大同大學數位論文

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1 不 同 誘 導 劑 對 大 腸 桿 菌 異 源 表 現 納 豆 激 酶 之 影 響 EFFECT OF DIFFERENT INDUCERS ON THE HETEROLOGOUS EXPRESSION OF THE NATTOKINASE GENE IN ESCHERICHIA COLI 研 究 生 : 郭 莉 婷 (Li-Ting Kuo) 指 導 教 授 : 官 宜 靜 (Dr. I-Ching Kuan) 大 同 大 學 生 物 工 程 研 究 所 碩 士 論 文 Thesis for Master of Science Department of Bioengineering Tatung University 中 華 民 國 九 十 八 年 二 月 February 2009

2 EFFECT OF DIFFERENT INDUCERS ON THE HETEROLOGOUS EXPRESSION OF THE NATTOKINASE GENE IN ESCHERICHIA COLI THESIS Submitted to the graduate school Of Tatung University In Partial Fulfillment of the Requirement for The Degree of Master of Science Bioengineering by Li-Ting Kuo Taipei, Taiwan Republic of China 2009

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4 誌 謝 因 為 工 作 的 緣 故, 研 究 所 在 職 專 班 生 涯 相 較 其 他 研 究 生 漫 長 許 多 承 蒙 這 段 時 間 指 導 教 授 官 宜 靜 老 師 在 實 驗 與 課 業 上 的 教 導 論 文 撰 寫 的 指 導, 在 此 由 衷 感 謝 老 師 之 諄 諄 教 誨 同 時 也 感 謝 淡 江 大 學 生 命 科 學 研 究 所 陳 銘 凱 博 士 及 本 所 李 綉 鈴 教 授 給 予 本 論 文 的 建 議 與 指 正, 使 學 生 獲 益 良 多, 論 文 能 更 加 完 善 於 實 驗 室 研 究 期 間, 感 謝 施 淑 觀 學 妹 蔡 鎮 陽 學 弟 於 研 究 繁 忙 空 檔 給 予 實 驗 上 的 指 導 鈺 婷 昀 儒 克 綸 陽 森 等 學 弟 妹 們 於 課 業 上 的 協 助 ; 特 別 是 生 工 系 學 弟 妹 依 倫 欣 怡 茂 原 秉 宏 的 支 持 及 陪 伴, 因 為 你 們 讓 我 在 大 同 留 下 許 多 美 好 回 憶, 由 衷 感 謝 大 家 最 後 將 此 論 文 獻 給 我 的 父 母, 因 為 你 們 的 鼓 勵 及 支 持, 讓 我 得 以 離 開 繁 忙 的 工 作 崗 位, 使 我 完 成 學 業 I

5 中 文 摘 要 納 豆 激 酶 是 由 Bacillus subtilis natto 所 分 泌 之 胞 外 蛋 白 酶, 具 有 優 異 的 分 解 血 栓 能 力 目 前 已 知 在 腸 道 內 可 以 被 快 速 吸 收 且 作 用 時 間 長 達 8 小 時 以 上, 因 此 在 保 健 醫 藥 品 的 應 用 上 格 外 受 到 注 目 本 研 究 將 建 構 於 大 腸 桿 菌 質 體 pet26b(+) 的 納 豆 激 酶 基 因, 藉 由 於 TB 中 添 加 sorbitol 和 betaine, 成 功 表 現 產 生 具 有 溶 解 血 栓 能 力 的 重 組 納 豆 激 酶 單 獨 以 IPTG 誘 導 時 ( 最 佳 誘 導 濃 度 為 1 mm IPTG), 可 於 誘 導 後 24 小 時, 測 得 較 佳 胞 外 酵 素 活 性 約 2.71 U/ml; 誘 導 後 8 小 時, 測 得 較 佳 胞 內 酵 素 活 性 約 4.67 U/ml 以 lactose 誘 導 ( 最 佳 誘 導 濃 度 為 10 mm) 時, 可 於 誘 導 後 16 小 時, 測 得 較 佳 胞 外 酵 素 活 性 約 1.29 U/ml; 誘 導 後 8 小 時, 測 得 較 佳 胞 內 酵 素 活 性 約 1.75 U/ml IPTG 與 lactose 共 同 誘 導 時, 最 佳 誘 導 濃 度 為 10 mm lactose 和 mm IPTG, 可 於 誘 導 後 20 小 時, 測 得 較 佳 胞 外 酵 素 活 性 約 3.36 U/ml; 誘 導 後 4 小 時, 測 得 較 佳 胞 內 酵 素 活 性 約 3.5 U/ml II

