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1 868 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): 芹菜素分子印迹聚合物的合成及谱学研究 * 李丽丽, 陈小明 ( 湘潭大学化学学院, 湖南湘潭 ) 摘要 : 采用分子印迹技术合成芹菜素分子印迹聚合物 紫外光谱法证明了模板分子与功能单体之间存在相互作用, 据此选择了聚合反应合适的溶剂并推测出聚合物的印迹机制 ; 傅立叶红外光谱仪测定了聚合物的结构特征 ; 平衡结合实验研究了聚合物的吸附特性 结果表明, 在所研究的浓度范围内 (0.1~2.5 mmol L 1 ), 印迹聚合物的吸附量大于空白聚合物的吸附量, 由 Scatchard 分析得聚合物对芹菜素的识别主要有两类结合位点, 其离解常数 K D 和最大表观结合量 Q max 分别为 mmol L 1 和 µmol g 1 分子印迹聚合物呈现出空白聚合物没有的高选择性 关键词 : 分子印迹聚合物 ; 芹菜素 ; 紫外光谱 ; 红外光谱 ; Scatchard 分析中图分类号 : O657.3 文献标识码 : A 文章编号 : (2009) Preparation and spectral characterization of apigenin molecularly imprinted polymer LI Li-li, CHEN Xiao-ming * (College of Chemistry, Xiangtan University, Hunan , China) Abstract: An apigenin molecularly imprinted polymer was prepared by bulk polymerization using apigenin as template, acrylamide (AA) as a functional monomer, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as a crosslinking agent, acetonitrile and N, N-dimethylformamide as porogenic solvents, and 2, 2 -azobisisobutyronitrile (AIBN) as an initiator. The interaction between template and functional monomer was proved by ultraviolet visible (UV) spectrophotometry and based on the results, appropriate reaction solvent was selected and the synthesizing process was estimated. The molecularly imprinted polymer structure was analyzed by Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectrophotometry. The molecularly imprinted polymer was investigated in equilibrium binding experiment to evaluate its adsorption property, the results showed that the adsorption of apigenin on molecularly imprinted polymer is higher than that on blank polymer in the studied concentration range ( mmol L 1 ). Scathcard analysis showed that two classes of binding sites existed in the apigenin imprinted polymers, with their K D and Q max estimated to be , mmol L 1 and 2.65, µmol g 1, respectively. Molecularly imprinted polymer showed higher affinity than blank polymer. Key words: molecularly imprinted polymer; apigenin; UV absorption spectral; FI -IR; Scatchard analysis 分子印迹技术是制备对印迹分子具有预选性的 聚合物的技术, 其关键是制备对印迹分子具有特异 选择性且高度稳定的聚合物 这类聚合物具有识别性 能好 选择性可预定 化学性质稳定 对环境耐受性 强和制备相对简单等优点, 在色谱分离 [1] 光学异构 收稿日期 : * 通讯作者 Tel: , cxm@xtu.edu.cn 体分离 [2, 3] 模拟酶催化剂 [4, 5] 控释药物 [6] 膜分离 和固液萃取 [7,8] [9, 仿生传感器 10] [11] 抗体模拟等领域 具有广阔的应用前景 黄酮类化合物广泛分布于中草药和植物中, 具 有显著的生理及药理活性 [12, 13] 芹菜素 (apigenin), 又名芹黄素, 化学结构为 5, 7, 4 - 三羟基黄酮 ( 图 1), 其 5, 7, 4 位的 3 个羟基和 C 2 C 3 间双键决定了其独

