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1 中 国 农 业 科 技 导 报, 2013, 15(4): Journal of Agricultural Science and Technology 纳 豆 激 酶 研 究 进 展 李 淑 英 1, 赵 仲 麟 2, 聂 莹 1, 马 鑫 3, 李 燕 4, 袁 超 2 1, 唐 选 明 (1. 中 国 农 业 科 学 院 农 产 品 加 工 研 究 所, 北 京 ; 2. 河 南 农 业 大 学 理 学 院, 郑 州 ; 3. 中 国 农 业 科 学 院 农 业 信 息 研 究 所, 北 京 ; 4. 郑 州 轻 工 业 学 院 食 品 与 生 物 工 程 学 院, 郑 州 ) 摘 要 : 纳 豆 激 酶 是 由 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 分 泌 表 达 的 碱 性 丝 氨 酸 蛋 白 酶, 具 有 极 强 的 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 研 究 表 明, 纳 豆 激 酶 纤 溶 活 性 强 副 作 用 小, 可 用 于 开 发 溶 栓 药 物 介 绍 了 纳 豆 激 酶 的 溶 栓 机 理, 就 纳 豆 激 酶 的 功 效 生 产 菌 种 选 育 发 酵 条 件 的 优 化 酶 活 性 位 点 及 定 向 进 化 等 方 面 进 行 综 述 关 键 词 : 纳 豆 激 酶 ; 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 ; 功 效 ; 抗 血 栓 doi: / j. issn 中 图 分 类 号 :TS 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2013) Research Progress on Nattokinase LI Shu-ying 1, ZHAO Zhong-lin 2, NIE Ying 1, MA Xin 3, LI Yan 4, YUAN Chao 2, TANG Xuan-ming 1 (1. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing ; 2. College of Sciences, He nan Agricultural University, Zhengzhou ; 3. Agricultural Information Institute, CAAS, Beijing ; 4. School of Food and Biological Engineering, Zhengzhou College of Light Industry, Zhengzhou , China) Abstract:Nattokinase is a serine proteinase and fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis. Research indicated that nattokinase has strong fibrinolytic activity and few side effects, which could be developed as a promising agent for thrombosis therapy. This paper introduced nattokinase mechanism of action, its kinas efficacy, strain selection and breeding, optimisation of fermentation condition, enzyme activity sites and directed evolution, etc. Key words:nattokinase; fibrinolytic activity; efficacy; anti-thrombosis 纳 豆 作 为 一 种 传 统 食 物 已 有 上 千 年 的 历 史, 是 经 大 豆 经 草 枯 芽 孢 杆 菌 发 酵 而 来 纳 豆 激 酶 是 从 纳 豆 中 发 现 的, 具 有 强 力 的 纤 维 蛋 白 溶 解 特 性 [1] 纳 豆 激 酶 是 一 种 碱 性 蛋 白 酶, 由 275 个 氨 基 酸 组 成, 分 子 量 约 为 28 kda, 其 序 列 与 枯 草 牙 胞 杆 菌 蛋 白 酶 相 似 [2,3] 纳 豆 激 酶 较 稳 定,50 处 理 或 经 5 次 反 复 冻 融 仍 能 保 持 活 性 在 ph 6 ~ 12 稳 定 存 在, 其 最 优 ph 为 ~ 10. 