6 Abstract Nattokinase, an extracellular protease produced by Bacillus subtilis natto exhibits excellent fibrinolytic activity. It can be absorbed quickly by intestine and has prolonged effect over eight hours. Thus, nattokinase has raised great attention for the potential applications in healthy protection and medicine. In this study, the nattokinase gene constructed on pet26b(+) was successfully expressed in TB containing betaine and sorbitol to produce nattokinase with fibrinolytic activity. Using IPTG as the inducer solely, the maximal intracellular nattokinase activity of 4.67 U/ml was obtained 8 hours after induction by 1 mm IPTG, while the maximal extracellular activity of 2.71 U/ml was obtained 24 hours after induction by the same condition. As lactose was used as inducer instead, the higher intracellular activity of 1.75 U/ml was obtained 8 hours after induction by 10 mm lactose. Meanwhile, the higher extracellular enzyme activity of 1.29 U/ml was obtained 16 hours after induction. With lactose and IPTG as inducers after induction, the maixmal intracellular activity of 3.50 U/ml was obtained 4 hours and the maximal extracellular activity of 3.36 U/ml was detected 20 hours after induction by 10 mm lactose and mm IPTG. III

7 目 錄 誌 謝 IV 中 文 摘 要 IV 英 文 摘 要 IV 目 錄 IV 圖 表 目 錄 IV 第 一 章 前 言 日 本 人 之 飲 食 習 慣 納 豆 的 起 源 及 製 作 納 豆 主 要 營 養 成 分 和 生 理 功 效 納 豆 激 酶 血 栓 冠 狀 動 脈 疾 病 納 豆 激 酶 功 效 於 血 栓 之 驗 證...7 IV

8 1.8 納 豆 激 酶 功 效 於 高 血 壓 患 者 之 功 效 預 防 骨 質 疏 鬆 保 健 食 品 及 藥 物 服 用 之 準 則 研 究 目 的 第 二 章 實 驗 材 料 菌 株 質 體 表 現 載 體 pet26b 之 製 備 實 驗 藥 品 及 材 料 實 驗 儀 器...14 第 三 章 實 驗 方 法 質 體 抽 取 勝 任 細 胞 (Competent Cell) 的 製 備 轉 型 作 用 (Transformation) 重 組 納 豆 激 酶 的 誘 導 表 現 Caseinolytic activity 的 檢 測 第 四 章 實 驗 結 果 與 討 論 以 TB 為 培 養 液 時 重 組 納 豆 激 酶 之 表 現 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 IPTG 作 為 誘 V

9 導 劑 時 之 酵 素 活 性 表 現 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 lactose 作 為 誘 導 劑 時 之 酵 素 活 性 表 現 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 lactose 與 IPTG 共 同 誘 導 時 之 酵 素 活 性 表 現.. 22 第 五 章 結 論 第 六 章 圖 與 表...25 參 考 文 獻 圖 表 目 錄 表 1. 培 養 於 TB+SB 以 IPTG 誘 導 時 胞 內 及 胞 外 納 豆 激 酶 活 性 比 較...25 表 2. 培 養 於 TB+SB 以 lactose 誘 導 時 胞 內 及 胞 外 納 豆 激 酶 活 性 比 較...25 表 3. 培 養 於 TB+SB 以 lactose 加 入 IPTG 誘 導 時 胞 內 及 胞 外 納 豆 激 酶 活 性 比 較...26 圖 1. Cloning vector pet26b 之 基 因 圖 譜...27 圖 2. 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli 在 37 o C 下 於 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB broth 中 誘 導 之 表 現...28 圖 3. 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli 在 37 o C 下 於 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB VI

