芪甲苷含量为指标, 采用 L 9 (3 4 ) 正交试验对当归 黄芪 水蛭 王不留行的醇提工艺进行研究, 得最佳醇提工艺为加饮片总量 18 倍量的 70% 乙醇分两次提取, 每次 1.5 小时 并进行醇提最佳工艺的验证 ; 以淫羊藿苷及总多糖含量为指标, 采用采用 L 9 (3 4 ) 正交试验对淫羊藿 熟地黄 紫河车 黄精 沙苑子的水提工艺进行研究, 得最佳水提工艺为加饮片总量 20 倍量的水分两次煎煮, 每次 2 小时 并进行水提最佳工艺的验证 ; 以淫羊藿苷及总多糖含量为指标, 对水提醇沉精制工艺进行考察, 确定最佳精制工艺为将水煎液浓缩至相对密度为 1.05~1.08(60 ), 加乙醇至含醇量达 50%, 冷藏 48 小时 滤过 ; 以淫羊藿苷 黄芪甲苷含量为指标, 考察浓缩 干燥工艺条件, 确定浓缩 干燥条件为将上述醇提液和水提醇沉液合并, 经 0.08Mpa 60 减压回收乙醇并浓缩至相对密度为 1.10~1.15(60 热测 ) 的稠膏, 稠膏再经 0.080~0.085Mpa 65~75 真空干燥得干燥的浸膏粉 ; 以制粒难易和流动性为指标考察了制剂成型工艺, 确定成型工艺为浸膏粉加 1.2% 的微粉硅胶混合均匀,95% 乙醇适量制粒, 干燥 整粒 灌装胶囊, 即得 在上述试验基础上, 进行了三批中试工艺研究, 淫羊藿苷的转移率均为 60% 以上, 证明工艺可行 质量标准研究 : 以中试样品进行质量标准研究, 通过观察确定了本品的性状 采用薄层色谱鉴别法, 以对照品 对照药材及相应的阴性制剂为对照, 建立了制剂中淫羊藿 当归 黄芪 王不留行 紫河车的定性鉴别方法 依据 中国药典 2005 年版一部附录 ⅠC 胶囊剂项下有关规定对中试样品的水分 崩解时限 装量差异 微生物限度等进行了相应的检查 结果均符合规定要求 采用高效液相色谱法对复方益精胶囊中的淫羊藿苷进行含量测定, 并对此含量测定方法进行方法学研究, 结果线性方程为 Y= X-10.86; 相关 I

10 中文摘要 系数 r=0.9997; 平均回收率为 97.2%,RSD=1.75% 稳定性研究 : 按 SFDA 药品审评中心颁布的 中药 天然药物稳定性研究指导原则 的相关要求, 对三批中试样品进行了加速和长期稳定性考察, 经加速稳定性试验 6 个月和长期稳定性试验 24 个月考察, 本品的各项考察指标均符合质量标准的规定, 所以本品的有效期定为 24 个月 研究结果表明本文研究的复方益精胶囊制剂工艺合理 可行 通过对中试样品质量研究制订的质量标准科学 合理 可行 稳定性研究结果表明成品质量稳定 关键词 : 复方益精胶囊 ; 淫羊藿苷 ; 制备工艺 ; 质量标准 ; 初步稳定性 II

11 南京中医药大学硕士学位论文 The Pharmaceutical Study of Compound Yijing Capsule Abstract Oligoazoospermia is the main cause of male infertility. The hormone therapy is often used in western medical treatment. However, this clinical application leads to more side effects. According to the clinical empirical prescription, Compound Yijing capsules, which are easy to take, carry, store, transport, and manufacture, are chose for the treatment of oligoazoospermia. Guided by Traditional Chinese Medicine theory, the subject of this thesis is to study the preparation, quality specification and stability in accordance with the demands of the sixth new drug technical requirement of the SFDA. Preparation: The orthogonal method was used to study the extraction technology. The optimization of extraction process of radix angelicae sinensis, radix astragali, leech, semen vaccariae based on the content of ferulic acid and astragaloside Ⅳ was as follows: 18 volumes of 70% alcohol were divided into two parts and to reflux for 1.5 hours each time. The optimization of extraction process of herba epimedii,radix rehmanniae preparata,placenta hominis, solomonseal rhizome, solomonseal rhizome, semen astragali complanatibased on the content of icariin and total polysaccharides was as follows: 20 volumes of water were divided into two parts and to reflux for 2 hours each time. The optimization of water extracting and alcohol precipitation techniques based on the content of icariin and total polysaccharides was as follows: the decoction was concentrated to the relative density of 1.05~1.08 (60 ), ethanol was added to 50% capacity and was kept in cold preservation for 48 hours, and then filtered. The optimization of drying process based on the content of icariin and astragaloside Ⅳ was as follows: the extraction solutions were combined and concentrated by vacuum drying at Mpa at 60 to the relative density of 1.10 ~1.15. The thick pastes were then dried under vacuum at ~ 0.085Mpa at 65 ~ 75 to obtain extract powder. The optimization of the preparation process based on flowability was as follows: 1.2% colloidal silicon dioxide as flow agent were added to powder, 95% ethanol was added to the extract powder to make wet granules and then dried and screened, filled into capsules. Quality specification: The scale-up products were used in this research. The characterization of properties, water content, disintegration test and microbial limit were checked according to Chinese Pharmacopoeia (2005). The quality differentiation methods of herba epimedii, radix angelicae sinensis, radix astragali, cowherb seed and dried human placenta were established. The III

12 Abstract HPLC method for the final product has been established to determine the content. The method showed a good linear relationship. The recursive equation was: Y= X-10.86, r= The average recovery was 97.2% with RSD 1.75%. Stability: According to the established quality specification, three batches of capsules were tested under the condition of accelerated stability test for 6 months and long-term stability test for 24 months. The results showed that the capsules were stable under above-mentioned condition. The results showed that the process of the preparation is reasonable and feasible, the quality can be controlled, and the product quality is stable. KEY WORDS: Compound Yijing capsule;icariin; Preparation;Quality standard;preliminary stability IV

13 南京中医药大学硕士学位论文 前言 精子的产生是一个复杂的过程, 临床中少 弱精子症不是一个孤立的病症, 是多种疾病和因素引起的一种结果 目前西医对少 弱精子症的病因研究取得了一定的进展, 但尚缺乏有针对性的 疗效明确的药物, 临床用药多为激素, 以生殖内分泌调节为主, 效果不明确, 且副作用大 中药治疗少 弱精子症有悠久的历史, 有很多可以借鉴的资料, 因此在中医药领域进行深入的研究开发是寻求少 弱精子症治疗方法的一条有效途径, 也是当今的一个热点研究领域 本课题所研制的复方益精胶囊来源于老中医的经验方, 作为医院制剂在临床上已经使用多年, 临床应用安全有效 通过开发具有良好临床疗效的 复方益精胶囊, 不仅具有良好的社会效益, 而且能进一步开发为临床新药, 发挥其良好的经济效益 复方益精胶囊由淫羊藿 当归 黄芪 紫河车 熟地黄 黄精 水蛭 沙苑子 王不留行 ( 炒 ) 九味药组成, 其中淫羊藿 紫河车 沙苑子补肾中阳气, 使阴得阳而源泉不绝 ; 当归 熟地黄 黄精养血填精, 补气养阴, 补肾中阴精不足 ; 黄芪益气行气 振奋脾阳, 化生气血精源, 为全方的动力 ; 王不留行活血通经 水蛭破血逐瘀, 共奏疏肝理气 活血化瘀之功 ; 方中诸药合用, 阴阳双补 脾肾同治 养血活血同用 健脾益气共存, 共收滋阴补肾 活血通络 生精助阳之功 原医院制剂已在临床应用多年, 证明其安全有效, 所以对其进行深入研究和开发, 研制出服用方便, 质量可控的现代中药剂型是临床的迫切需要 本课题拟在遵从原制剂的基础上 在中医药理论的指导下, 根据 药品注册管理办法 及相关技术指导原则中有关中药新药注册分类第 6 类的要求, 开发出适应临床需求的复方中药胶囊 V

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15 南京中医药大学硕士学位论文 1 少 弱精症概述 1.1 西医对少 弱精症的认识 第一部分绪论 不育症是男科的常见病 疑难病之一 据统计, 全世界育龄夫妇中, 不育者约占 15%, 而不育因素在男方者约为 40% [1] 我国不育症的发病率在 10% 左右, 而男性生育能力缺陷所致不育者不少于不育夫妇的 50% [2] 男性不育症中, 少 弱精子症占很大的比例, 其中弱精子症占 30~60% [3] 国家计划生育委员会的调查也表明, 目前不同人群男性精液质量的各项指标, 比 WHO 规定和 80 年代初期的数据低 l 个级别, 以亚临床表现为主 [4] [5] 根据 WHO 的标准, 少精子症是指禁欲 2~7 天一份精液电脑分析中精子密度 < /L 轻度少精子症: 精子密度 < /L, 但 > /L; 中度少精子症 : 精子密度 < /L, 但 > /L; 重度少精子症 : 精子密度 < [4] /L 弱精子症是指禁欲 2~7 天一份精液电脑分析中具有快速向前运动的精子 A 级和慢速向前运动的精子 B 级 (A 级 +B 级 ) <50% 或 A 级精子 <25% 轻度弱精子症:A 级 +B 级精子 <50%, 但 >30% 或 A 级 <25%, 但 >10%; 中度弱精子症 :A 级 +B 级精子 <50%, 但 >30%, 其中 A 级精子 <10%; 重度弱精子症 :B 级 +C 级精子 <30%, 其中 A 级精子为零 病因病理精子的产生是一个复杂的过程, 因此少弱精症的病因比较复杂, 大多难以肯定, 可总结为以下几种 : (1) 遗传因素研究表明, 细胞遗传学异常可致男性不育, 文献报告其发生率为 2%~21% [1] 染色体结构异常 数目异常和性分化异常等均可造成精子的异常和男性不育 随着分子生物学技术的迅猛发展, 有关少精 无精症的遗传缺陷研究成为当今研究热点之一 1976 年,Tiepolo [6] 等首先提出 Y 染色体上有多个基因参与生精过程, 无精症患者有 Y 染色体长臂 (Yq11) 缺 [7] 失, 故称该部位为无精子因子 (a-zoospermia factor,azf) 随后 Vogt 等证实 Yq11 突变常发现于不育男性, 并伴有无精子症或严重少精子症, 分 3 个独立位点, 即 AZFa AZFb AZFc, 其中 AZFa 缺失表现为唯支持细胞综合征 ;AZFb 缺失表现为生精阻滞 ;AZFc 缺失的病理表现从正常到无精子 AZFd 病理表现同 AZFc AZF 并不是单一的基因而是在功能上相互 [8] 关联的基因家族, 在精子发生 发育和成熟中发挥重要作用 Kao 等报道线粒体 DNA 4977 bp 的缺失与精子活力呈负相关 非阻塞性无精子症约占男性不育的 12%, 近年研究发现这部分患者有染色体或基因异常, 如 Y 染色体上无精子症基因突变 缺失或 X 染色体上雄激素受体基因突变致生精障碍 [9] 目前, 许多新基因的研究尚处于转基因动物阶段, 因此, 这一复杂机制的完全揭示及相应预防措施的推出还需要一个过程, 随着科技的发展和人类基因组计划的实施, 遗传因素与男性不育的奥秘终将揭示 [10] (2) 内分泌因素生殖功能有赖于下丘脑 - 垂体 - 睾丸性腺轴功能生理调节, 各种原因引起性腺轴功能紊 1