8, 在 酸 性 条 件 下 无 活 性 [4,5] 纳 豆 激 酶 可 以 被 大 鼠 肠 道 吸 收, 而 到 目 前 为 止, 目 前 的 研 究 多 集 中 在 纳 豆 激 酶 纤 维 蛋 白 溶 解 特 性 方 面, 利 用 其 特 性 可 以 开 发 相 关 的 抗 血 栓 症 药 物, 有 关 纳 豆 激 酶 对 人 体 和 动 物 的 作 用 研 究 比 较 有 限 本 文 对 纳 豆 激 酶 的 作 用 机 理 功 效 及 纳 豆 激 酶 蛋 白 质 工 程 方 面 的 研 究 进 展 进 行 了 阐 述 1 纳 豆 激 酶 作 用 机 理 血 栓 是 由 血 小 板 和 纤 维 蛋 白 聚 集 形 成 的 [6] 有 效 的 血 栓 溶 解 剂 能 切 开 血 栓 上 纤 维 蛋 白 凝 块, 如 纤 溶 酶 纳 豆 激 酶 属 于 枯 草 牙 胞 杆 菌 丝 氨 酸 蛋 [7 ~ 白 酶, 其 溶 血 栓 活 性 是 纤 溶 酶 的 4 倍 10], 但 其 加 速 纤 维 蛋 白 溶 解 的 机 制 还 不 十 分 明 确 研 究 显 示 纳 豆 激 酶 可 在 体 外 将 血 栓 水 解, 间 接 的 将 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 转 化 为 血 纤 维 蛋 白 溶 酶, 使 纤 维 蛋 白 凝 块 水 解 [2] 与 阿 替 普 酶 尿 激 酶 链 激 酶 不 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 中 国 农 业 科 学 院 科 技 经 费 项 目 ( ) 资 助 作 者 简 介 : 李 淑 英, 助 理 研 究 员, 博 士, 研 究 方 向 为 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 Lishuying@ caas. cn 通 讯 作 者 : 唐 选 明, 副 研 究 员, 硕 士 生 导 师, 研 究 方 向 为 食 品 科 学 tangxuanming@ caas. cn

2 140 中 国 农 业 科 技 导 报 15 卷 同 的 是, 纳 豆 激 酶 并 没 有 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 激 活 剂 的 功 能, 不 能 直 接 将 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 转 化 为 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 [11] 纳 豆 激 酶 通 过 剪 切 使 纤 溶 酶 原 激 活 物 抑 制 剂 (plasminogen adivator inhibitor, PAI) 失 活, 而 PAI 的 作 用 主 要 是 抑 制 组 织 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 激 活 剂 ( tissue plasminogen activator, tpa) 一 般 认 为 纳 豆 激 酶 是 通 过 蛋 白 水 解 作 用 直 接 溶 解 纤 维 蛋 白 凝 块 的 2 纳 豆 激 酶 的 功 效 2. 1 动 物 学 实 验 目 前 纳 豆 激 酶 溶 解 血 栓 效 果 的 评 估 多 是 通 过 [10] 动 物 研 究 Fujita 等 以 化 学 诱 导 血 栓 的 大 鼠 作 为 实 验 样 本, 利 用 乙 酸 诱 导 颈 动 脉 堵 塞 形 成 血 栓 当 血 栓 稳 定 后, 分 别 注 射 阿 替 普 酶 尿 激 酶 弹 性 蛋 白 酶 血 浆 酶 和 纳 豆 激 酶 结 果 显 示, 血 流 量 恢 复 情 况 与 纳 豆 激 酶 的 使 用 量 成 比 例, 使 用 μmol / kg 可 恢 复 17. 7%,0. 12 μmol / kg 可 恢 复 到 62% 按 μmol / kg 的 剂 量, 纳 豆 激 酶 溶 解 血 栓 的 效 果 是 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 的 4 倍, 二 者 分 别 达 到 62% 和 15. 