10 broth 中 誘 導 之 表 現...30 圖 4. 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli 在 37 o C 下 於 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB broth 中 誘 導 之 現...32 VII

11 第 一 章 前 言 1.1 日 本 人 之 飲 食 習 慣 世 界 衛 生 組 織 (World Health Organization, WHO) 指 出, 四 大 因 素 影 響 人 類 的 健 康 與 壽 命 : 一 是 遺 傳, 佔 15%; 二 是 環 境, 佔 17%; 三 是 醫 療, 佔 8%; 四 是 生 活 方 式, 佔 60% 因 此 生 活 方 式 為 最 主 要 的 決 定 性 因 素 日 本 人 是 全 世 界 最 長 壽 的 民 族, 其 特 有 的 傳 統 飲 食 正 是 長 壽 的 重 要 基 石 日 本 人 膳 食 時 注 重 保 全 食 物 的 營 養 及 減 少 毒 素, 認 為 烹 調 的 優 先 順 序 應 為 生 蒸 煮 炒 烤 炸 Kumi 等 人 從 1992 年 在 日 本 岐 阜 高 山 地 區 針 對 35 歲 以 上 族 群 進 行 飲 食 習 慣 研 究 報 告 有 效 問 卷 中 男 性 約 份 女 性 約 份, 平 均 年 齡 為 男 姓 54.2 歲, 女 性 55.1 歲 結 果 指 出 飲 食 內 容 除 主 食 穀 類 外, 依 序 為 蔬 果 乳 製 品, 接 著 便 是 豆 類 製 品 海 鮮 及 藻 類 製 品 (Kumi et al., 2008) 而 日 本 人 最 常 直 接 攝 取 之 豆 類 製 品 即 是 納 豆 及 味 噌 1.2 納 豆 的 起 源 及 製 作 納 豆 即 為 大 豆 ( 或 稱 黃 豆 ) 經 納 豆 菌 發 酵 後 所 產 生 的 食 品 除 大 豆 本 身 豐 富 的 營 養 素 外, 獨 特 的 風 味 及 黏 性 更 提 供 多 種 營 養 素 1

12 古 書 和 漢 三 才 圖 會 記 載 : 納 豆 自 中 國 秦 漢 以 來 開 始 製 作 始 於 中 國 的 豆 豉, 日 本 也 曾 稱 納 豆 為 豉, 平 城 京 出 土 的 木 簡 中 也 有 豉 宇 由 於 豆 豉 在 僧 家 寺 院 的 納 所 製 造 後 放 入 甕 桶 貯 藏, 後 由 禪 僧 從 中 國 傳 播 到 日 本 寺 廟, 所 以 納 豆 首 先 在 寺 廟 得 到 發 展, 亦 稱 唐 納 豆 或 鹹 納 豆 隨 後 依 當 地 環 境 發 展 出 納 豆 納 豆 的 傳 統 製 法 乃 將 蒸 熟 的 黃 豆 用 稻 草 包 裹 起 來, 並 保 持 在 攝 氏 40 度 放 置 一 日, 稻 草 上 常 見 的 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 因 可 產 生 芽 孢 而 耐 熱 度 高, 殺 菌 過 程 不 受 破 壞, 高 溫 培 養 速 度 快 也 能 抑 制 其 他 菌 種, 並 使 黃 豆 發 酵 後 產 生 黏 稠 的 絲 狀 物, 這 種 黏 稠 物 主 要 成 分 由 穀 氨 酸 (glutamic acid) 所 聚 合 而 成, 是 納 豆 美 味 的 來 源 二 十 世 紀 後 期 高 品 質 稻 草 取 得 不 易, 多 已 改 用 保 麗 龍 或 紙 製 容 器 盛 裝 販 售 因 此 現 代 的 製 作 方 式, 是 利 用 蒸 過 的 黃 豆 加 上 人 工 培 養 出 的 納 豆 菌 混 合 後, 直 接 放 在 容 器 中 使 之 發 酵 除 黃 豆 之 外, 例 如 黑 豆 綠 豆, 甚 至 於 副 原 料 海 帶 紫 菜 的 添 加 等 亦 能 製 成 納 豆 納 豆 最 讓 人 詬 病 的 便 是 納 豆 氨 特 殊 的 氣 味 有 人 將 納 豆 加 入 芥 末 高 湯 醬 油, 也 有 人 將 生 雞 蛋 蔥 茗 荷 蘿 蔔 柴 魚 等 各 種 食 材 一 起 混 合 90 年 代 後 期, 因 納 豆 激 酶 的 功 效 被 電 視 及 媒 體 爭 相 報 導, 大 大 提 升 原 本 食 用 率 不 高 的 關 西 四 國 地 區 的 食 用 率 (Meerak et al., 2007) 2