16 第一部分绪论 乱可致男性不育 精子生成受激素调控, 下丘脑以脉冲式分泌促性腺激素释放激素 (gonadotropic releasing hormone, GnRH), 刺激垂体产生促性腺激素 (Gn) 即黄体生成素 (LH) 和卵泡刺激素 (FSH),LH 作用于睾丸间质细胞, 促使类固醇类激素生成,FSH 则主要作用于睾丸支持细胞 ; 睾酮 (T) 对 Gn 生成有负反馈作用, 在精子生成过程中作用重要 严重低促性腺激素症可引起性幼稚症 垂体功能不足症 高催乳素血症等, 使男性生育能力低下并可伴发继发性阳萎 肾上腺疾病 甲状腺疾病 糖尿病等均可影响性腺轴系统, 导致生精功能异常 [10] (3) 免疫因素精子表面有多种与生育相关或无关的特异性抗原和非特异性抗原, 可诱导机体产生抗精子抗体 在男性, 目前一般认为曾经接受过输精管结扎 性病 泌尿道感染 睾丸损伤 精索静脉曲张 隐睾症甚至疝气 阑尾切除术等任何化学 物理或感染因素造成的血睾屏障及生殖道免疫屏障的损伤都可引起抗精子抗体的产生, 抗精子抗体主要通过精子制动及精子凝集 死亡等作用减弱生育能力 (4) 环境 职业因素环境对生育力影响男性比女性更敏感 由于在精子发生 形成和精子变形过程中, 细胞质脱逸, 胞浆中 DNA 修复酶丢失, 使 DNA 损伤与修复系统机能随之丧失, 使其并不能象体细胞与卵细胞那样能够修复 90% 以上的原发性遗传物质损伤 生殖细胞较其它各种细胞对有毒物质更为敏感, 因为生精细胞始终处于快速分裂状态, 各种因素所致损伤很容易在细胞分化终端产物精子中蓄积, 导致精子质量降低 [4] 环境中电离和非电离辐射 铅 镉 汞 锰等重金属及其金属化合物 苯及同系有机物 甲醛 氟及高分子含氟单体等影响精子发生和精液质量 司机职业与精液质量异常具有显著相关性, 且随着开车年限延长, 对精液质量影响呈上升趋势, 主要表现在精子活力 精子畸形率 精子密度等指标 [11] (5) 其它因素临床常用的一些药物抑制精子发生, 影响生育功能, 如中枢降压药 抗肿瘤药 甾体类药 镇静剂等药物影响精子生成和成熟 微量元素如锌缺乏也有可能影响精子的质量 [12] 不良生活习惯影响精液质量, 如每天吸烟 20 支以上可使精液量 精子密度以及精子活动力减少或下降 [13] 治疗进展 (1) 药物治疗药物治疗患者易接受 依从性好, 但因为目前尚缺乏对生精缺陷和提高精子质量有效的治疗药物, 药物治疗大部分是非特异性治疗, 机理仍集中在调节生殖内分泌机制方面 GnRH 脉冲疗法用于治疗下丘脑性低促性腺激素血症性腺功能低下如 Kallmann 综合征, 性腺功能低下所致少精子症 GnRH 脉冲疗法既可以刺激雄激素生成, 也可以刺激生精功能 [14] [15] Kawakami 等在生精功能障碍狗模型中注射 GnRH 类似物, 发现在第一次注射后 5-7 周精子数量和活力明显提高 GnRH 可能作为一种有前景的药物在以后受到重视 2

17 南京中医药大学硕士学位论文 Gn 替代疗法对于大部分低促性腺激素血症, 包括 GnRH 的基因缺陷,LH 和 FSH 合成 分泌不足或受体功能缺陷等都有明显的治疗效果 Gn 替代疗法的药物有人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotrophin, HCG) 或人绝经期促性腺激素 (human menopausal gonadotropin, HMG) 和纯 FSH Gn 治疗的男性不育症患者, 即使精子数量很低, 也有妊娠的报道 [5], 但由于诸如乳房女性化和精子发生障碍等副反应严重, 阻碍了其应用 [16] 抗雌激素药物作用机理是在下丘脑和垂体竞争性结合雌激素受体, 雌激素的负反馈作用被有效抑制, 导致 GnRH FSH LH 分泌增加,FSH LH 等刺激间质细胞使局部睾酮 (TT) 产生增加, 有利于精子发生 常用药物为克罗米芬 他莫昔芬 然而由于病因复杂, [17] 单一用药远期疗效欠佳 李欣等将 60 例特发性少弱精症患者随机分成 Tc 组 ( 他莫西芬组 ) Tu 组 ( 十一酸睾酮组 ) 及 TT 组 ( 他莫西芬和十一酸睾酮联合应用组 ), 各 20 例, 分别接受他莫西芬 十一酸睾酮 他莫西芬和十一酸睾酮联合应用, 治疗 1 个月后,TT 组精子的数量 活力及功能明显改善, 血清中 FSH LH 水平升高,T 水平变化不大 ;3 个月后, 精子的数量 活力及功能等显著提高, 血清中 FSH LH T 水平明显升高, 均显著 [18] 优于 Tc 组及 Tu 组 (P<0.01 或 P<0.05) Adamopoulos 等通过随机对照实验用枸橼酸他莫昔芬和十一酸睾酮联合治疗特发性少精子症患者, 发现枸橼酸他莫昔芬可明显提高少精症患者的生育力 其它药物包括雄激素 多巴胺激动剂阻断 糖皮质激素 维生素与微量元素等非特异性治疗对提高精子质量有一定的效果, 但临床证明对于怀孕率没有明显提高, 目前这些药物应用有限 近年来也有报道用重组人生长激素 肉毒碱等治疗少弱精子症取得一定的疗效, 但由于价格等因素, 临床应用并不广泛, 尚缺乏大规模的临床资料 [5] (2) 手术治疗主要针对精索静脉曲张 (Varicocele, VAC) 的病人, 治疗方法主要有硬化疗法 栓塞疗法和外科手术, 具体方法因专科医生经验而异 但目前对于治疗 VAC 能否改善精液参数仍有争议 对于生殖道梗阻的不育病人, 必须首先考虑是否可行精道重建的手术治疗, 手术效果不理想再行人工辅助生育治疗 而无张力吻合术和机器人显微外科手术的应用将进一步提升手术成功率 (3) 辅助生殖技术 (ART) [5] ART 是为生殖功能障碍的夫妇提供的非自然的辅助生育技术 最早的 ART 可以追溯到 1790 年,John Hunter 为严重尿道下裂患者的妻子行配偶间人工授精并获得成功 自从 1992 年开始采用精子卵浆内注射技术 (ICSI) 治疗弱精子症 少精子症获得成功妊娠以来, 该技术作为治疗男性不育的方法, 在世界上普遍被采用, 严重不育男性因素, 即无精子症的治疗和预后得到根本改变 但由于 ICSI 跨越自然生产过程, 存在遗传危险性, 故着床前遗传学诊断 (PGD) 十分重要 [5] (4) 基因治疗 基因疗法目前还难成为治疗男性不育的有效手段, 因为对特异性的基因缺陷缺乏清晰 3

18 第一部分绪论 的认识 ; 基因损伤导致男性不育的实质还不十分清楚 目前对其机理仍需进一步探究 随着基因芯片技术的发展, 运用基因芯片能够对精子发生所涉及的普通基因和睾丸特异基因进行大规模筛选, 能够显示一系列与生殖相关基因缺陷, 从而能够在分子水平上全面了解精液异常 总之, 西医对少 弱精子症的治疗缺乏有效的针对性药物, 现有的激素治疗存在效果不确切 副作用大等缺点, 而一些新技术尚不能广泛应用 而运用现代科学技术, 结合传 统中医理论, 合理分析研究传统经验方, 是治疗少 弱精子症的一条重要途径 1.2 中医对少 弱精症的认识 传统中医典籍中, 虽无少 弱精症一词, 但在其中 精少 精薄 泛嗣 就相当于现代医学中的少 弱精症 病因病机 [3] 徐波等对中医药典籍进行了总结, 认为传统中医理论中, 早就有了有关 精气 与男子生育的机制, 精气 不足 ( 相当于精子活力下降 ) 与男子不育病因病机的论述, 其论述与现代医学少 弱精子症极其相似, 并记载了大量治疗男子不育的实践经验 中医第一部医学经典 内经 对男性生育生理就有经典论述 : 丈夫二八肾气盛, 天癸至, 精气溢泻, 阴阳和, 故能有子 指出肾所藏精气充足, 阴阳和谐是男子具备正常生育能力的生理基础 其所谓 精气, 包括了 精 和 气, 物质与动能两个部分, 精 是男子生殖繁衍的物质基础, 气 主运化 化生万物, 为 精 提供生机与动能 只有 精气 充足, 精子才能上行与卵子结合 ( 阴阳和 ), 故能有子 反之虽 精 充, 而 气 不足 ( 相当于活力下降 ), 精子不能快速上行与卵子结合, 男子生育受损, 故不易得 子 汉代 伤寒杂病论 明确提出了男子不育与 精冷 精少, 精时自下 有关 隋代 诸病源候论 则从病因学, 症状学角度, 一步论述了不育与 精气 的关系 : 丈夫无子者, 其精清如水, 冷如冰铁, 皆为无子之候 唐代 备急千金要方 提出: 天 犍 漏 怯 变 五不男 学说, 其中 漏 即指精液不固, 常遗精滑泄, 致精气不充而不育 明代 广嗣纪要 提出: 生 纵 变 半 妒 五不男 学说, 其中 变 即指 : 未至十六, 其精常自行, 或中年多有遗漏 自浊, 致 精气 减少而不育 至清代 石室秘录, 对 精气 充溢盛衰与男性不育的病因病机认识, 则达到了一个较完整的更高水平, 提出了 精寒 气衰 痰多 火盛 精少 气郁 的六因学说 现代中医男科学者在继承传统病因病机理论的基础上, 充分运用现代科学技术, 对弱精子症男性不育的病因病机, 进行了广泛深入研究与实践, 使弱精子症男性不育的中医证治研究, 更具现代科学规范特征 [19] 如王琦教授在 1988 年对男性不育症的发病提出 肾虚夹湿热瘀毒 是现代男性不育症的主要病机, 认为肾虚为本, 湿热瘀毒为标 这一病机观点的提出对男性不育症的研究产生了重要影响 随后的男性不育症的研究以肾虚夹湿热瘀毒立法者占了很大的比例 王琦认为纵欲过度 性激素低下导致少 弱精症可归于 肾虚 ; 生殖系统炎症 前列腺 4

19 南京中医药大学硕士学位论文 炎及嗜食辛辣烟酒导致精子活力低下 死精症 精液不液化可归于 湿热 ; 生殖系统慢性炎症 精索静脉曲张及输精管道梗阻可归于 瘀 ; 而性传播疾病 急性输精管炎症及辐射等因素可归于 毒 它们不仅可单独致病, 又可相互影响 相兼致病 [20] 贾金铭提出肾虚与血瘀为男性不育的主要病机, 肾为先天之本, 肾的主要功能主藏精 主生长发育和生殖, 开窍于耳及二阴 现代医学认为, 生殖系统的生长发育受内分泌系统所支配, 肾本质的研究证实了中医的肾类似下丘脑 - 垂体 - 性腺轴的作用 所以, 肾气的盛衰实际上体现了机体主要内分泌的功能状态及体质的状况, 当然也决定着生育能力的强弱, 肾虚是男性不育的主要病理机制 男性不育病程较长, 多为久病, 久病必有瘀, 怪病必有瘀 或禀赋乖异, 精道不通 ; 或跌扑损伤, 或同房用力不当, 导致瘀血内生, 精道瘀阻 ; 或因湿热之邪久恋化瘀, 蕴阻精道 ; 或久病入络, 精室失养 ; 或因忍精不泄, 败精 ; 或因情志不畅, 气滞血瘀, 阻滞精道而致精少, 或七情不遂, 肝气郁结, 脉络不畅, 最终导致气机不利, 血行受阻, 精失濡养, 活力低下 所以瘀血往往是在以往的慢性炎症 组织损伤基础上造成血运不畅, 局部组织失养 因此, 瘀血是男性不育的另一个主要病理机制 治法治则目前对于少 弱精子症的辨治尚未建立统一的基本证型和治疗法则, 因此, 近年对弱 [20] 精子症的治疗研究, 也从多脏腑 多病因, 多方面展开 贾金铭提出活血化瘀 滋补肾 [21] 阴为主, 治疗少精子症, 活血化瘀 温补肾阳为主治疗弱精子症 王景阁认为肾为先天之本, 脾胃为后天之本, 男科病治疗多以补肾法收功, 然而后天不足也会累及先天, 补助后天有助于补养先天肾气 所有的方法都只针对某些特定的群体有较好的疗效, 这就需要 [22] 医者仔细鉴别, 准确把握症候特点 赵秀华等认为治疗少精 弱精应脾肾并重, 气血并 [23] 调, 方能取得较好效果 陈金荣等认为对男性不育当审因论治, 因证施治, 做到辨病与辨证, 整体与局部, 攻邪与扶正, 药物与饮食, 情志与性事等方面的结合, 强调生精首当补脾, 填精贵在补肾, 通精重视活血理气, 护精勿忘补泻兼施, 养精宜重视饮食宜忌, 求嗣须调情择期的六项原则 这种整体辨治观点, 对弱精症的治疗也同样有普遍的借鉴意义 中医药治疗少 弱精症的临床研究中医药治疗男性不育, 有着悠久的历史和丰富的临床经验 [3], 唐代 备急千金要方 最早提出了治疗不育症的专方七子散和庆云散, 我国第一部药学专著 神农本草经 就记载了许多增强性功能和生殖能力的药物, 如五味子 强阴, 益男子精, 杜仲 益精气, 淫羊藿 主阴痿绝伤 等 方剂方面, 较著名而至今仍广泛使用的有 : 证治准绳 的五子衍宗丸, 景岳全书 的赞育丹, 卫生宝鉴 的三才封髓丹, 辨证录 的宜男化育丹, 纯一丸 记忧散 造兴丸等 其中最为著名的当属五子衍宗丸, 为古今医家所撷, 为中医治疗男性不育的扛鼎力方 [3] 临床中少 弱精症不是一个孤立的病症, 是多种疾病和因素引起的一种结果, 因此, 近年对少 弱精子症的治疗研究, 呈现出传统经典验方与现代药理相结合, 一方为主随证加减, 单方专用等多样化趋势 5