8% μmol / kg 尿 激 酶 和 μmol / kg 阿 替 普 酶 可 恢 复 45% 的 血 流, 而 纳 豆 激 酶 则 只 需 μmol / kg, 弹 性 蛋 白 酶 则 无 [12] 效 果 Kamiya 等 对 雌 性 Wistar 大 鼠 的 尾 部 进 行 纳 豆 激 酶 皮 下 注 射,12 h 后 向 其 尾 部 静 脉 注 射 卡 拉 胶, 发 现 与 对 照 组 相 比 注 射 纳 豆 激 酶 组 的 鼠 尾 部 阻 塞 长 度 明 显 缩 短, 显 示 出 了 良 好 的 预 防 性 抗 血 栓 活 性 [3] Suzuki 等 在 股 动 脉 大 鼠 饲 料 中 添 加 纳 豆 来 研 究 内 膜 增 厚 和 血 栓 溶 解 情 况 他 们 将 正 常 喂 食 的 大 鼠 作 为 对 照 组, 同 时 将 正 常 喂 食 中 加 入 纳 豆 粗 提 物 为 实 验 组 3 周 后 利 用 辐 射 和 注 射 孟 加 拉 玫 瑰 红 染 料 的 光 化 学 血 栓 模 型, 使 内 膜 增 厚 继 续 注 射 3 周 之 后, 使 用 优 球 蛋 白 凝 块 溶 解 时 间 (euglobulin clot lysis time,eclt) 来 评 估 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 喂 食 了 纳 豆 激 酶 的 大 鼠 与 对 照 组 相 比,ECLT 显 著 缩 短, 损 伤 的 股 动 内 膜 代 表 性 区 域 明 显 减 少, 而 纳 豆 的 添 加 并 没 有 增 加 出 血 或 是 影 响 血 小 板 凝 聚 [8] 通 过 相 似 的 动 物 模 型 研 究,Suzuki 等 研 究 了 纳 豆 提 取 物 对 内 膜 增 厚 和 纳 豆 激 酶 调 解 血 栓 凝 块 溶 解 是 否 会 造 成 血 管 壁 损 伤 结 果 发 现, 与 对 照 组 相 比, 经 纳 豆 激 酶 处 理 的 鼠 内 膜 增 厚 受 到 抑 制 对 照 和 处 理 组 的 管 壁 形 成 的 血 栓 形 态 学 上 差 异 明 显 对 照 组 的 血 栓 附 着 在 血 管 壁 上, 而 实 验 组 的 血 栓 则 从 血 管 壁 上 脱 离 纳 豆 激 酶 的 血 栓 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 也 在 狗 身 上 进 行 了 测 试 [13], 血 管 摄 片 显 示, 口 服 纳 豆 激 酶 5 h 后, 血 栓 溶 解, 而 对 照 组 血 栓 无 溶 解 2. 2 人 体 实 验 日 本 科 学 家 对 成 人 进 行 了 纳 豆 激 酶 血 浆 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 的 实 验 [13] 最 初, 所 有 的 被 测 试 者 都 摄 入 了 12 g 纳 豆 2 周 后, 所 有 人 再 摄 入 等 量 的 纳 豆 结 果 食 用 纳 豆 后, 血 栓 溶 解 时 间 变 短, 溶 纤 蛋 白 活 性 增 强 达 12 h 在 进 一 步 的 实 验 中, 实 验 对 象 都 服 用 含 mg 纳 豆 激 酶 的 胶 囊, 每 日 三 次 最 后, 利 用 优 球 蛋 白 溶 纤 活 性 纤 维 蛋 白 和 纤 维 蛋 白 原 降 解 产 物 和 tpa 来 评 估 血 浆 溶 纤 蛋 白 活 性 结 果 显 示, 纳 豆 激 酶 逐 渐 增 强 了 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性, 血 纤 维 蛋 白 降 解 产 物 显 著 增 多 因 此 认 为 纳 豆 激 酶 是 一 种 有 效 的 天 然 血 栓 溶 解 剂 皮 诺 激 酶 (pinokinase) 是 一 种 纳 豆 激 酶 和 碧 萝 芷 的 混 合 物, 有 高 风 险 深 部 静 脉 血 栓 形 成 的 测 试 人 群, 食 用 了 150 mg 皮 诺 激 酶, 静 脉 超 声 扫 描 结 果 表 明, 血 栓 发 生 情 况 减 少 [14] 这 些 研 究 结 果 表 明 纳 豆 激 酶 具 有 较 强 的 溶 纤 维 蛋 白 活 性, 对 内 膜 增 厚 也 有 较 好 的 效 果 可 以 改 善 血 液 循 环 和 心 血 管 健 康, 减 少 血 栓 发 病 的 风 险 [15] Hisa 等 对 纳 豆 激 酶 降 低 心 血 管 疾 病 的 效 果 进 行 了 临 床 实 验 连 续 2 个 月 分 别 对 健 康 人 心 血 管 病 人 透 析 病 人 进 行 纳 豆 激 酶 胶 囊 口 服 给 药 结 果 发 现 血 浆 中 3 种 凝 结 因 素 纤 维 蛋 白 原 与 心 血 管 病 相 关 的 因 子 Ⅷ 和 Ⅶ 的 水 平 持 续 下 降, 下 降 程 度 在 3 个 实 验 组 中 均 相 似, 且 未 发 现 明 显 [16] 的 副 作 用 Yatagai 等 使 用 高 温 处 理 纳 豆 激 酶 使 其 失 活, 结 果 发 现 含 纳 豆 激 酶 的 培 养 液 仍 可 以 使 血 管 内 皮 细 胞 和 海 拉 细 胞 产 生 组 织 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 激 活 子, 说 明 失 活 的 纳 豆 激 酶 仍 具 有 很 强 的 活 性 使 活 细 胞 释 放 tpa 3 纳 豆 激 酶 的 选 育 及 酶 学 研 究 纳 豆 激 酶 不 仅 可 以 直 接 溶 解 交 联 状 的 血 栓, 还 可 以 催 化 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 转 化 为 血 纤 维 蛋 白 溶 酶, 增 加 体 内 血 栓 溶 解 因 子 ( 如 tpa) 的 合 成, 失