13 1.3 納 豆 主 要 營 養 成 分 和 生 理 功 效 納 豆 含 皂 卵 磷 脂, 葉 酸 食 用 纖 維 鈣 鐵 鉀 ; 維 他 命 K 2 E 多 種 氨 基 酸 礦 物 質 及 植 物 固 醇 長 期 食 用 納 豆 具 有 溶 解 血 栓 預 防 糖 尿 病 預 防 骨 質 疏 鬆 症 抑 制 高 血 壓. 美 容 等 功 效 植 物 固 醇 普 遍 存 在 於 天 然 植 物 中, 包 括 黃 豆 花 生 芝 麻 紅 蘿 蔔 香 蕉 堅 果 花 椰 菜 等, 因 在 體 內 會 與 動 物 性 膽 固 醇 互 相 競 爭, 有 助 於 降 低 動 物 性 膽 固 醇 的 吸 收, 降 低 血 液 中 三 酸 甘 油 脂 的 吸 收, 進 而 降 低 總 膽 固 醇 壞 膽 固 醇 (Kanazawa et al., 2008) 納 豆 菌 食 品 是 經 過 發 酵 的 熟 食. 每 天 吃 可 發 揮 預 防 血 栓 類 疾 病 的 作 用, 尤 其 最 好 在 晚 飯 時 食 用, 因 血 栓 類 疾 病 如 心 肌 梗 塞 往 往 在 上 午 發 作, 而 食 用 納 豆 菌 食 品 後 二 至 八 小 時 血 栓 溶 解 的 速 率 比 較 高. 所 以 晚 上 食 用 納 豆 菌 食 品 可 以 預 防 次 日 上 午 的 發 作 不 同 於 其 他 酵 素. 納 豆 茵 可 以 耐 胃 酸 膽 汁 及 唾 液. 而 直 達 大 小 腸 口 服 方 式 食 用 可 以 提 高 腸 胃 消 化 功 能 抑 制 腸 道 有 害 菌, 提 高 身 體 抗 菌 性 免 疫 力, 促 進 腸 道 有 益 菌 ( 特 別 是 乳 酸 菌 ) 的 生 長 與 繁 殖, 增 進 腸 道 健 康 (Law et al., 2007) 在 老 鼠 及 21 位 健 康 志 願 者 進 行 之 試 驗 中 也 發 現, 納 豆 菌 產 品 可 減 緩 乙 酫 ( 即 酒 精 在 體 內 發 酵 後 之 產 物 ) 在 血 液 中 最 高 濃 度 的 時 間, 並 減 退 其 在 血 液 中 之 濃 度, 因 此 納 豆 亦 是 安 全 有 效 和 方 便 食 用 的 解 酒 產 品 (Sumi 3