20 第一部分绪论 (1) 辨证分型论治 [22] 赵秀华等辨证治疗少 弱精症, 肾阳不足型治以补肾强精, 方药 : 附子 肉桂 鹿角片 巴戟天 大云 首乌 菟丝子 熟地 枸杞子 旱莲草 覆盆子 五味子 ; 脾胃虚弱型治以健脾和胃 补气养血, 方药 : 黄芪 党参 白术 山药 黄精 大枣 五味子 覆盆子 云苓 首乌 熟地 当归 ; 血瘀气滞型治以理气活血, 祛瘀通精, 方药 : 当归 川芎 丹参 红花 桃仁 山甲 川牛膝 首乌 菟丝子 枸杞子 赤芍 五味子 女贞子 ; 湿热虫毒型治以清利湿热 泄虫毒, 方药 : 土茯苓 虎杖 公英 地丁 黄柏 黄连 [24] 大黄 紫草 双花 连翘 枸杞子 菟丝子 首乌 熟地 黄芪 当归 樊新爱等辨证治疗少 弱精症, 脾肾两虚型, 治当健脾补肾, 方选四君子汤合左归丸或右归丸 ; 气滞血瘀型, 治当疏肝理气活血化瘀通络, 方选柴胡疏肝汤和少腹逐瘀汤加减 ; 湿热蕴结型, 治 [25] 当清利湿热, 方选龙胆泻肝汤或八正散加减 朱玉芬将其分为 5 型辨治 : 肾阳虚型治宜温肾填精, 方选五子衍宗丸加减, 兼有阳痿者加阳起石 石仙茅, 兼有遗精者加金樱子 龙骨 牡蛎等 ; 肾阴虚型治宜滋肾填精, 佐以养血, 方选六味地黄汤加减, 失眠多梦者加夜交藤 炒枣仁 ; 气血两虚型治宜补脾益气养血, 佐以补肾填精, 方选四君子汤合五子衍宗丸加减 ; 气滞血瘀型治宜舒肝解瘀, 方选柴胡疏肝散加减 ; 湿热下注型治宜清利湿热, 佐以益肾填精, 方选导赤散化裁, 共治疗 158 例, 连用 2 个疗程 (14 周 ), 痊愈 125 例, 有 [26] 效 28 例, 总有效率 96.8% 戚广崇将少精子症辨证分为六型, 肾精不足型治以补肾益髓以强精, 药用蜂房 淫羊藿 何首乌 黄精各 15g, 肉苁蓉 续断 狗脊 锁阳 熟地黄 鹿角片各 10g, 大枣 20 枚 ; 肾阳不振型治以温肾壮阳以添精, 药用炮附子 生龙骨各 30g, 白术 80g, 桂枝 60g, 蜜炼为丸 ; 肾阴亏损型治以滋阴养肾以填精, 药用熟地黄 250g, 山药 枸杞 山茱萸 菟丝子 鹿角胶 龟板胶各 125g, 川牛膝 90g, 蜜炼为丸 ; 气血两虚型治以益气补血以生精, 药用人参 熟地黄 黄芪 黄精 制何首乌各 15g, 茯苓 白术 白芍 当归各 9g, 川芎 肉桂 甘草各 5g, 大枣 20 枚 ; 瘀血阻络型治以活血祛瘀以通精, 药用丹参 15g, 黄芪 20g, 生牡蛎 30g, 红花 赤芍各 10g, 大枣 20 枚 ; 精室湿热型, 治以清利湿热以化精, 药用川萆 车前子 红藤 丹参 白花蛇舌草各 15g, 黄柏 知母 [27] 柴胡 制大黄 丹皮 王不留行各 10g, 碧玉散 20g 沈坚华用补肾调肝法, 肝肾阴虚者滋阴补肾, 用六味地黄丸 ; 肾阳虚者温肾壮阳, 用金匮肾气丸 ; 肾气虚者补肾填精, 用左归饮 ; 肝阴不足柔肝养阴, 用二至丸合一贯煎加减 ; 肝气郁滞者疏肝解郁, 柴胡疏肝散加减 ; 肝经湿热者用龙胆泻肝汤加减 ; 肝血瘀阻者用大黄虫丸, 治疗精子极少症不育 126 [28] 例, 治愈 73 例, 显效 4 例 陈德宁等从脾胃论治, 根据脾胃与肾的生理病理, 结合现代医学对微量元素的研究认识, 认为男性不育之病位虽在肾, 但与脾胃功能的盛衰密切相关 提出治疗男性不育当重视脾胃, 运用补中益气汤治疗男性弱精子症, 结果表明, 补中 [29] 益气汤对精子的计数和活动力均有明显的改善和提高 刘建荣等认为精索静脉曲张导致弱精子症的病位在肝, 肝失疏泄为其病机特点, 在此基础上自拟了疏肝解郁 理气定痛的伸曲助育汤进行该病的治疗, 药物组成 : 制香附 10g 荔枝核 10g 枳实 15g 青皮 10g 6

21 南京中医药大学硕士学位论文 陈皮 15g 川牛膝 10g 当归 15g 枸杞子 15g, 治疗患者总有效率 87.5% (2) 固定方加减治疗 [30] 临床上对于本病的治疗多采用固定方随症进行加减治疗 刘艳芳等用益肾增精汤 ( 人参 菟丝子 丹参 枸杞子 车前子各 12g, 山药 肉苁蓉各 15g, 何首乌 熟地黄 淫羊藿各 20g, 鹿角胶 当归 五味子各 10g), 肾阳虚加肉桂 巴戟天 川续断 海狗肾, 肾阴虚加桑寄生 女贞子 山茱萸 合欢皮, 气血两虚加黄芪 白术 白芍 炒枣仁, 气滞血瘀加鸡血藤 丹皮 红花 穿山甲, 肝经湿热加知母 黄柏 柴胡 龙胆草,3 个月为一疗程, 第一月服药 6 剂停药 1 天, 后二月服药 3 剂停药 1 天 治疗少精子症 46 例 (2 [31] 个疗程 ), 治愈 18 例, 显效 16 例, 好转 10 例, 总有效率 95.7% 王桂枝等用补肾升精汤 ( 党参 白术 枸杞 女贞子 川续断 桑寄生 菟丝子 杜仲 淫羊藿 巴戟天 鹿角胶各 10g, 旱莲草 15g, 甘草 5g), 精液中有白细胞加金银花 知母 黄柏清热消炎, 腰脊软者加狗脊 补骨脂, 治疗精子数少 活动率差者 126 例, 用药 10~360 剂以上, 治愈 83 [32] 例, 显效 17 例 庄艳玲等用五子衍宗丸加味来治疗少 弱精症所致不孕, 药物组成 : 枸杞子 15g, 菟丝子 覆盆子 淫羊藿各 18g, 车前子 12g, 五味子 9g, 当归 熟地各 20g, 白芍 15g, 甘草 6g, 每日 1 剂, 水煎, 早晚饭后服,15 剂为 1 疗程 休息 10 天, 每 30 天查精液一次, 观察其效果 两个疗程无变化者改用其他方法 加减 : 如不液化者加沙参 石斛 生地黄 花粉等滋阴生津, 如伴有前列腺炎症加土茯苓 滑石 地肤子 泽泻 黄柏以清热利湿, 泻火解毒, 结果总有效率为 100%, 受孕 86 例, 受孕率 57.33%, 同时心悸 [33] 乏力 自汗等症状明显改善 刘长振采用自拟生精活力汤 ( 黄芪 25g, 党参 苡仁 黄精 菟丝子 枸杞各 15g, 茯苓 怀牛膝 怀山药各 12g, 沙苑子 熟地 淫羊藿 紫河车 何首乌 车前子各 10g) 治疗本病 120 例, 随症加减, 湿热甚者去熟地 何首乌, 加苍术 川朴各 10g, 血瘀甚者加丹参 益母草各 10g 结果痊愈 31.7%, 显效 29.2%, 有效 26.7%, [34] 总有效率 87.6% 朱俊芳自拟助育汤 ( 熟地黄 30g, 制首乌 15g, 仙灵脾 20g, 菟丝子 15g, 枸杞子 15g, 覆盆子 15g, 五味子 ( 包煎 )10g, 车前子 15g) 辨证加减, 治疗男性不育症 166 例, 肾精亏损型加用生黄芪 鹿角胶 制黄精用以补肾强精 益气壮阳, 肝郁血瘀型加用川楝子 香附 延胡索 川牛膝 红花 丹参 地龙等疏肝活血 调补肝肾, 湿热下注型助育汤去肉苁蓉 仙灵脾, 加公英 菖蒲 虎杖 萆薢 红藤等以清利湿热 分清泌浊, 结果怀孕 89 例, 精液指标正常 46 例 (3) 中西医结合治疗由于少 弱精症病因的复杂性, 任何单一的治疗方法和手段都不能一蹴而就, 因而在临床上也有很多选用中西医结合治疗的方法 [35] 王旭初等采用自治生精丹 ( 紫河车 30g, 山药 250g, 枸杞子 120g, 菟丝子 60g, 覆盆子 60g, 蛤蚧 50g, 淫羊藿 120g, 巴戟天 120g, 蒿本 120g 以上碾细过筛, 炼蜜为丸 ) 每次 9g, 每日 2 次, 口服, 连用 3 个月 同时给予注射用促性素 (HCG)2000IU, 肌注, 每周 2 次,1 月后加用注射用尿促性素 (HMG)75IU, 肌注, 每周 2 次 总疗程 3~6 个月 结 7

22 第一部分绪论 [36] 果痊愈 44 例 ( 其中 30 例配偶怀孕 ) 总有效率 92.5% 王君龙等自制活力生精灵胶囊 ( 由五子衍宗丸加黄芪 党参 山药 当归 熟地 黄精 首乌 仙灵脾 鱼螵胶等 ) 联合克罗米酚治疗弱精子症, 选择 93 例患者随机分成 A B C 三组进行临床对比研究观察 经统计学处理发现,C 组 ( 生精胶囊 + 克罗米酚 ) 疗效明显优于 A 组 ( 克罗米酚 ) B 组 ( 生 [37] 精胶囊 )(P<0.05), 而 A B 两组间差异不显著 (P>0.05) 杨宝贵等用自拟生精方 ( 枸杞 桑椹子 覆盆子 仙茅 淫羊藿各 12g, 菟丝子 熟地黄各 15g, 五味子 山茱萸各 6g, 续断 白术各 9g, 紫河车 10g) 加减, 偏肾阳虚者加巴戟天 肉苁蓉各 12g, 肉桂 3g; 偏肾阴虚者加女贞子 黄精 生地黄各 15g, 上药为丸, 每服 6g, 日 2 次, 配合克罗米酚 50mg/d,3 个月为一疗程 治疗 80 例, 观察 5 疗程, 结果生育 42 例 (52.5%), 精子密度和活力改善 72 例 (90.0%) 对照组 20 例不作治疗, 结果生育 1 例 (5.0%), 精子密度和活力改 [38] 善 2 例 (10.0%), 两组比较有极显著性差异 (P<0.01) 许崇伟等用生精助育汤 ( 淫羊藿 熟地黄 制何首乌各 30g, 山药 菟丝子 枸杞 黄芪 当归各 15g, 山茱萸 丹皮 茯苓各 10g, 泽泻 12g), 精子过少加重熟地黄 枸杞用量, 精子成活率低加重淫羊藿 黄芪用量, 并加入仙茅 巴戟天 蛤蚧等, 配合枸橼酸克罗米酚 50mg/d, 治疗少弱精症 73 例, 结果妊娠 38 例, 精子密度和活力改善 43 例, 较单用克罗米酚组或单用生精助育汤组有显著性差异 (P<0.01) 2 复方益精胶囊项目背景 少 弱精症是男性不育症的主要原因, 属于男科的常见病 疑难病, 对其身体健康 心理健康 社会和家庭均有很大危害 因此, 对少 弱精症和的诊断和治疗目前已成为国内外专家学者的热点 重点研究课题 西医多采用激素类药物或手术治疗, 有较多副作用或技术尚未成熟不能广泛应用, 具有较大的局限性 目前国内外专家都在探索一些更好的治疗方法, 以期能更好地治疗该病 中药在治疗该病上, 有着不可替代的优势, 而且历史悠久, 副作用小 本课题所研制的复方益精胶囊来源于老中医的经验方, 作为医院制剂在临床上已经使用多年, 临床应用安全有效 通过开发具有良好临床疗效的 复方益精胶囊, 不仅具有良好的社会效益, 而且能进一步开发为临床新药, 发挥其良好的经济效益 复方益精胶囊为纯天然中药制剂, 具有滋阴补肾 活血通络 生精助阳之功效, 用于治疗少 弱精子症 制剂主要由淫羊藿 当归 黄芪 紫河车 熟地黄 黄精 水蛭 沙苑子 王不留行等饮片组成 其中淫羊藿 紫河车 沙苑子补肾中阳气, 使阴得阳而源泉不绝 ; 当归 熟地 黄精养血填精, 补气养阴, 补肾中阴精不足 ; 黄芪益气行气 振奋脾阳, 化生气血精源, 为全方的动力 ; 王不留行活血通经 水蛭破血逐瘀, 共奏疏肝理气 活血化瘀之功 ; 方中诸药合用, 阴阳双补 脾肾同治 养血活血同用 健脾益气共存, 共收滋阴补肾填精 活血通络 生精助阳之功 本课题是拟在中医药理论指导下, 对中药医院制剂进一步深入研究和拓展, 按照国家 药品注册管理办法 及相关技术指导原则中有关中药新药注册分类第 6 类的要求, 结合 8