3 4 期 李 淑 英 等 : 纳 豆 激 酶 研 究 进 展 141 活 纤 维 蛋 白 溶 解 抑 制 剂 ( PAI-1) 等, 在 体 内 具 有 增 强 血 栓 溶 解 活 性 [11] 纳 豆 激 酶 具 有 ph 和 温 度 稳 定 性, 在 胃 肠 道 中 可 稳 定 存 在, 在 血 中 可 存 活 长 达 3 h [1] 与 常 规 的 溶 栓 药 物 相 比, 纳 豆 激 酶 具 有 很 多 优 点 : 如 活 性 高 无 毒 副 作 用 半 衰 期 长 [18] 可 以 口 服 价 格 低 廉 且 具 有 预 防 作 用 等 表 明 纳 豆 激 酶 在 未 来 血 栓 治 疗 方 面 具 有 极 大 的 应 用 潜 力 也 有 研 究 表 明 纳 豆 激 酶 及 其 降 解 片 段 还 可 以 抑 制 血 管 紧 张 素 转 化 酶 活 性, 从 而 抑 制 血 压 [7] 而 事 实 上 纳 豆 激 酶 是 否 可 以 成 为 一 种 广 泛 地 血 栓 治 疗 药 物 主 要 依 赖 于 该 酶 的 特 性, 例 如 延 长 口 服 半 衰 期, 改 进 稳 定 性 提 高 温 度 耐 受 性 和 催 化 效 率 等, 这 些 直 接 影 响 该 酶 在 医 药 和 商 业 领 域 的 应 用 3. 1 纳 豆 激 酶 菌 种 选 育 目 前 关 于 纳 豆 激 酶 的 研 究 主 要 集 中 于 菌 种 选 育 和 表 达 条 件 优 化 溶 栓 机 理 研 究 异 源 表 达 和 纯 [4,17 ~ 化 等 方 面 21] [18] Wei 等 利 用 PCR 结 合 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 筛 选 法 从 中 国 的 豆 酱 中 筛 选 到 一 株 [19] 纳 豆 激 酶 高 产 菌 株 李 淑 英 等 以 日 本 纳 豆 菌 为 对 照, 从 我 国 黑 豆 豆 豉 中 筛 选 到 一 株 纳 豆 激 酶 高 产 菌 株 BSNK-5, 具 有 较 高 的 酶 活 和 较 好 的 热 稳 定 性, 并 对 该 菌 株 发 酵 条 件 进 行 了 优 化 Kwon [21] 等 通 过 条 件 优 化, 利 用 高 密 度 分 批 补 料 培 养 法 生 产 纳 豆 激 酶, 活 性 可 达 unit / ml Unrean [22] 等 构 建 了 反 应 网 络 模 型, 利 用 该 模 型 对 枯 草 芽 孢 杆 菌 中 纳 豆 激 酶 的 代 谢 途 径 和 动 力 学 进 行 研 究, 从 而 对 发 酵 条 件 进 行 优 化 3. 2 纳 豆 激 酶 的 空 间 结 构 及 酶 活 性 位 点 研 究 纳 豆 激 酶 活 性 中 心 包 括 催 化 三 联 体 ( Asp32 His64 和 Ser221) 氧 离 子 洞 (Asn155) 和 底 物 结 合 位 点 (Ser125 Leu126 和 Gly127) [23] 通 过 酶 修 饰 提 高 纳 豆 激 酶 活 性 和 稳 定 性 方 面 [24] 的 研 究 很 少 2006 年,Zheng 等 通 过 空 间 结 构 分 析 推 测 纳 豆 激 酶 活 性 中 心 附 近 的 四 个 亚 基 (Ser33 Asp60 Ser62 和 Thr220) 形 成 的 氢 键 对 于 稳 定 水 解 反 应 的 转 移 状 态 十 分 重 要 ; 通 过 定 点 突 变 将 四 个 亚 基 换 成 Ala, 酶 动 力 学 分 析 证 实 这 些 氢 键 的 缺 失 对 于 催 化 反 应 影 响 很 大, 对 底 物 结 合 的 影 响 较 小 为 了 研 究 纳 豆 激 酶 的 活 性 和 底 物 特 [25] 性,Wu 等 定 点 突 变 分 析 了 该 酶 的 底 物 结 合 袋 的 S3 亚 区 的 三 个 亚 基 Gly100 Ser101 和 Leu126 点 突 变 分 析 表 明 Gly100 和 Ser101 具 有 反 向 空 间 结 构 和 电 子 移 位 作 用 ; 用 具 有 大 的 侧 链 基 团 和 阳 性 电 荷 的 氨 基 酸 替 换 第 100 位 亚 基, 将 大 幅 度 降 低 纳 豆 激 酶 