2 李丽丽等 : 芹菜素分子印迹聚合物的合成及谱学研究 869 特的药理学效应和生物学特性, 具体表现在抗肿瘤 抗炎症 抗菌抗病毒以及抗氧化作用等方面 [14 16] 因此, 有效地从中草药复杂成分中提取有效成分, 具有重要意义 本文以芹菜素为模板分子, 采用分子印迹技术合成了对芹菜素有特效选择性吸附的分子印迹聚合物 (molecularly imprinted polymer, MIP) 同时利用紫外光谱及红外光谱对其进行表征和测定, 利用平衡结合实验对其吸附性能进行研究, 为进一步利用该聚合物作为色谱介质有效 快速的分离和纯化芹菜素提供了有参考价值的理论依据 bandⅡ: benzoyl bandⅠ: cinnamyl Figure 1 Structure of apigenin 实验部分试剂和仪器芹菜素对照品 (apigenin, API, 西安沃森生物有限公司 ); 丙烯酰胺 (acrylamide, AA, 天津医药公司, 分析纯 ), 使用前用氯仿重结晶 ; 乙二酸二甲基丙烯酸酯 (ethylene glycol dimethacrylate, EDMA, 天津阿法埃莎公司, 分析纯 ), 使用前减压蒸馏除去阻聚剂 ; 偶氮二乙丁腈 (2, 2 -azodiisobutyronitrile, AIBN, 上海试剂四厂, 化学纯 ), 使用前用甲醇重结晶 ; N, N- 二甲基甲酰胺 (N, N-dimethylformamide, DMF, 上海试剂四厂, 化学纯 ); 乙腈为色谱纯 ; 其余试剂均为分析纯 ; 水为二次蒸馏水 Perkin Elmer LS55 型紫外 - 可见分光光度计 ; Perkin Elmer 型红外光谱仪 (KBr 压片 ) 紫外光谱实验反应溶剂的选择用紫外可见分光光度计分别扫描 0.02 mmol L 1 API 0.10 mmol L 1 AA 及 0.02 mmol L 1 API 与 0.10 mmol L 1 AA 的混合 DMF 或乙腈 -DMF 溶液的紫外吸收谱图 ( 以相应溶剂作为参比 ) 模板分子 API 与功能单体 AA 结合作用的确定为了研究模板分子与功能单体之间的作用方式, 将模板分子芹菜素的浓度固定为 0.10 mmol L 1, 分别加入 mmol L 1 的功能单体 AA, 在恒温振荡器中振荡 12 h 后, 用相应浓度的丙烯酰胺溶液作为参比, 检测紫外吸收光谱的变化 聚合物的制备称取 g (0.80 mmol) API, 溶于 15 ml 乙腈和 DMF 混合溶剂中, 加入 g (4.0 mmol) 功能单体 AA, 室温下振荡 2 h, 使 AA 与 API 充分作用, 然后依次加入 g (40.0 mmol) 交联剂 EDMA 和 22 mg 引发剂 AIBN, 转入 18 mm 200 mm 硬质玻璃管中, 超声混匀, 通氮气 2 min, 抽真空 2 min, 重复操作 3 次, 在真空下封管, 置于 60 恒温水浴中聚合 24 h, 得到浅黄色疏松块状聚合物 将聚合物研磨, 粉碎, 过 400 目筛, 取粒径小于 38 µm 颗粒, 用丙酮返程沉降, 以除去表层细末, 真空干燥 将所得聚合物置于索氏提取器中, 先用甲醇抽提, 再用 9 1 甲醇 - 冰醋酸溶液抽提, 然后用甲醇抽提, 最后用 8 2 甲醇 mmol L 1 NaOH 溶液抽提, 直至紫外可见分光光度计检测不到抽提液中的芹菜素模板分子, 再用甲醇洗至中性, 放入真空干燥器于 40 干燥至恒重 空白聚合物 (blank polymer, BP) 的合成除不加 API 外, 其余步骤同上 聚合物结构特征研究采用傅立叶红外光谱仪测定模板分子 功能单体 印迹聚合物和非印迹聚合物的结构 结合实验精密称取 10 份相同的芹菜素印迹或空白聚合物 20.0 mg, 放入 25 ml 磨口锥形瓶中, 加入 10.0 ml 不同浓度芹菜素的乙腈 /DMF 混合溶液, 放入恒温水浴振荡器中室温下振荡 24 h 后, 将混合液转入离心机离心 5 min, 取适量离心液, 紫外分光光度计 335 nm 处测定平衡浓度 根据结合前后溶液中浓度的变化, 计算 MIP 和 BP 对芹菜素的结合量 Q, 平行 3 次取平均值 结果与讨论 1 模板分子 API 与功能单体 AA 在不同溶剂中的紫外吸收光谱分析由单一溶液 DMF 及混合溶液乙腈 -DMF 为溶剂的紫外光谱图 ( 图 2) 结合芹菜素的结构式 ( 图 1) 可以看出, 在 260~400 nm 有两个主要的吸收谱带 : 1 位于 336 nm 左右的吸收带 I 对应于芹菜素 4 位羰基与 B 环形成共轭体系的吸收 ( 桂皮酰基, cinnamyl); 2 位于 270 nm 左右的吸收带 Ⅱ 对应于芹菜素 4 位羰基与 A 环形成共轭体系的紫外吸收 ( 苯甲酰基, benzoyl) 从图 2 可以看出, 曲线 4 为 API 和 AA 两种组分实际反应的吸光度值, 曲线 3 为 API 和 AA 两种组分

3 870 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): 叠加的理论吸光度之和 曲线 3 和 4 两条谱线的最大吸收峰值相差越大, 说明在此溶剂中功能单体与模板分子的相互作用越强, 即模板分子与功能单体之间的预组织性也就越强, 则预示合成出的分子印迹聚合物对模板分子的特异识别选择性就越好 比较图 2a 和 2b 可以看出, 图 2b 中 3 和 4 曲线相差较大并表现出较强的吸收强度, 即在乙腈 -DMF 混合溶剂中 API 与 AA 的作用比在 DMF 中强, 预示 API 与 AA 形成的配合物相对稳定, 故应选择溶解度较大 极性较低且介电常数较大的乙腈 -DMF 混合溶剂作为合成分子印迹聚合物的溶剂 2 模板分子 API 与功能单体 AA 之间的配合作用及印迹机制分析图 3 为模板分子与功能单体相互作用的紫外吸收谱图, 随着单体浓度的增加, 芹菜素的紫外最大吸收波长由 265 nm 移至 270 nm, 这一红移现象表明模板分子和功能单体之间存在某种作用并形成复合物 根据模板分子和功能单体的结构, 两者之间的作用力应为氢键作用, 故推测印迹聚合物的合成机制如图 4 所示 3 红外光谱分析 API AA MIP BP 的红外谱图分别如图 5 所示 Figure 3 Influence of AA on apigenin Figure 2 UV absorption spectra of API and AA in DMF (a) and MeCN / DMF (b) solution. 1: AA in DMF or MeCN / DMF solution (0.02 mmol L 1 ); 2: API in MeCN / DMF or DMF solution (0.1 mmol L 1 ); 3: Theoretical sum of curve 1 and curve 2; 4: The mixture of API with functional monomer AA in DMF or MeCN / DMF solution Figure 4 The synthesizing process of MIP