23 南京中医药大学硕士学位论文 中药化学 中药药理学等学科的研究成果, 根据与本方功能主治有关的化学成分的性质与临床用药要求, 遵照原方, 选择胶囊剂型, 对制剂原料的来源及品质 制剂工艺 质量标准 初步稳定性等方面进行研究, 其目标是为临床提供一种工艺合理 质量可控 稳定有效的治疗少 弱精症的中药新药 主要研究内容包括 : 1 制剂原料检验 : 参照 中国药典 2005 年版有关品种项下要求, 进行原料质量鉴定 2 醇提工艺研究 : 根据方中当归 黄芪 水蛭 王不留行等药物所含主要有效活性成分的性质, 选取符合 中国药典 2005 年版相关要求的各原料, 采用醇提法提取, 以阿魏酸 黄芪甲苷含量为指标对乙醇浓度 乙醇用量 回流时间 提取次数等因素进行正交优选 3 水提工艺研究 : 上述醇提药渣与淫羊藿 紫河车 熟地黄 黄精 沙苑子等采用水提法, 并以淫羊藿苷 总多糖含量为指标对加水量 煎煮时间 煎煮次数等因素采用正交设计法进行工艺优选 4 水提液精制工艺研究 : 将水提液浓缩后加乙醇醇沉, 优选醇沉工艺条件 5 浓缩与干燥工艺研究 : 以淫羊藿苷 黄芪甲苷含量为指标, 优选浓缩 干燥的条件 6 制剂成型工艺研究 : 通过选择适宜的辅料, 确定成型工艺 7 进行三批样品的中试放大试验 8 制剂质量研究 : 根据中药第 6 类新药质量研究要求, 对制剂中淫羊藿 当归 黄芪 熟地黄 黄精 王不留行 紫河车 沙苑子 水蛭采用薄层鉴别法分别选择相应展开剂进行定性鉴别 ; 采用 HPLC 法对制剂中主要活性成分淫羊藿苷进行含量测定并进行方法学研究 同时参照 中国药典 2005 年版胶囊剂检查项下要求进行有关检查 9 采用加速稳定性研究和长期稳定性研究方法, 不同时间点取样, 按照本制剂质量标准项下的性状 TLC 鉴别 崩解时限 淫羊藿苷含量等项目检测方法进行检测, 以确定制剂的有效期 3 复方益精胶囊各组成单味药研究概况 3.1 淫羊藿 本品为小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim. 的干燥地上部分, 具有补肾阳, 强筋骨, 祛风湿的作用 现代药理试验显示具有补肾壮阳 扩张血管 抗氧化 抗菌 抗病毒作用, 提高机体免疫功能和预防骨质疏松的作用 临床多用复方治疗糖尿病, 男性不育症, 防治骨质疏松症, 治疗肾阳虚症等 多糖和黄酮类成分为淫羊藿的主要成分, 近年来, 对淫羊藿属植物的化学研究多集中于黄酮类成分, 其总黄酮含量在 2%~4.6% 之间, 其主要为淫羊藿苷 (Icariin), 淫羊藿次苷 Ⅰ(IcarisideⅠ), 淫羊藿次苷 Ⅱ(IcarisideⅡ) 等 此类成分均可溶于水 甲醇 乙醇等, 此外还含有挥发油 棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚麻 9

24 第一部分绪论 酸 [39] 提取工艺 [40] 侯集瑞等以淫羊藿苷含量为指标对淫羊藿总黄酮的提取工艺进行了研究, 优选出水提取的最佳提取工艺为加 20 倍水, 浸泡 1.5h, 提取 2 次, 每次 1h, 有效成分含量为 %, 成本较低 [41] 符玉荣等采用正交试验法, 以出膏率和总黄酮含量为指标, 用分光光度法进行含量测定, 优选前列康片中淫羊藿水煎醇沉提取工艺条件, 最终选用 12 倍量的水, 煎煮 3 次, 每次 1h, 然后用 60% 乙醇进行沉淀 ( 于 4 冰箱静置 24h) 的制备工艺 此工艺能够保证淫羊藿有效成分提取较完全, 以确保疗效 [42] 陈常荣以淫羊藿苷含量为检测指标, 根据药材粒度 煎煮时间 煎煮次数 醇沉浓度 4 个影响因素, 采用 L 9 (3 4 ) 正交法试验, 以高效液相色谱法测定淫羊藿苷含量 结果优选出最佳工艺为 : 药材粉碎成粒度 5~10mm, 加 12 倍药材量的水, 煎煮 3 次, 每次 1.5h 成分鉴定 [43] 江滨等在巴戟补肾液质量标准研究中对淫羊藿薄层鉴别的方法为取本品 140ml, 加水饱和的正丁醇提取 3 次, 每次 50ml, 合并提取液, 加 3 倍量氨试液, 摇匀, 放置分层, 取上层液, 合并, 蒸干, 残渣加甲醇 1ml 使溶解, 作为供试品溶液 另取淫羊藿 0.5g, 加乙醇 20ml, 温浸 30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙醇 1ml 使溶解, 作药材对照液 按供试液制备方法制成阴性对照液 吸取上述溶液各 6μl, 分别点于同一含 0.3%CMC-Na 的硅胶 G 薄层板上, 以乙酸乙酯 - 甲醇 - 水 - 甲酸 (14:1:1:0.5) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 10% 硫酸乙醇溶液, 在 90 加热至斑点显色清晰, 置紫外灯 (365nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上显相同的两个黄绿色荧光斑点, 而阴性对照液色谱中无此斑点 [44] 陈家进等在复方益芪颗粒质量标准研究中对淫羊藿的 TLC 方法为取本品 5g, 研细, 加水 20ml, 超声提取 10min, 抽滤, 滤液加乙醚提取 2 次, 每次 20ml, 弃去乙醚液, 再用醋酸乙酯提取 3 次, 每次 20ml, 合并醋酸乙酯液, 用 0.24mol L - 1 碳酸氢钠溶液提取 2 次, 每次 20ml, 弃去碳酸氢钠溶液, 醋酸乙酯液水浴蒸干, 残渣加甲醇 1ml 使溶解, 作为供试品溶液 取除去淫羊藿的配方, 同法制成阴性对照品溶液 另取淫羊藿对照药材, 加水煎煮 30min, 滤过, 滤液同法制成对照药材溶液 再取淫羊藿苷对照品, 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液, 作为对照品溶液 照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液各 10μl, 分别点于同一硅胶 GF 254 薄层板上, 以醋酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 (10:1:1:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯 254nm 下检视 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点 [45] 刘玉成等在仙灵骨葆片的薄层色谱鉴别中对淫羊藿的定性鉴别方法为取本品 3 片, 研细, 加 70% 乙醇 30ml, 超声提取 1h, 冷却至室温, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙醇 2ml 使溶解, 作为供试品溶液 再取淫羊藿苷对照品, 加甲醇制成 1ml 含 1mg 的溶液, 作为对照品溶液 再取淫羊藿对照药材 1.0g, 同法制成对照药材溶液, 照薄层色谱法 ( 中国药典

25 南京中医药大学硕士学位论文 年版一部附录 VI B) 试验, 吸取上述 3 种溶液各 10μl, 分别点于同一硅胶 GF 254 薄层板上, 以醋酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水 (10:1:1:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 5% 三氯化铝溶液, 置紫外灯 (254nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照品和对照药材色谱相应的位置上, 显相同的斑点 含量测定 [46] 陈常荣在淫羊藿苷提取工艺的正交试验研究中使用的高效色谱条件是十八烷基硅烷键合硅胶 (250mm 4.6mm,5μm); 流动相 : 乙腈 - 水 (30:70); 流速 :1.0ml/min; 温度 : 25 ; 检测波长 :270nm [47] 徐东采用高效液相色谱法测定了补肾宁胶囊中淫羊藿苷的含量 以 C 18 柱为色谱柱, 以乙腈 - 水 (23:77) 为流动相, 检测波长为 270 nm, 结果方法简便 准确 重复性好 [48] 杨柳在淫羊藿中淫羊藿苷的提取工艺研究中使用的流动相为乙腈 - 水 (30:70), 检测波长 270nm, 柱温 25, 流速 1.0ml/min 此方法可行 准确 中国药典 2005 年版一部淫羊藿药材中淫羊藿苷含量测定的 HPLC 条件为 : 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ; 乙腈 - 水 (30:70) 为流动相, 检测波长为 270nm 淫羊藿为方中君药, 其有效成分为淫羊藿苷, 综合以上文献研究, 结合淫羊藿临床及其实验应用, 在本制剂制备工艺拟订时, 采用乙醇提取, 并以淫羊藿苷作为工艺筛选的考察指标 3.2 黄芪 本品为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var.mo-ngholicus (Bge.) Hsiao 的干燥根 黄芪性微温, 具有补气升阳, 固表止汗, 托毒生肌之功效 近代研究表明黄芪含有黄芪皂苷 (astragaloside)Ⅰ- Ⅷ ( 黄芪皂苷 IV 又称黄芪甲苷 ) 黄芪多糖 山柰酚 槲皮素 叶酸 胆碱等多种成分 其中黄芪甲苷为其活性成分之一, 具有增强免疫系统 抗氧化 延缓衰老 改善心功能状态 抗病毒 抗癌等功效 黄芪多糖不仅能作用于多种免疫活性细胞, 促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成, 还可以从不同角度发挥免疫调节作用 [49] 黄芪为本制剂中主要药物, 其主要成分为黄芪皂苷 黄芪多糖 氨基酸等 提取工艺 [50] 刑俊波等以黄芪甲苷的含量为指标, 采用正交实验设计筛选黄芪的最佳提取工艺条件, 即用 7 倍量的 70% 乙醇热回流提取 3 次,90min/ 次 结论为该工艺稳定可行 [51] 吴永平等用两种方法提取制备黄芪皂苷和黄芪多糖, 比色法分别测定其含量, 探讨黄芪活性成分最佳提取工艺 结果为 80% 乙醇制备的黄芪提取物 ( 皂苷 ) 粉末含皂苷较多 ; 采用 90% 乙醇提取后的药材再提多糖, 多糖含量较 80% 乙醇提取后的高 ; 冻干多糖粉末质地 色泽 水溶性较好 [52] 周勤文等以黄芪甲苷为指标, 采用薄层扫描 高效液相色谱法分析, 应用正交试验优选舒冠胶囊提取工艺 结果表明, 最佳提取工艺为药材加 6 倍量 70% 乙醇, 回流提取 3 次, 11

26 第一部分绪论 3 小时 / 次 成分鉴定 [53] 王春霞等在补脾益肠丸中黄芪的薄层鉴别方法为 : 取本品 5g, 研细, 加正丁醇 20ml, 置水浴上加热回流 2h, 滤过, 滤液用 1% 氢氧化钠溶液洗涤 3 次,15ml/ 次, 弃去碱液, 再用正丁醇饱和水洗至中性, 弃去水层, 正丁醇液于水浴上蒸干, 残渣加甲醇 0.2ml 使溶解, 即得供试品溶液 ; 取黄芪甲苷对照品, 加甲醇制成每 1ml 含 1mg 的对照品溶液 ; 取缺黄芪的本品, 按样品液制备法制备阴性对照液 吸取上述 3 种溶液各 5μl, 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上 (105 活化 1h), 以三氯甲烷 - 甲醇 - 水 (13:7:2) 10 以下放置的下层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 10% 硫酸乙醇溶液, 于 105 加热至斑点显色清晰 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的置上, 日光下显相同颜色的斑点, 紫外光灯 (365nm) 下显相同的橙黄色荧光斑点, 而阴性对照品无相应斑点 [54] 李石蓉等在健脾益气颗粒的质量标准研究中黄芪的 TLC 方法为 : 取本品 20g, 加甲醇 40ml, 加热回流 1 小时, 滤过, 滤液蒸干 残渣加水 10ml 溶解, 用水饱和的正丁醇振摇提取 2 次, 每次 20ml, 合并正丁醇提取液, 用氨试液提取 2 次, 弃去氨试液, 正丁醇液蒸干, 残渣加水 3~5ml 使溶解, 放冷, 通过 D 101 型大孔吸附树脂柱 ( 内径 1.0~1.5cm, 长 12cm), 以水 50ml 洗脱, 弃去水液, 再用 40% 乙醇 30ml 洗脱, 弃去 40% 乙醇洗脱液, 继用 70% 乙醇 50ml 洗脱, 收集洗脱液, 蒸干, 残渣加甲醇 1ml 使溶解, 作为供试品溶液 ; 除黄芪外, 其余各药按处方量投料制成阴性对照品, 再取阴性对照品 20g, 按上法制得阴性对照溶液 ; 取黄芪甲苷对照品, 加甲醇制成每 1ml 含 1mg 的溶液, 作为对照品溶液 依照薄层色谱法 ( 中国药典 2000 年版一部附录 VI B) 试验 : 吸取对照品溶液 1μl, 供试品溶液 10μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 - 甲醇 - 水 (13:7:2) 的下层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 10% 硫酸乙醇溶液, 在 105 加热至斑点显色清晰 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上 (R f = 0.5), 日光下显相同的棕褐色斑点 ; 紫外光灯 (365nm) 下显相同的橙黄色荧光斑点 [55] 吴史平等在海珠王口服液质量标准的研究中黄芪的薄层色谱鉴别法为 : 取口服液 40ml, 加石油醚 (60~90 )40ml, 振摇提取, 弃去石油醚液, 加用水饱和的正丁醇 40ml, 振摇提取, 分取正丁醇提取液, 用水 20ml 洗涤, 弃去水液, 正丁醇液用无水硫酸钠适量脱水后, 置水浴上蒸干, 残渣加无水乙醇 2ml 溶解, 作为供试液 取缺黄芪的海珠王口服液, 如上法提取制成阴性对照溶液 另取黄芪对照药材 2g, 加水煎煮 1h, 滤过, 滤液浓缩至约 40ml, 同法制成对照药材溶液 分别吸取上述三种供试液各 5μl, 点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上, 以甲苯 - 二氯甲烷 - 丙酮 (8:8:4) 为展开剂, 展开约 10cm, 取出, 晾干, 置氨气中熏后, 置紫外灯 (365nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上显相同的两个黄绿色荧光斑点, 而阴性对照液色谱中无此斑点 3.3 当归 12