的 底 物 结 合 和 催 化 活 性, 然 而 当 第 101 位 亚 基 用 相 同 特 性 的 氨 基 酸 替 换 时 可 以 明 显 增 加 该 酶 的 纤 维 蛋 白 溶 解 活 性 ;Leu126 突 变 可 能 损 坏 活 性 结 构 域 的 结 构, 大 幅 度 的 降 低 纳 豆 激 酶 活 性 动 力 学 分 析 表 明 S3 亚 区 的 亚 基 对 于 保 持 酶 的 活 性 很 关 键, 这 些 位 点 的 突 变 对 底 物 特 异 性 影 响 不 大 纳 豆 激 酶 极 易 受 化 学 氧 化 影 响, 导 致 失 活 和 变 性 通 过 定 点 突 变 将 两 个 非 氧 化 氨 基 酸 Ala 引 入 该 酶 催 化 亚 基 Ser221 临 位 的 Met222 亚 基, 增 加 了 该 酶 的 氧 化 稳 定 性 与 野 生 型 酶 相 比 M222A 突 变 酶 氧 化 稳 定 性 明 显 增 加,1 mol / L 的 双 氧 水 才 能 使 该 突 变 酶 失 活, 而 0. 1 mol / L 的 双 氧 水 就 可 使 野 生 型 酶 失 活 [26] 3. 3 纳 豆 激 酶 的 定 向 进 化 与 诱 变 定 点 突 变 是 改 善 酶 活 性 或 稳 定 性 的 常 用 方 法 [27], 但 利 用 纳 豆 激 酶 已 有 的 结 构 信 息, 只 能 对 活 性 中 心 和 底 物 结 合 部 位 附 近 的 氨 基 酸 进 行 突 变, 对 于 研 究 酶 的 活 性 和 稳 定 性 是 远 远 不 够 的, 且 已 有 的 研 究 没 有 发 现 与 热 稳 定 性 有 关 的 位 点 [28] Cai 等 利 用 DNA shuffling 对 纳 豆 激 酶 进 行 改 造 他 们 使 用 来 自 纳 豆 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 胞 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 的 3 种 同 源 基 因 作 为 模 板 建 立 突 变 库 经 3 轮 DNA shuffling 后, 筛 选 到 1 株 含 16 个 氨 基 酸 突 变 的 基 因, 其 酶 活 性 比 野 生 型 提 高 了 2. 3 倍 分 子 模 型 分 析 表 明, 突 变 酶 改 变 了 底 物 结 合 袋 的 表 面 构 型, 从 而 改 变 了 酶 的 功 能 然 而, DNA shuffling 也 只 是 基 于 同 源 序 列 进 行 保 守 结 构 域 互 换, 枯 草 牙 胞 杆 菌 蛋 白 酶 高 度 的 序 列 同 源 性, 限 制 了 更 多 新 的 变 异 位 点 的 发 现 目 前 通 过 诱 变 改 变 纳 豆 激 酶 的 特 性 的 研 究 报 道 也 很 多, 包 括 紫 外 辐 射 诱 变 化 学 复 合 诱 变 提 高 [29] 菌 株 的 产 酶 量 活 力 和 稳 定 性 等 刘 朔 等 通 过 紫 外 诱 变 纳 豆 菌 原 生 质 体, 使 菌 株 纳 豆 激 酶 比 活 力 提 高 16. 6%,65 处 理 15 min 后 热 稳 定 性 提 高 [30] 20% 关 志 炜 等 通 过 盐 酸 羟 胺 和 紫 外 线 复 合 诱 变 NK 菌 株, 获 得 了 1 株 产 酶 能 力 比 诱 变 前 提 [31] 高 了 68% 的 突 变 株 夏 丽 等 通 过 紫 外 诱 变 纳 豆 激 酶 菌 株, 诱 变 筛 选 所 得 高 产 菌 株 发 酵 生 产 的 纳 豆 激 酶 活 力 比 原 始 菌 株 提 高 了 8. 81% 但 是 这 些 研 究 只 是 在 通 过 突 变 获 得 高 产 菌 株 的 基 础 上, 简 单 的 对 酶 活 和 稳 定 性 进 行 检 测, 没 有 对 具 体

4 142 中 国 农 业 科 技 导 报 15 卷 的 突 变 位 点 进 行 深 入 探 究, 特 别 是 催 化 机 理 的 研 究 不 够 深 入, 缺 乏 充 分 认 识 4 结 语 目 前, 如 何 提 高 纳 豆 激 酶 活 性 和 热 定 性 是 研 究 的 热 定, 但 关 于 纳 豆 激 酶 与 活 性 和 热 稳 定 性 有 关 的 催 化 机 制 尚 不 清 楚, 基 于 定 向 进 化 通 过 定 点 突 变 或 随 机 突 变, 特 别 是 活 性 中 心 远 处 的 氨 基 酸, 有 可 能 改 变 酶 的 活 性 和 热 稳 定 性 如 能 建 立 高 通 量 的 酪 蛋 白 平 板 筛 选 方 法 对 纳 豆 激 酶 进 行 定 向 进 化, 通 过 随 机 突 变 或 空 间 结 构 模 拟 分 析 进 行 定 点 突 变, 通 过 酶 活 动 力 学 分 析 