4 李丽丽等 : 芹菜素分子印迹聚合物的合成及谱学研究 871 从图中可以看出, 模板分子 API 在 cm 1 处是酚 类基团 O H 键的伸缩振动吸收峰, cm 1 处是酮 类基团 C O 键的伸缩振动吸收峰, 1 500~1 600 cm 1 附近出现多重峰, 是苯环的骨架振动吸收峰 ( 图 5a) 功能单体 AA 在 cm 1, cm 1 处是酰胺基团 中 N H 键的伸缩振动吸收峰, cm 1 对应于羰基 基团 C=O 键的吸收峰, cm 1 对应于双键 C=C 基 团的吸收峰, cm 1 为对应于酰胺基团中的 C N 键伸缩振动吸收峰 ( 图 5b) 印迹聚合物 MIP 中羰基 基团 C=O 键的吸收峰从 cm 1 转移至 cm 1 处, 同时双键吸收峰消失 (1 607 cm 1 ), cm 1 对 应于酰胺基团 C N 键伸缩振动的吸收峰, cm 1 对应于交联剂中酯键 C O 基团的吸收峰, 这些波数 说明功能单体 AA 通过交联剂已稳固地键合起来 ; 而 在 1 500~l 600 cm 1 之间并没有出现苯环的多重特 征吸收峰, 则表明该印迹聚合物没有模板分子存在, 说明通过充分清洗, 已经将模板分子 API 清洗干净 ( 图 5c) 而空白聚合物的谱图与清洗后的印迹聚合物 的谱图非常相似, 说明这两种物质为同一合成路线 所得, 只是聚合物的内部结构有所不同, 导致吸收峰 位置和吸收强度有所区别 ( 图 5d) 上的酰胺键形成氢键, 但由于位置关系, 不具有作用 位点的匹配性 这种空间空穴的选择性吸附使得两种 聚合物的吸附量存在差值 Figure 6 The adsorption of apigenin on MIP and BP. Q: amount of API bound to 20.0 mg MIP or BP; adsorption time: 24 h; ambient. Temperature: T = 25 ; V = ml Figure 7 MIP Scatchard plot analysis of the binding of apigenin on Figure 5 FI-IR spectra of API (a), AA (b), MIP (c) and BP (d) 4 印迹聚合物和空白聚合物对芹菜素的吸附行为及 Scatchard 分析测定了芹菜素聚合物对不同浓度 (0.1 ~ 2.5 mmol L 1 ) API 的吸附量, 绘制成结合等温线 ( 图 6), 从图 6 可以看出, 在所研究的浓度范围内, MIP 的吸附量随着溶液浓度的增大而增加, 而 BP 的吸附量却趋于饱和, MIP 对模板分子的吸附量显著大于 BP 的吸附量, 具有较高的选择性 表明印迹聚合物对芹菜素确实具有印迹能力, 芹菜素可通过氢键和空间匹配达到吸附, 而对于 BP, 虽然芹菜素也能与聚合物 分子印迹研究中常用 Scatchard 模型来评价聚合 物的结合特性 [17], 通过 Scatchard 分析可获得吸附位 点的结合类型 结合平衡常数及最大结合量等重要信 息 Scatchard 方程为 : Q C e Q Q K max = (1) D 式中, Q 和 Q max 为平衡结合量和最大表观结合量, C e 为溶液中平衡浓度, K D 为结合位点的平衡离解常数 当以 Q/C e 对 Q 作图时, 根据线性关系的斜率和截距 可求得 K D 和 Q max 两个参数 芹菜素在 MIP 上的 Scatchard 分析见图 7 由图 7 可见, Scatchard 图呈非 线性相关性, 说明芹菜素在 MIP 上的结合位点的能 量不均一 将图中散点分成两部分, 分别进行线性回 归, 得两条直线, 表明在 MIP 中主要存在着两类不同 能量的结合位点 根据直线的斜率和截距, 分别计算 出两类结合位点的离解常数 K D 和最大表观结合量

5 872 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (8): Q max 对于高能结合位点, K D, 1 和 Q max, 1 分别为 mmol L 1 和 2.65 µmol g 1 ; 对于低能结合位点, K D, 2 和 Q max, 2 分别为 mmol L 1 和 µmol g 1 MIP 中之所以会产生两类不同结合能量的位点, 可能是由于模板分子芹菜素结构中存在着两类不同类型的功能基, 分别为酚羟基与羰基, 同时功能单体既有供氢基团也有受氢基团, 模板分子与功能单体在预组织过程中可能存在着两种组织方式, 因而在 MIP 中留下两类结合位点 结论本文利用分子印迹技术合成了芹菜素分子印迹聚合物, 同时应用光谱分析法理论上探讨合成芹菜素印迹聚合物所需的溶剂及结构性能, 并利用吸附实验对印迹聚合物及空白聚合物的吸附能力进行了比较分析 研究结果表明合成的芹菜素印迹聚合物对模板分子芹菜素有一定的印迹能力, 表现出较高的吸附特性, 而且与天然分离配基相比, 制备简单, 模板分子可回收重复使用等特点, 可望将其应用于天然产物中黄酮类化合物的分离研究 References [1] Fairhurst RE, Chassaing C, Venn RF, et al. A direct comparison of the performance of ground, beaded and silica-grafted MIPs in HPLC and turbulent flow chromatography applications [J]. Biosens Bioelectron, 2004, 20: [2] Kandimalla VB, Ju HX. Molecular imprinting: a dynamic technique for diverse applications in analytical chemistry [J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 380: [3] Andersson LI. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field [J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2000, 745: [4] Wulff G. Enzyme-like catalysis by molecularly imprinted polymers [J]. Chem Rev, 2002, 102: [5] Cui AH, Singh A, Kaplan DL. Enzyme-based molecular imprinting with metals [J]. Biomacromolecules, 2002, 3: [6] Alvarez-Lorenzo C, Concheiro A. Molecularly imprinted polymers for drug delivery [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2004, 804: [7] Weiss R, Molinelli A, Jakusch M, et a1. Molecular imprinting and solid phase extraction of flavonoid compounds [J]. Bioseparation, 2001, 10: [8] Ferrer II, Lanza F, Tolokan A, et al. Selective trace enrichment of chlorotriazine pesticides from natural waters and sediment samples using terbuthylazine molecularly imprinted polymers [J]. Anal Chem, 2000, 72: [9] Tan Y, Yin J, Liang C, et al. A study of a new Tsm biomimetic sensor using a molecularly imprinted polymer coating and its application for the determination of nicotine in human serum and urine [J]. Bioelectrochem, 2001, 53: [10] Parmpi P, Kofinas P. Biomimetic glucose recognition using molecularly imprinted polymer hydrogels [J]. Biomaterals, 2004, 25: l969 l973. [11] Ye L, Haupt K. Molecularly imprinted polymers as antibody and receptor mimics for assays, sensors and drug discovery [J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 378: [12] Crescenzi C, Bayoudh S, Cormack PA, et al. Determination of clenbuterol in bovine liver by colnfining matrix solid-phase dispersion and molecularly imprinted solid-phase extraction followed by liquid chromatography / electrospray ion trap multiple-stage mass spectrometry [J]. Anal Chem, 2001, 73: [13] Liu CX. Difficulty and hot-points on pharmacokinetics studies of traditional Chinese medicine [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学 报 ), 2005, 40: [14] Harborne JB, Williams CA. Advances in flavonoid research since 1992 [J]. Phytochemistry, 2000, 55: [15] Berashvili DT, Alaniya MD, Bakuridze AD, et a1. Apigenin glucuronide from Perilla nankinensis leaves [J]. Chem Nat Compd, 2005, 41: [16] Qu LB, Wang L, Yang R, et al. Interaction of bovine serum albumin with luteolin and apigenin [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学学报 ), 2006, 41: [17] Matsui J, Miyoshi Y, Doblhof-Dier O, et al. A molecularly imprinted synthetic polymer receptor selective for atrazine [J]. Ana1 Chem, 1995, 67:

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