27 南京中医药大学硕士学位论文 当归 Angelica sinensis(oliv) Diels 始载于 神农本草经 当归味甘平 性温 当归具有补血活血 调经止痛 润燥滑肠 生肌健骨的功效 当归主要含有挥发油 有机酸等成分 药理方面主要有降低血压, 镇痛 抗炎 抗菌 抗辐射和抗损伤等作用 [56] 提取工艺 [57] 杨林等以当归中主要成分阿魏酸的含量为指标, 采用正交试验法进行优选当归提取最佳工艺条件, 结果表明乙醇浓度 提取时间对阿魏酸的得率影响有显著性意义, 阿魏酸提取的最佳工艺为以 75% 的乙醇 8 倍量, 回流提取 3 次, 每次 1. 5 小时, 阿魏酸得率为最高 [58] 侯林中等对方中当归 川芎单独进行了研究, 以阿魏酸为评价指标, 用正交实验对方中当归 川芎的醇提工艺进行了优选 由方差分析可知, 乙醇浓度和提取次数具有显著意义, 提取时间和乙醇用量无显著意义 结合实际生产, 从降低成本角度考虑, 最后确定最佳提取工艺为用 8 倍量 80% 乙醇, 加热提取三次,1.5 小时 / 次 [59] 王淑美等比较脑脉通颗粒剂不同提取工艺下阿魏酸的含量变化 对于脑脉通颗粒, 采用水和乙醇 2 种提取溶剂, 各药分煎后合并和合煎 2 种提取方法, 以阿魏酸的提取率为指标, 考察提取工艺 结果表明乙醇提取工艺中阿魏酸的提取率优于水煎煮提取, 而分煎 合煎对阿魏酸含量影响不大 成分鉴定 [60] 袁敏等鉴别接骨续筋口服液中的当归, 取制剂 20ml, 加乙醚 20ml 萃取, 取乙醚层, 蒸干, 残渣加乙醇 2ml 使溶解, 作为供试品溶液 另取当归对照药材 1g, 加无水乙醚 20ml, 加热回流 30min, 乙醚液蒸干, 残渣加乙醇 8ml 使溶解, 作为对照药材溶液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 吸取上述两种溶液各 2μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正己烷 - 乙酸乙酯 (3:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 在紫外光灯 (365nm) 下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的蓝色荧光斑点 [61] 罗娟鉴别独活寄生合剂中的当归, 取本品 15ml, 挥干溶剂, 加乙醚 20ml, 超声处理 30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙酸乙酯 1ml 溶解, 作为供试品溶液 ; 取当归对照药材 1g, 按供试品溶液的制备方法分别制成相应的对照药材溶液 ; 按药品处方, 依据质量标准中的制法及供试品溶液制备方法制备缺当归的阴性对照溶液 取供试品溶液, 当归对照药材溶液, 阴性对照溶液各 5μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以石油醚 - 乙酸乙酯 (9:1) 为展开剂展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯 (365nm) 下检视 结果供试品溶液色谱中, 在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点, 而阴性对照品溶液在相应位置无干扰 [62] 魏萍鉴别乙肝扶正胶囊中的当归的方法为取本品内容物 3g, 置具塞锥形瓶中, 加乙醇 20ml, 超声处理 30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙醇 2ml 使溶解, 作为供试品溶液 取缺当归的阴性样品, 按供试品制备方法配制成阴性样品溶液 取当归对照药材 1g, 按供试品制备方法制成对照药材溶液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 吸取上述 3 种溶液各 10μl, 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层 13

28 第一部分绪论 板上, 以正乙烷 - 醋酸乙酯 (9:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯 (365nm) 下检视 结果, 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点, 阴性样品在此位置上无斑点, 说明阴性对照无干扰 3.4 黄精 本品是百合科植物滇黄精 Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl. 黄精 Polygonatum sibiricum Red. 或多花黄精 Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根茎, 性味甘平, 具有补气养阴 健脾 润肺 益肾的功效 用于脾胃虚弱 体倦乏力 口干食少 肺虚燥咳 精血不足 内热消渴等症 黄精含有黄精皂苷 A B(sibiricosides A B) 黄精多糖甲, 乙, 丙, 还含有赖氨酸等 11 种氨基酸 黄精皂苷为其活性成分之一, 具有延长寿命 抗衰老的功能, 能增强免疫力, 调血脂 降血糖, 增加心肌收缩力和冠脉流量, 提高学习 记忆再现能力, 抗炎 抑菌 抗病毒 抗疲劳 抑制肿瘤细胞等功效 [63][64] 提取工艺 [65] 汪兴平等采用水浸提 乙醇醇析提取 sevage 脱蛋白 沉淀 真空冷冻干燥等方法研究黄精含硒多糖的提取工艺, 并用蒽酮比色法和原子吸收法对多糖含量 硒含量进行了测验, 结果表明黄精水溶性含硒多糖最佳提取参数为 : 温度 90, 提取时间 4h, 料液比 1:50, 提取次数为 2 次 水溶性多糖含量为 3.12%, 硒含量为 g/g 成分鉴定 [66] 李光喜鉴别首乌补汁中黄精成分, 以含 0.3%CMC-Na 的硅胶 G 薄层板, 以苯 - 乙酸乙酯 - 甲酸 (5:4:0.5) 为展开剂, 喷以 2,4- 二硝基苯肼乙醇液, 供试品对照药材色谱相应的位置上, 呈相同的黄色斑点, 阴性对照药材色谱图在相应位置上未见对应斑点 [67] 刘潇湘等鉴别降糖甲胶囊黄精成分, 以硅胶 G 薄层板, 以氯仿 - 甲醇 - 醋酸 (5:4:1) 为展开剂, 喷以 25% 磷钼酸乙醇溶液, 供试品与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的蓝色斑点, 阴性对照则无相应斑点 [68] 冯绍华等鉴别渴乐宁片中黄精成分, 以硅胶 G 薄层板, 以苯 - 醋酸乙酯 - 甲酸 (6:3:0.5) 为展开剂, 喷以 2,4- 二硝基苯肼乙醇溶液, 供试品与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点, 阴性对照试验无干扰 3.5 熟地黄 本品为玄参科植物生地黄 Rehmannia glutinosa Libosch. 的新鲜或干燥块根的炮制加工品, 具有滋阴补血, 益精填髓等功效 熟地黄的化学成分以苷类为主, 其中又以环烯醚萜苷类为主, 还含有多糖, 二十多种微量元素, 十五种氨基酸等 熟地黄具有重要的临床应用价值, 其药理作用广泛, 对免疫 血液 内分泌 心脑血管及神经系统等方面均有一定的作用 [69] 提取工艺熟地黄活性成分几乎全在其水提物中, 主要活性成分为具有改善心血管系统功能作用的环烯醚萜苷类 [70] 14

29 南京中医药大学硕士学位论文 [71] 张玲等以梓醇为检测指标, 采用薄层扫描法, 考察了不同提取工艺对梓醇含量及提取浸膏量的影响, 结果表明地黄以水提取 1~2h 较为适宜, 此时梓醇含量及浸膏量均较高 [72] 雷鹏等以 5- 羟甲基糠醛及熟地黄总糖含量为评价指标, 优选熟地黄最佳提取工艺, 结果为浸泡 4h, 第 1 次加 12 倍量水, 提取 120min, 第 2 次加 10 倍量水, 提取 90min 成分鉴定 [73] 丁伟姣等在四物合剂的薄层色谱鉴别中对熟地黄的定性鉴别方法为取本品 10ml, 用乙醚回流提取 1h, 回收乙醚液至 1ml, 即得样品溶液 取熟地黄 2g, 按样品溶液制备法处理, 备用 取缺熟地黄的本品按样品液制备法制备阴性对照液, 吸上述 3 种溶液各 2μl, 分别点于同一硅胶 G 板上, 以氯仿 - 甲醇 - 氨水 (8:2:1) 为展开剂, 展开后取出 晾干, 样品色谱中, 在与熟地黄色谱相应的位置上, 显相同的两个黄色斑点, 阴性对照液无上述斑点 [74] 邹俊在增精丸薄层色谱鉴别中对熟地黄定性鉴别的方法为取本品 10g, 研细, 加乙醇 50ml, 超声提取 20 分钟, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加乙醇 1ml 使溶解, 作为供试品溶液 ; 另取熟地黄对照药材 1g, 同法制成对照药材溶液 吸取上述两种溶液各 10μl, 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 GF 254 薄层板上, 以石油醚 (60~90 )- 醋酸乙酯 (1:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯 (254nm) 下检视, 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点 阴性对照溶液无此斑点 [75] 邓如伟等在杞菊地黄颗粒中六味药材的薄层色谱鉴别中熟地黄的薄层鉴别方法为称取颗粒剂 2.2g, 研磨成细粉, 加甲醇 40ml, 超声振荡 30min, 过滤, 滤液浓缩至干, 加乙酸乙酯 2ml 溶解, 得样品供试液 ; 称取熟地黄浸膏粉 0.5g, 操作同样品供试液处理方法, 制得熟地黄药材的对照液 ; 称取熟地黄空白浸膏粉 0.85g, 操作同样品供试液处理方法, 制得熟地黄的空白对照液 吸取上述 3 种溶液各 5μl, 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上, 以正丁醇 - 冰醋酸 - 水 - 甲醇 (6:3:3:2) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 10% 硫酸 - 无水乙醇溶液, 于 105 下加热至斑点显色清晰 结果供试品溶液色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点 阴性对照溶液无此斑点 3.6 沙苑子 中国药典 2005 年版规定沙苑子为双子叶植物药豆科植物扁茎黄芪 Astragalus complanatusr.br. 的干燥成熟种子 传统认为本品具有温补肝肾 固精 缩尿 益肝明目的功效, 还是滋补 抗衰老 提高免疫机能的重要品种 现代药理学研究表明沙苑子提取物具有改善血液流变学指标, 降低血压, 调节血脂, 抑制血小板聚集, 保护肝脏, 增强免疫功能 抗炎 镇痛及调节中枢神经系统等作用 沙苑子中所含化学成分主要有氨基酸 黄酮类 三萜类 脂肪酸以及微量元素等 [76] 提取工艺 [77] 朱滨艳等将生精育康胶囊中枸杞 人参等药材粉碎过筛, 将沙苑子等药材用水煎煮成浓膏状, 合并粉末与浓膏, 干燥粉碎过 120 目筛, 装胶囊, 用药组小鼠精子数量明显高于空白组, 精子数量与用药量基本成正比, 表明生精育康胶囊对提高睾丸的生精能力有确 15