研 究 突 变 位 点 的 催 化 机 理, 就 能 够 发 现 与 活 性 和 热 稳 定 性 有 关 的 位 点 同 时 对 其 催 化 机 理 进 行 研 究, 将 有 助 于 加 快 纳 豆 激 酶 作 为 溶 栓 剂 的 开 发 应 用 前 景, 对 预 防 和 治 疗 血 管 栓 塞 性 疾 病 具 有 重 大 意 义 参 考 文 献 [1] Tai M W, Sweet B V. Nattokinase for prevention of thrombosis [ J]. Am. J. Health. Syst. Pharm., 2006, 63 ( 12): [2] Fujita M, Nomura K, Hong K, et al.. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme ( nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan[ J]. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 197: [3] Suzuki Y, Kondo K, Ichise J, et al.. Dietary supplementation with fermented soybeans suppresses intimal thickening [ J]. Nutrition, 2003, 19: [4] Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al.. A novel fibrinolytic enzyme ( nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet [ J ]. Experientia, 1987, 43: [5] Yoshimoto T, Fukumoto J, Tsuru D. Studies on bacterial proteases: some enzymatic and physicochemical properties of the alkaline protease from Bacillus natto[ J]. Int. J. Protein Res., 1971, 3: [6] Fujita M, Ito Y, Hong K, et al.. Characterization of nattokinase-degraded products from human fibrinogen or crosslinked fibrin [ J]. Fibrinolysis, 1995, 9: [7] Fujita M, Ohnishi K, Takaoka S. Antihypertensive effects of continuous oral administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats [ J]. Biol. Pharm. Bull., 2011, 34(11): [8] Suzuki Y, Kondo K, Matsumoto Y, et al.. Dietary supplementation of fermented soybean, natto, suppresses intimal thickening and modulates the lysis of mural thrombi after endothelial injury in rat femoral artery [ J]. Life Sci., 2003, 73: [9] Fujita M, Hong K, Ito Y, et al.. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract [ J]. Biol. Pharm. Bull., 1995, 18: [10] Fujita M, Hong K, Ito Y, et al.. Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat [ J]. Biol. Pharm. Bull.,1995; 18: [11] Urano T, Ihara H, Umemura K, et al.. The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT puri-fied from Bacillus subtilis cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1 [ J]. J. Biol. Chem., 2001, 276: [12] Kamiya S, Hagimori M, Ogasawara M, et al.. In vivo evaluation method of the effect of nattokinase on carrageenaninduced tail thrombosis in a rat model [ J]. Acta Haematol., 2010, 124: [13] Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, et al.. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase[ J]. Acta Haematol., 1990, 84: [14] Cesarone M R, Belcaro G, Nicolaides A, et al.. Prevention of venous thrombosis in long-haul flights with flite tabs: the LONFLIT-FLITE randomized, controlled trial [ J]. Angiology, 2003, 54: [15] Hsia C H, Shenb M C, Linc J S, et al.. Nattokinase decreases plasma levels of fibrinogen, factor VII, and factor VIII in human subjects [ J]. Nutr. Res., 2009, 29(3): [16] Yatagai CA, Maruyama M, Kawahara T, et al.. Nattokinasepromoted tissue plasminogen activator release from human cells [J]. Pathophysiol. Haemost. Thromb., 2008,36 ( 5 ): [17] Jovin I S, Muller B G. Inter-relationships between the fibrinolytic system and lipoproteins in the pathogenesis of coronary atherosclerosis[ J]. Atherosclerosis, 2004, 174: [18] Wei X T, Luo M F, Xie Y H. Strain screening, fermentation, separation, and encapsulation for production of nattokinase functional food[ J]. Appl. Biochem. Biotechnol., 2012, 168: [19] 李 淑 英, 聂 莹, 杜 欢, 等. 纳 豆 激 酶 生 产 菌 BSNK-5 鉴 定 及 发 酵 条 件 优 化 [J]. 生 物 技 术 通 报, 2013, 2: Li S Y, Nie Y, Du H, et al.. Identification of BSNK-5 and optimization of the fermentation conditions [ J]. Biotechnol. Bull., 2013, 2: [20] 方 祥, 周 换 彩, 王 忠 霞, 等. 纳 豆 菌 分 离 鉴 定 及 纳 豆 激 酶 高 产 菌 株 的 正 向 选 育 [J]. 食 品 与 发 酵 工 业,2005, 31(12): Fang X, Zhou H C, Wang Z X, et al.. Isolation and forward breeding of Bacillus subtilis natto with high fibrinolytic activity nattokinase [ J]. FoodFerment. Ind., 2005, 31 ( 12 ): [21] Kwon E Y, Kim K M, Kim M K. Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis [ J]. Bioprocess. Biosyst. Eng., 2011,34: [22] Unrean P, Nguyen N H. Metabolic pathway analysis and kinetic studies for production of nattokinase in Bacillus subtilis [ J]. Bioprocess. Biosyst. Eng., 2013, 36(1):

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