30 第一部分绪论 切的疗效 [78] 李君玲等采用正交实验法, 以总黄酮含量为考察指标, 研究沙苑子中总黄酮的提取工艺, 考察加醇量 提取次数 提取时间 乙醇浓度 4 个因素对提取工艺的影响 结果表明最佳提取工艺为药材加乙醇 20 倍量, 提取 3 次, 每次提取时间 1 小时, 乙醇浓度为 80% 成分鉴定 [79] 张玉杰等在沙苑子的品种鉴别中采用薄层鉴别, 对市售 22 种沙苑子药材采用先用石油醚脱脂, 再用 75% 乙醇超声提取, 取滤液蒸干加甲醇溶解作为供试品, 以沙苑子苷 A 为对照品, 点于聚酰胺薄膜上, 展开剂甲醇 - 水 (4:1), 显色剂 1% 三氯化铝乙醇溶液, 置于紫外灯 (365nm) 观察, 结果区别出紫云英无沙苑子苷 A 斑点, 而直立黄芪的斑点隐约可见, 扁茎黄芪与直立黄芪有部分相同斑点 3.7 水蛭 水蛭为水蛭科动物蚂蝗 Whitmania pigra Whitman 水蛭 Hirudo nipponia Whitman 或柳叶蚂蝗 Whitmania acanulata Whitman 的干燥体 性味咸 苦 平 具有破血 逐瘀 通经的功效 用于血瘀经闭, 跌打损伤 水蛭中主含水蛭素 肝素 抗血栓素以及一种组胺样物质等, 水蛭中还含有多种化学元素 氨基酸成分及蛋白质等营养成分 水蛭具有抗凝血 抗血栓作用, 水蛭对实验性高血脂症家兔的胆固醇 甘油三酯均有明显的降脂作用 水蛭对家兔主动脉粥样硬化斑块有明显的消退作用, 斑块内胶原纤维增生, 胆固醇结晶减少, 说明水蛭对防治动脉粥样硬化有潜在的应用价值 水蛭煎剂 10g/kg 灌胃给药, 对肌注甘油造成的肾功能衰竭的大鼠的肾小管病变有明显改善, 对血清尿素氮和肌酐水平有明显降低 [63] 作用, 对显著升高的血清肿瘤因子有明显的降低作用 [80] 提取工艺 [81] 刘欣等利用水蛭素和凝血酶 1:1 的配比关系测定不同条件水蛭提取液的水蛭素含量, 并配合氮含量的测定, 确定了水蛭工业提取的最佳条件 实验结果表明乙醇浓度在 70%~90% 之间, 温度在 60 左右, 提取时间 1.5h 会达到较好的提取效果 [82] 刘晔玮等以乙醇浸膏得率和浸膏中氮质量分数为评价指标, 选择乙醇体积分数 乙醇与水蛭质量比 提取时间为考察因素, 利用正交实验 L 9 (3 4 ) 确定乙醇提取水蛭最佳工艺条件为 50% 乙醇,50% 乙醇与水蛭的重量比为 6:1, 每次提取时间 1.5 小时, 共提取 2 次 平均乙醇浸膏得率为 13.24%, 浸膏中平均氮质量分数 ω(n) 为 11.05% 成分鉴定 [83] 张秋红等在 扶骨胶囊质量标准的研究 中以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 为薄层板, 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 以正丁醇 - 乙酸 - 水 (3:1:1)10 以下放置的下层溶液为展开剂, 置紫外光灯 (365nm) 下检视, 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点, 阴性无干扰 [84] 张纯等在 复方水蛭口服液的研制及其临床应用 中, 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 硅胶 G 板, 以正丁醇 - 乙醇 - 冰醋酸 - 水 (4:1:1:2) 为展开剂, 16

31 南京中医药大学硕士学位论文 上行法二次展开, 喷以 0.3% 茚三酮正丁醇液,105 显色 5min 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点 [85] 朱丹等在 复方水蛭口服液质量标准研究 中, 以硅胶 G 板, 以正丁醇 - 冰醋酸 - 水 (5:2:4) 为展开剂, 喷以 0.2% 的茚三酮丙酮液, 于 105 加热至斑点显色清晰, 供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点 3.8 王不留行 王不留行为麦蓝菜 Vaccaria segetalis(neck.)garcke 的干燥成熟种子 王不留行中主要含有三萜皂苷 黄酮苷 环肽 类脂和脂肪酸, 单糖等 性苦 平, 入肝 胃经 对行血通经, 催生下乳, 消肿敛疮 ; 妇女闭经, 乳汁不通, 难产, 血淋, 痈肿, 金疮出血等有很大效用 [86] 提取工艺 [87] 宗红心对消癥丸用水提取以及醇提取进行了正交试验, 选出最佳工艺条件为方中的浙贝母 王不留行两味药加 70% 乙醇 5 倍量, 回流提取 2 次, 每次 2h [88] 张援等对通藿王消核糖浆的煎提工艺作了正交试验, 选出较好的煮提条件是方中的淫羊藿 夏枯草 王不留行加入 15 倍 ph 为 8 的水煎煮 3 次, 每次 60min 成分鉴定 [89] 张颖等在六味散结丸质量控制研究中鉴别王不留行, 取本制剂 6g, 加甲醇 20ml, 加热回流 30min, 放冷, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加甲醇 2ml 使溶解, 作为供试品溶液 ; 另取缺王不留行的阴性对照样品, 按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液 ; 另取王不留行对照药材 1.5g 同法制成对照品溶液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 吸取上述 3 种溶液各 10μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以三氯甲烷 - 甲醇 - 水 (15:7:2) 的下层溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以改良碘化铋钾试液 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同的橙红色斑点 [90] 李梅等在乳康片中王不留行的鉴别中, 分别吸取乳康片供试品溶液 王不留行阳性对照液 王不留行阴性对照液各 10μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正丁醇 - 醋酸乙酯 - 水 (4:1:5) 的上层液为展开剂展开, 取出, 晾干 喷以 10% 硫酸溶液,105 加热 5min, 供试品色谱中, 在与对照药材相应的位置上, 显相同的紫红色斑点, 王不留行阴性对照色谱中无此斑点 [91] 申玉华等在玉仁丰乳丸质量标准研究中鉴别王不留行, 取此丸剂粉末 7g, 加水 50ml 浸泡 1h 后, 超声处理 30min, 离心 (3000r/min)15min, 上清夜移至已处理好的 D 101 大孔吸附树脂柱 ( 内径 2cm, 柱长 15cm, 湿法装柱 ), 水洗至溶液无色, 再用 20% 乙醇洗脱, 收集 150ml, 将洗脱液蒸干, 残渣加水饱和正丁醇 30ml, 溶解, 加氨试液摇洗, 放置分层, 取上层液蒸干, 加甲醇 1ml 使溶解, 作为供试品溶液 ; 另取王不留行对照药材 1.5g, 粉碎, 加 20% 乙醇 30ml, 超声处理 30min, 滤过, 滤液蒸干, 加甲醇 1ml 使溶解, 作为对照药材溶液 吸取上述两种溶液各 5μl, 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正丁醇 - 醋酸 - 水 (4:1:5) 上层 17

32 第一部分绪论 溶液为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 30% 硫酸乙醇液,105 烘数分钟, 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点 3.9 紫河车 本草纲目 称人胎盘为紫河车, 紫河车 味甘 咸 性温, 具有 安神养血 补气 益精 解毒 补血的作用, 对 疲劳 消瘦 衰弱者 有奇效, 久服者, 耳聪目明, 须发黑, 延年益寿, 有夺造化之功 紫河车的成分较复杂, 经分析测定已得到证实的主要包括丙种球蛋白 激素 酶及酶抑制因子 细胞因子 氨基酸 微量元素和维生素等 药理作用主要有免疫调节作用 抗缺氧 耐疲劳 营养和生长因子作用等 临床常应用于治疗慢性支气管炎 肝炎 消化性溃疡及慢性溃疡等, 治疗缺乳, 不孕 不育等 [92] 提取工艺 [93] 陈元成等取女性抗衰合剂处方规定量的中药材, 混合粉碎成 5 目粗颗粒, 加 10 倍量的水蒸馏 2h, 收集馏出液另存, 继续煮沸 1h, 滤取煎液 第二次加 5 倍量的水, 煮沸 0.5h, 滤取煎液, 合并 2 次煎煮液, 静置 12h, 滤过, 取上清液, 浓缩至一定的相对密度, 加入乙 [94] 醇使含醇量达到 65%, 静置 48h, 取上清液, 回收乙醇并浓缩至一定相对密度 王剑波等 在制备紫参血康片过程中, 考虑到各味药材的有效成分, 药理作用及不同的理化性质, 拟确定不同的提取方法 其中灵芝 丹参 当归, 既有脂溶性成分又有水溶性成分, 因此宜采取先醇提再水提的方法 其余诸药 ( 含紫河车 ) 以水溶性成分为主, 均水煎入药 为摸索最佳醇提工艺, 选择丹参中有代表意义的脂溶性成分之一的丹参酮 П 和当归中有效成分之一的阿魏酸作为优选醇提脂溶性成分的评估指标进行了多因素正交试验 成分鉴定 [95] 张浚等在加味调经种玉丸中紫河车的薄层鉴别方法是 : 取本品粉末 5 g, 研细, 加乙醚 20ml, 冷浸 24h, 滤过, 取滤液作为供试品溶液 另取紫河车对照药材 1g, 同法制成对照药材溶液 另取按处方配制的缺紫河车的阴性对照药材 5g, 同法制成阴性对照溶液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 分别吸取上述 3 种溶液各 10μl 分别点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正己烷 - 醋酸乙酯 (9:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以 20%HClO 4 溶液, 于 105 烘至斑点清晰, 日光下检视 供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同紫红色的斑点, 而阴性样品溶液在相应的位置上无此斑点 [96] 芦金清等通过薄层色谱鉴别茯参胶囊中的紫河车, 取茯参胶囊中内容物 2g, 加无水乙醇 20ml, 加热回流 1h, 滤过, 滤液作为供试品溶液 另取紫河车 1g 和缺紫河车阴性对照品 2g, 同法制成对照药材溶液和阴性对照样品液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2000 年版一部附录 VI B) 试验, 吸取上述三种液各 15ml, 分别点于同一硅胶 G 板上, 以正丁醇 - 甲酸 - 水 (75:15:10) 为展开剂, 展开, 取出晾干, 喷以 10% 香草醛溶液, 105 烘烤至显色清晰 供试品色谱中, 在与对照品色谱相应位置上, 显相同颜色的斑点, 阴性无干扰 [97] 谢玲等在三康胶囊质量标准的研究中鉴别紫河车, 取三康胶囊内容物 4g, 加乙醚 30ml, 回流 30min, 过滤, 取滤液, 挥干, 加乙醚 1ml 溶解作为供试品溶液 另取紫河车对 18

33 南京中医药大学硕士学位论文 照药材 1g, 加乙醚同上法制成对照药材溶液 照薄层色谱法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VI B) 试验, 分别吸取上述 2 种溶液各 10μl, 点于同一硅胶 G 薄层板上, 以正己烷 - 乙酸乙酯 (9:1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷 20% 高氯酸溶液,105 加热至色斑清晰, 供试品色谱中, 在与紫河车对照药材色谱相应位置有相同红褐色斑点 19

34 第二部分药学实验研究 第二部分药学实验研究 1 复方益精胶囊原料来源及鉴定依据 复方益精胶囊处方由淫羊藿 当归 黄芪 紫河车 熟地黄 黄精 水蛭 沙苑子 王不留行 ( 炒 ) 组成 本部分就制剂原料的来源及品质进行了研究 1.1 淫羊藿 本品为小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim 的干燥地上部分 产地陕西 本制剂中淫羊藿按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料, 饮片经性状鉴别 薄层鉴别 水分检查 总灰分检查 淫羊藿苷含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部淫羊藿项下有关规定, 其中淫羊藿苷含量测定结果见表 当归 表 2-1 淫羊藿饮片中淫羊藿苷的含量测定 Table2-1 Determination of Icariin in Herba epimedii NO. 淫羊藿苷 (%) 平均值 (%) RSD(%) 本品为伞形科植物当归 angellica sinensis (Oliv) Diels 的根 产地甘肃 本制剂中当归 按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料, 饮片经性状鉴别 薄层鉴别 水分检查 总灰分 检查 酸不溶性灰分检查 浸出物检查 阿魏酸含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部当归项下有关规定, 其中当归含量测定结果见表 2-2 表 2-2 当归中阿魏酸的含量测定 Table2-2 Determination of ferulic acid in Radix Angelicae Sinensis NO. 阿魏酸 (%) 平均值 (%) RSD(%) 黄芪 本品为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var.mo-ngholicus (Bge.) Hsiao 的干燥根 产地内蒙古 本制剂中黄芪按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 薄层色谱鉴别 总灰分 酸不溶性灰分 重金属及有害元素 有机氯农药残留量检查 浸出物测定 含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部黄芪项下有关规定 其中黄芪含量测定结果见表

35 南京中医药大学硕士学位论文 表 2-3 黄芪中黄芪甲苷的含量测定 Table2-3 Determination of astragloside Ⅳ in Radix Astragali NO. 黄芪甲苷 (%) 平均值 (%) RSD(%) 紫河车 紫河车为健康产妇的胎盘 本制剂中紫河车按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料 1.5 熟地黄 本品为玄参科植物生地黄 Rehmannia glutinosa Libosch 的新鲜或干燥块根的炮制加工品 产地河南 本制剂中熟地黄按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 薄层色谱鉴别 浸出物检查 含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部熟地黄项 下有关规定 1.6 黄精 本品是百合科植物滇黄精 Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl 的干燥根茎 产地云南 本制剂中黄精按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 水分检查 总灰分检查 浸出物检查及黄精多糖含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部黄精项 下有关规定 1.7 水蛭 水蛭为水蛭科动物蚂蝗 Whitmania pigra Whitman 的干燥全体 产地江西 本制剂中水蛭按药典炮制项烫水蛭下要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 薄层色谱鉴别 水分 总灰分 酸不溶性灰分 浸出物检查及抗凝血酶活性单位含量测定, 结果均符合 中国药 典 2005 年版一部水蛭项下有关规定 1.8 沙苑子 沙苑子为豆科植物扁茎黄芪 Astragalus complanatus R. Br. 的干燥成熟种子 产地内蒙古 本制剂中沙苑子按药典炮制项下要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 薄层色谱鉴别 水分 总灰分 酸不溶性灰分 含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部 沙苑子项下有关规定 1.9 王不留行 王不留行为石竹科植物麦蓝菜 Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke] 的干燥成熟种子 产地河北 本制剂中王不留行按药典炮制项下炒王不留行要求炮制后以饮片投料 饮片经性状鉴别 薄层色谱鉴别 水分 总灰分 浸出物测定 含量测定, 结果均符合 中国药典 2005 年版一部王不留行项下有关规定 21

36 第二部分药学实验研究 2 复方益精胶囊制剂工艺研究 2.1 剂型选择 本方为著名中医男科专家的经验方, 作为医院制剂在临床已经使用多年, 临床证明安全有效 因此, 在不改变给药途径的前提下, 兼顾处方药物所含的活性成分, 遵照原方, 选择服用 携带 贮藏 运输 生产都方便的胶囊剂作为本产品的剂型, 可以掩盖药物不 良气味, 提高药物的稳定性 2.2 醇提工艺研究 文献研究表明当归代表性成分为阿魏酸, 乙醇提取工艺中阿魏酸的提取率优于水煎煮提取 ; 黄芪的主要成分为黄芪甲苷, 水蛭的有效成分主要为水蛭素, 王不留行主要有效成分为三萜皂苷 黄酮苷等, 以上成分均在乙醇中有较好的溶解性, 故当归 生黄芪 水蛭 王不留行采用乙醇提取, 并以阿魏酸和黄芪甲苷为考察指标 为了确定当归 黄芪 水蛭 王不留行等醇提取的最佳工艺条件, 以方中主要药味所含的活性成分阿魏酸和黄芪甲苷含量评价指标, 对可能的影响因素 : 加醇量 醇浓度 提取次数 提取时间进行了考察 A 仪器 试剂与药品 A.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪 ;VWD 检测器 ; 蒸发光散射检测器 ; 电子天平 (Mettler Toledo AG285);KQ-500E 型医用超声清洗器 ( 昆山超声仪器有限公司 ); 水浴锅 ( 巩义市英峪予华仪器厂 ); 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); 自动双重纯水蒸馏器 A.2 试剂与药品阿魏酸对照品 ( 中国药品生物制品检定所, 供含量测定用, 批号 : ); 黄芪甲苷对照品 ( 中国药品生物制品检定所, 供含量测定用, 批号 : ); 甲醇为色谱纯 ; 其余所用试剂均为分析纯, 购自上海化学试剂有限公司 ; 水为重蒸水 ( 自制 ) B 方法与结果 B.1 正交实验设计采用 L 9 (3 4 ) 正交表进行正交设计, 对乙醇的浓度 用量 提取次数 提取时间进行考察, 以阿魏酸 黄芪甲苷含量为考察指标, 进行提取工艺最佳参数的确定 其提取工艺因素水平设计见表 2-4 按制剂处方工艺分别取当归 生黄芪 水蛭 王不留行 ( 剂量略 ), 共 9 份, 按正交表相应的因素水平 ( 表 2-4) 回流提取, 提取液过滤, 分别合并, 减压回收乙醇, 浓缩至无醇味的稠膏, 备用 22

37 南京中医药大学硕士学位论文 表 2-4 醇提工艺因素水平表 Table2-4 The exeperimental factors and levels L 9 (3 4 ) of alcohol extracting technology 因素 乙醇浓度 (%) 乙醇用量 ( 倍 ) 提取次数 提取时间 (h) 水平 A B C D B.2 考察指标的含量测定 B.2.1 HPLC 法测定阿魏酸含量 B 色谱条件色谱柱为大连依利特 Hypersil ODS 柱 (4.6mm 150mm,5μm); 以甲醇 -0.1% 磷酸溶液 (30:70) 为流动相 ; 检测波长 316nm; 流速 1.0ml/min; 柱温 :35 B 对照品溶液制备精密称取阿魏酸对照品适量, 用 70% 甲醇溶解并配制成 3.285µg/ml,6.570µg/ml 的溶液作为对照品溶液 B 供试品溶液的制备取约相当于 0.2 g 当归药材的稠膏适量, 精密称定, 置离心管中, 精密加入 70% 甲醇 20ml, 密塞, 超声处理 1 小时, 过滤, 置于 25ml 棕色量瓶中, 加 70% 甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得 B 样品中阿魏酸含量测定分别精密吸取对照品溶液 ( 浓度分别为 :3.285µg/ml,6.570µg/ml ) 和各供试品溶液 10μl, 注入液相色谱仪, 测定, 每个样品平行进样 2 次, 以外标两点法计算测定各样品中的阿魏酸含量 结果见表 B.2.2 HPLC 法测定黄芪甲苷含量 B 色谱条件色谱柱为大连依利特 Hypersil ODS 柱 (4.6mm 150mm,5μm); 以甲醇 - 水 (79:21) 为流动相 ; 柱温 : 室温 ; 流速 :1ml/min;ELSD 漂移管温度 :90 ; 雾化气流速 :2.20 SPLM B 对照品溶液制备精密称取黄芪甲苷对照品适量置于 25ml 量瓶中, 加甲醇制成每 1ml 含 1mg( 实含 0.986mg) 的溶液, 作为对照品储备溶液 B 供试品溶液的制备取约相当于 4g 黄芪药材的稠膏, 加水 10ml, 超声溶解 30 分钟, 用水饱和正丁醇振摇提取 4 次, 每次 40ml, 合并正丁醇液, 用氨试液充分洗涤 2 次, 每次 40ml, 弃去氨试液, 23

38 第二部分药学实验研究 正丁醇液蒸干 残渣加蒸馏水 5ml 使溶解, 放冷, 通过 D 101 型大孔树脂柱 ( 内径 1.5cm, 长 12cm), 以水 50ml 洗脱, 弃去水液, 再用 40% 乙醇 30ml 洗脱, 弃去 40% 乙醇洗脱液, 继续用 70% 乙醇 50ml 洗脱, 收集洗脱液, 蒸干, 用甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中, 甲醇定容至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得 B 样品中黄芪甲苷含量测定分别精密吸取对照品溶液 ( 浓度分别为 mg/ml,0.4930mg/ml )10μl 和各供试品溶液各 10μl, 注入液相色谱仪, 测定, 每个样品平行进样 2 次, 以外标两点法计算, 测定各样品中的黄芪甲苷含量 结果见表 2-5, 表 2-7 表 2-5 醇提工艺 L 9 (3 4 ) 正交试验结果表 Table2-5 The results of orthogonal experiment for alcohol extracting technology No A B C D 阿魏酸 (mg) 黄芪甲苷 (mg) 阿魏酸 K K CT= K SS i 黄芪甲苷 K K CT= K SS i m 阿魏酸 = c 样 25 m m 样 总浸膏

39 南京中医药大学硕士学位论文 m 黄芪甲苷 C = 样 5 m m 样 总浸膏 表 2-6 阿魏酸方差分析表 Table2-6 The variance analysis results of ferulic acid 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 显著性 A B * D C( 误差 ) F (2,2)=19.00,F (2,2)=99.00 表 2-7 黄芪甲苷方差分析表 Table2-6 The variance analysis results of astragloside Ⅳ 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 显著性 A B C D( 误差 ) F (2,2)=19.00,F (2,2)=99.00 结果表明 : 综合阿魏酸 黄芪甲苷方差分析结果, 结合实际生产, 确定最佳醇提工艺条件为 A 2 B 3 C 2 D 2, 即 : 加饮片总量 18 倍量的 70% 乙醇, 分两次提取, 每次 1.5 小时 B.3 最佳醇提工艺条件的验证按制剂处方取当归 生黄芪 水蛭 王不留行 ( 剂量略 ), 按正交试验得到的最佳工艺条件, 即饮片加总量 18 倍量的 70% 乙醇分两次提取, 每次 1.5 小时 合并两次提取液, 过滤, 减压回收乙醇, 浓缩至无醇味, 取样测定浸膏中阿魏酸 黄芪甲苷的含量 平行三份 结果见表

40 第二部分药学实验研究 表 2-8 醇提工艺验证结果 Table2-8 The verification results of optimum alcohol extraction process NO. 每份样品中阿魏阿魏酸含量每份样品中黄芪甲黄芪甲苷含量酸含量 (mg) (%) 苷含量 (mg) (%) 平均值 RSD(%) 注 : 当归药材中阿魏酸的含量为 0.078%, 黄芪药材中黄芪甲苷含量为 0.071% 由表 2-8 可见, 三次试验所测得的阿魏酸 黄芪甲苷含量与最佳工艺所测得的平均含量 比较相近, 并且阿魏酸和黄芪甲苷转移率都在 50% 以上, 说明该工艺稳定 可行 2.3 水提工艺研究 文献研究表明淫羊藿主要成分为多糖和黄酮类成分, 此类成分均可溶于水 ; 熟地黄活性成分几乎全在其水提物中 ; 黄精的有效成分为黄精皂苷 黄精多糖甲, 乙, 丙等 ; 紫河车 沙苑子以水溶性成分为主, 故淫羊藿 紫河车 熟地黄 黄精 沙苑子采用水提, 并以淫羊藿苷和总多糖为考察指标 为了确定淫羊藿 熟地黄 黄精 紫河车 沙苑子水煎最佳条件, 以方中主要药味所含的有效成分淫羊藿苷及总多糖含量为评价指标, 对可能的影响因素 : 加水量 提取次数 提取时间进行了考察 A 仪器 试剂与药品 A.1 仪器 AgiLent 1100 高效液相色谱仪 ;VWD 检测器 ; UV-2401 紫外扫描分光光度仪 ( 日本岛津公司 );752 型紫外分光光度计 ( 上海光谱仪器有限公司 ); 电子天平 (Mettler Toledo AG285); 水浴锅 ( 巩义市英峪予华仪器厂 );KQ-500E 型医用超声清洗器 ( 昆山超声仪器有限公司 ); 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); 自动双重纯水蒸馏器 A.2 试剂与药品淫羊藿苷对照品 ( 中国药品生物制品检定所, 供含量测定用, 批号 : ); 葡萄糖标准品 ( 上海试剂三厂 ); 甲醇为色谱纯, 其余所用试剂均为分析纯, 均购自上海化学试剂有限公司 B 方法与结果 B.1 正交实验设计采用 L 9 (3 4 ) 正交表进行正交设计, 对加水量 提取次数 提取时间进行考察, 以淫羊藿苷及总多糖含量为考察指标, 进行水煎煮工艺最佳参数的确定 其提取工艺因素水平设计 26

41 南京中医药大学硕士学位论文 见表 2-9 按处方配比称取淫羊藿 熟地黄 黄精 紫河车 沙苑子等饮片共九份, 加入相应处方量的按最佳醇提工艺提取后的药渣, 按相应的因素水平进行水煎煮, 水煎液过滤, 合并水煎液, 浓缩成浸膏, 备用 表 2-9 水提工艺因素水平表 L 9 (3 4 ) Table2-9 The exeperimental factors and levels of water-extracting technology L 9 (3 4 ) 因素 加水量 ( 倍 ) 提取时间 (h) 提取次数 空列 水平 A B C D B.2 考察指标含量的测定 B.2.1 淫羊藿苷含量测定 B 色谱条件色谱柱为大连依利特 Hypersil ODS 柱 (4.6mm 150mm,5μm); 以乙腈 - 水 (28:72) 为流动相 ; 检测波长 270nm; 流速 1.0ml/min; 柱温 :30 B 对照品溶液制备精密称取淫羊藿苷对照品适量, 加甲醇制成每 1ml 含 1mg( 实得 0.994mg) 的溶液, 作为对照品储备溶液 B 供试品溶液的制备取约相当于 0.2g 淫羊藿药材的正交样品稠膏, 精密称定, 置离心管中, 精密加入稀乙醇 20ml, 称定重量, 超声处理 1 小时, 再称定重量, 用稀乙醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得 B 样品中淫羊藿苷含量测定分别精密吸取对照品溶液 ( 浓度分别为 24.85µg/ml,198.8µg/ml)10μl, 各供试品溶液 10μl, 注入液相色谱仪, 测定, 以外标两点法计算淫羊藿苷含量, 即得 结果见表 B.2.2 多糖的含量测定 B 对照品溶液制备精密称取 105 干燥至恒重的无水葡萄糖 38.80mg 置于 100ml 量瓶中, 加蒸馏水制成每 1ml 含 0.388mg 的溶液, 作为对照品储备溶液, 精密量取对照品储备溶液 ml, 分别置 10ml 具塞干燥试管中, 各加水至 2.0ml, 摇匀, 在冰水浴中缓缓滴加 0.2% 蒽酮 - 硫酸溶液至刻度, 混匀, 放冷后置水浴中保温 10 分钟, 取出, 立即置冰水浴中冷却 10 分钟, 取出, 即得 27

42 第二部分药学实验研究 B 供试品溶液的制备 称取相当于 2g 生药量的水提正交样品稠膏置 250ml 锥形瓶中, 加 80% 乙醇 150ml, 超声处理 1 小时, 滤过, 残渣用 80% 乙醇洗涤 3 次, 每次 10ml, 将残渣和滤纸置 250ml 锥形瓶中, 加水 150ml 溶解, 超声 1h, 滤过, 残渣及锥形瓶用水洗涤 4 次, 每次 10ml, 合并滤液和洗涤液, 转移至 250ml 量瓶中, 加蒸馏水定容至刻度 精密量取 1ml, 置 10ml 具塞干燥试管中, 自 加水至 2.0ml 起同对照品溶液的制备 B 样品中多糖含量的测定 以相应试剂为空白 葡萄糖作对照 ( 浓度分别为 mg/ml, mg/ml ), 采 用紫外 - 可见分光光度法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 ⅤA), 在 620nm 波长处测定吸光 度, 外标两点计算其含量 结果见表 表 2-10 水提工艺 L 9 (3 4 ) 正交试验结果表 Table2-10 The results of orthogonal experiment for water-extracting technology No A B C D 淫羊藿苷多糖 (%) (%) 淫羊藿苷 K K CT= K SS i 多糖 K K CT= K SS i c 淫羊藿苷 c样 20 m = m 样 28 总浸膏 6 100%

43 南京中医药大学硕士学位论文 C 多糖 c = 样 m m 取样 总浸膏 % 表 2-11 淫羊藿苷含量方差分析表 Table2-11 The variance analysis results of Icariin 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 显著性 A B C D F (2,2)=19.00,F (2,2)=99.00 表 2-12 多糖含量方差分析表 Table2-12 The variance analysis results of polysaccharide 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 显著性 A B C D F (2,2)=19.00,F (2,2)=99.00 结果表明 : 综合淫羊藿苷 多糖方差分析结果, 结合实际生产, 确定最佳水提工艺条 件为 A 2 B 3 C 2, 即加饮片总量 20 倍量的水, 分 2 次煎煮, 每次 2 小时 B.3 最佳水提工艺条件的验证 按处方比例称取淫羊藿 紫河车 熟地黄 黄精 沙苑子 ( 剂量略 ), 共 3 份, 加入 比例量的按最佳醇提工艺提取后的药渣, 按最佳水提工艺进行提取, 合并水提液, 浓缩至 浸膏, 取样测定浸膏中淫羊藿苷 总多糖的含量, 色谱条件和供试品溶液的制备方法与正 交试验样品相同 结果见表 2-13 表 2-13 水提工艺验证试验结果 Table2-13 The verification results of optimum water extraction process No 淫羊藿苷含量平均值 RSD 总多糖百分含量平均值 RSD (%) (%) (%) (%) (%) (%) 注 : 淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量为 0.83% 29

44 第二部分药学实验研究 由表 2-13 可见, 三次试验所测得的淫羊藿苷 多糖含量与最佳工艺所测得的平均含 量比较相近, 且淫羊藿苷转移率在 50% 以上, 说明该工艺稳定 可行 2.4 精制工艺研究 为了减少胶囊的服用剂量, 掩盖其不良气味, 试验选用适合工业化大生产的水提醇沉法进行精制研究 称取处方量当归 生黄芪 水蛭 王不留行按照上述最佳醇提工艺进行醇提, 所得药渣与淫羊藿 紫河车 熟地黄 黄精 沙苑子按照上述最佳水提工艺进行水提, 所得水提液浓缩至相对密度为 1.05~1.08(60 ), 平均分为 20 份, 每 5 份一组, 分别采取不醇沉 40% 醇沉 50% 醇沉 60% 醇沉的方法处理, 分别滤过, 所得滤液减压回收乙醇并浓缩成稠膏, 分别取样测定其中淫羊藿苷及多糖的含量 结果见表 表 2-14 不同浓度乙醇醇沉对淫羊藿苷 多糖含量比较 Table2-14 Comparision of different alcohol precipitation ways on Icariin and Polysaccharide 处理方法 淫羊藿苷 百分含量 (%) 平均值 (%) 总多糖量 百分含量 (%) 未醇沉 平均值 (%) % 乙醇醇沉 % 乙醇醇沉 % 乙醇醇沉 就以上的数据结果, 采用 SPSS11.0 软件包进行处理, 运用 Q 检验考察因不同浓度乙醇 30

45 南京中医药大学硕士学位论文 醇沉处理对淫羊藿苷 多糖含量的影响 数据处理结果如下 : 表 2-15 不同浓度乙醇醇沉对淫羊藿苷含量的影响 (Q 检验 ) Table2-15 Effect of different alcoholic concentration on (Q-check) Dependent Variable: 未醇沉 LSD Multiple Comparisons (I) VAR00001 未醇沉 40% 乙醇 50% 乙醇 60% 乙醇 (J) VAR % 乙醇 50% 乙醇 60% 乙醇未醇沉 50% 乙醇 60% 乙醇未醇沉 40% 乙醇 60% 乙醇未醇沉 40% 乙醇 Mean Difference 95% Confidence Interv al (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound 表 50% 2-16 乙醇不同浓度乙醇醇沉对淫羊藿苷的影响 (Q 检验 ) Table2-16 表 2-16 不同浓度乙醇醇沉对总多糖含量的影响 (Q 检验 ) Effect of different alcoholic concentration on Polysaccharide ((Q-check) Dependent Variable: 未醇沉 LSD Multiple Comparisons (I) VAR00001 = 未醇沉 40% 乙醇 50% 乙醇 60% 乙醇 (J) VAR % 乙醇 50% 乙醇 60% 乙醇 = 未醇沉 50% 乙醇 60% 乙醇 = 未醇沉 40% 乙醇 60% 乙醇 = 未醇沉 40% 乙醇 50% 乙醇 *. The mean difference is significant at the.05 level. Mean Difference 95% C onfidence Interval (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound * * * * * * 结果表明,40% 乙醇 50% 乙醇和 60% 乙醇醇沉对淫羊藿苷含量与处理前相比均无显著性影响 ;40% 乙醇 50% 乙醇醇沉对多糖含量与处理前相比均无显著性影响, 而 60% 乙 31

46 第二部分药学实验研究 醇醇沉对多糖含量有显著性影响 综合上述各处理方法对淫羊藿苷及多糖的影响结果, 考虑到活性成分的提取以及生产 成本, 兼顾本制剂的服用剂量及成型, 确定水提液浓缩后加乙醇至含醇量达 50% 为最佳 2.5 浓缩工艺研究 结合大生产条件及实际生产中操作的可行性, 工艺过程中拟采用减压薄膜浓缩, 此法工序简单 可连续生产, 且具有有效成分受热温度低 时间短等优点 按制剂处方量称取当归 生黄芪 水蛭 王不留行, 按照上述最佳醇提工艺进行醇提, 所得药渣与淫羊藿 紫河车 熟地黄 黄精 沙苑子合并, 按照上述最佳水提工艺进行水提, 所得水提液减压浓缩至相对密度 1.05~1.08(60 ), 加乙醇使含醇量达 50%, 冷藏 48 小时, 滤过, 滤液与上述醇提液合并, 平均分成 5 份, 分别取样测定淫羊藿苷及黄芪甲苷的含量, 再经 0.08Mpa 60 减压回收乙醇并浓缩成稠膏, 取样测定稠膏中淫羊藿苷及黄芪甲苷的含量 ( 以淫羊藿 黄芪药材量计 ) 结果经 t 检验, 比较浓缩前后指标性成分含量的差异, 结果见表 2-17 NO. 表 2-17 Table2-17 浓缩工艺对淫羊藿苷及黄芪甲苷含量的影响 Effect of concentration on Icariin and astragloside Ⅳ 淫羊藿苷 (%) 黄芪甲苷 (%) 浓缩前浓缩后浓缩前浓缩后 平均含量 上述结果经 t 检验比较, 浓缩前后淫羊藿苷和黄芪甲苷含量未见显著性差异, 说明采用 减压浓缩方法可行 2.6 干燥工艺研究 为了减少服用剂量及便于颗粒成型, 同时结合现有的生产条件, 工艺过程中拟将处方药材提取液经浓缩 真空干燥成浸膏粉, 供制粒用 真空干燥具有工序简单, 可连续生产, 且有效成分受热相对温度较低等优点, 故选用真空干燥法, 直接将药材提取浓缩液真空干燥成粉末 直接根据生产预试验选择本制剂真空干燥的相关参数为 : 浓缩液相对密度 1.10~1.15 (60 热测 ), 真空干燥条件为温度 65~75 干燥箱内负压 0.080~0.085MPa 进行干燥, 在上述条件下制得干燥粉末呈浅棕色至棕褐色疏松的固体粉末, 同时进行干燥前后淫羊藿苷 黄芪甲苷 ( 以淫羊藿 黄芪药材量计 ) 含量测定 结果见表

47 南京中医药大学硕士学位论文 NO. 表 2-18 干燥工艺对淫羊藿苷及黄芪甲苷含量的影响 Table2-18 Effect of drying on Icariin and Astragloside Ⅳ 淫羊藿苷 (%) 黄芪甲苷 (%) 干燥前干燥后干燥前干燥后 平均含量 根据上述结果, 真空干燥前后比较 (t 检验 ), 未见显著性差异, 说明采用真空干燥方法可行 确定真空干燥条件为 : 药材提取液经适当处理浓缩至相对密度 1.10~1.15(60 ), 真空干燥条件为温度 65~75 干燥箱内负压 0.080~0.085MPa 进行干燥, 在上述条件下制 得干燥粉末呈浅棕色至棕褐色疏松的固体粉末, 含水量在 3% 以内 2.7 制剂成型工艺研究以流动性和制粒难易为重点指标考察制剂成型工艺 制剂辅料的研究 微粉硅胶 : 湖州展望化学药业有限公司生产, 符合 中国药典 2005 年版二部硅胶项下有关规定 空心胶囊 : 苏州胶囊有限公司, 符合 中国药典 2005 年版二部空心胶囊项下有关规定 干浸膏粉流动性及吸湿性测定 (1) 干浸膏粉流动性测定休止角的测定 : 取干浸膏粉 50g, 置玻璃漏斗中让其自然流下, 测定其堆积休止角 结果见表 2-19 表 2-19 干浸膏粉的流动性测定 Table 2-19 Determination of the flow of extract granulating NO. 休止角平均值 RSD(%) 结论 : 干浸膏粉体的流动性较差 (2) 干浸膏粉吸湿性测定精密称取样品 2g, 置已知重量的称量瓶中, 平行试验 3 份, 分别置于相对湿度为 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 的干燥器内,25 放置 7 天, 称定重量, 计算各相对 33

48 第二部分药学实验研究 湿度下的平衡吸湿量及平衡吸湿率, 以平衡吸湿率为纵坐标, 相对湿度为横坐标绘制吸湿 曲线, 得临界相对湿度 结果见表 2-20 图 2-1 表 2-20 不同相对湿度下干浸膏粉的平衡吸湿量 (n=3) Table2-20 Effect of different humidity on extract granulating (n=3) NO. 相对湿度 (%) 平衡吸湿率 (%) RSD(%) 结果表明, 该样品临界相对湿度为 60%, 提示制粒 分装宜在相对湿度 60% 以下进 行 制粒条件的选择 为了减少全浸膏粉的引湿性, 增强流动性, 在胶囊充填之前, 拟将上述浸膏粉加入适 量微粉硅胶和乙醇进行湿法制粒, 试验比较了不同浓度乙醇对制粒的影响, 结果见表 2-21 表 2-21 不同浓度乙醇对制粒的影响 Table2-21 Effect of different alcohol concent on granulating NO. 乙醇浓度 (%) 制粒情况 1 90 制软材时易结块, 制粒困难, 粘筛 2 95 制软材时无结块, 制粒容易 3 98 制软材时无结块, 制粒容易, 但颗粒松散 为改善流动性, 添加适量微粉硅胶, 用 95% 乙醇制粒, 通过休止角的测定比较了不同用量的微粉硅胶对流动性的影响, 结果见表

49 南京中医药大学硕士学位论文 表 2-22 不同用量微粉硅胶对颗粒流动性的影响 Table2-22 Effect of different colloidal silicon dioxide compound on flow of granules 微粉硅胶用量 NO. 休止角流动性 (%) 47.2 流动性没有明显变化 流动性略微改善 流动性显著改善 通过上述试验, 确定制粒条件为浸膏粉加入 1.2% 微粉硅胶, 用 95% 乙醇适量制粒 颗粒流动性及吸湿性测定 (1) 颗粒流动性测定取本品颗粒, 按前述浸膏粉体止角测定方法测定其休止角 结果见表 2-23 表 2-23 颗粒的流动性测定 Table 2-23 Determination of the flow of particles NO. 休止角平均值 RSD(%) 结论 : 干浸膏粉体经制粒后, 流动性显著增加 (2) 颗粒吸湿性测定精密称取样品 2g, 置已知重量的称量瓶中, 平行试验 3 份, 分别置于相对湿度为 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 的条件下,25 放置 7 天, 称定重量, 计算各相对湿度下的平衡吸湿量及平衡吸湿率, 以平衡吸湿率为纵坐标, 相对湿度为横坐标绘制吸湿曲线, 得临界相对湿度, 结果见表 2-24 图

50 第二部分药学实验研究 表 2-24 不同相对湿度下颗粒的平衡吸湿量 (n=3) Table2-24 Effect of different humidity on granules(n=3) NO. 相对湿度平衡吸湿率 (%) RSD(%) (%) 平衡吸湿率 (%) 干浸膏粉颗粒 相对湿度 (%) 图 2-1 干浸膏粉与颗粒的平衡吸湿曲线 Figure 2-1 The curve of extract granulating and granule s moisture absorption 上图 ( 图 2-1) 结果表明, 制粒后, 样品临界相对湿度略有增加, 提示制粒 分装宜在相对湿度 60% 以下进行 36