14 et al., 1995) 1.4 納 豆 激 酶 Sumi 等 人 於 西 元 1987 年 由 納 豆 分 離 出 由 Bacillus subtilis 所 分 泌 之 一 種 具 有 分 解 血 纖 維 蛋 白 之 胞 外 酵 素 此 酵 素 經 純 化 分 離 出 後, 命 名 為 納 豆 激 酶 (nattokinase) 研 究 發 現,1 克 納 豆 所 含 的 納 豆 激 酶 約 等 於 40 CU (plasmin unit) 纖 維 蛋 白 分 解 酶, 或 1600 IU 的 尿 激 酶 (Sumi et al., 1987) 因 納 豆 激 酶 是 由 B. subtilis natto 分 泌 產 生, 可 藉 由 大 量 發 酵 培 養 B. subtilis natto 獲 得 價 格 便 宜 的 納 豆 激 酶 此 外, 納 豆 在 日 本 被 食 用 歷 史 已 千 餘 年, 早 已 證 實 是 個 無 安 全 上 顧 慮 的 食 品 (Sumi et al., 1990) Fujita 等 人 發 現, 納 豆 激 酶 除 了 具 有 像 血 纖 維 蛋 白 分 解 酶 一 樣 能 直 接 分 解 血 纖 維 蛋 白 的 能 力 外, 還 具 有 像 plasminogen activator 一 樣 的 功 能, 可 促 進 血 纖 維 分 解 酶 原 活 化 的 作 用 (Sumi et al., 1987, Fujita et al., 1993) 納 豆 激 酶 為 第 一 種 從 發 酵 食 品 中 鑑 定 分 離 具 有 溶 解 血 纖 維 能 力 的 酵 素, 是 屬 於 由 特 定 菌 株 Bacillus subtilis var. natto 所 分 泌 的 一 種 subtilisin, 因 此 納 豆 激 酶 又 稱 subtilisin NAT Subtilisin 是 Bacillus sp. 所 分 泌 的 多 種 胞 外 酵 素 中 的 一 種 這 種 alkaline serine protease 會 因 不 同 的 Bacillus sp. 分 泌 而 有 不 同 例 如 由 Bacillus licheniformis 所 分 泌 的 subtilisin Carlsberg, Bacillus 4

15 amyloliquefaciens 分 泌 的 subtilisin BPN 和 subtilisin DJ-4, Bacillus amylosacchariticus 則 可 分 泌 subtilisin Amylosacchariticus, 而 Bacillus subtilis 則 發 現 至 少 分 泌 了 subtilisin E subtilisin J subtilisin NAT 等 酵 素 一 般 醫 療 上 多 半 經 由 點 滴 注 射 尿 激 酶 治 療 血 栓,Sumi 等 人 於 西 元 1980 將 尿 激 酶 以 膠 囊 包 裝, 伴 隨 控 制 組 ( 安 慰 劑 ), 將 牛 隻 培 養 之 血 纖 維 素, 靜 脈 注 射 至 犬 類 體 內 以 誘 導 血 栓, 測 試 其 腸 道 吸 收 效 果 結 果 發 現 投 予 尿 激 酶 犬 隻 之 真 球 蛋 白 ( 即 血 塊 ) 溶 解 時 間 (euglobulin lysis time, ELT) 小 於 投 予 安 慰 劑 之 犬 隻 (Sumi et al., 1980) 因 尿 激 酶 價 格 昂 貴, 且 於 腸 道 吸 收 不 甚 穩 定, 因 此 又 測 試 其 他 纖 維 蛋 白 分 解 酵 素 - 鏈 激 酶 及 蚓 激 酶, 但 兩 者 皆 會 引 起 小 腸 內 出 血 之 副 作 用 Sumi 等 人 陸 續 研 究 超 過 173 種 ( 包 含 酒 類 ) 之 天 然 食 品, 無 意 間 發 現 納 豆 具 有 纖 維 蛋 白 溶 解 酵 素 之 成 分 1.5 血 栓 血 栓 的 主 要 成 分 是 血 纖 維 蛋 白 (fibrin), 血 纖 維 蛋 白 的 形 成 旨 在 保 護 生 物 體, 避 免 因 外 傷 或 碰 撞 而 造 成 血 流 不 止 血 纖 維 蛋 白 形 成 是 藉 由 coagulation cascade 的 啟 動 Coagulation cascade 是 一 連 串 複 雜 的 生 化 機 制, 會 使 凝 血 酶 原 (prothrombin) 活 化 變 成 具 有 活 性 的 凝 血 酶 (thrombin) 凝 血 酶 會 使 原 本 溶 解 在 血 液 中 的 血 纖 維 蛋 白 原 (fibrinogen) 凝 集 成 膠 狀 聚 合 物, 血 纖 維 蛋 白 (fibrin), 即 血 栓 的 主 要 成 分 簡 單 地 說, 5

16 即 經 由 血 管 內 皮 細 胞 的 受 損, 造 成 粥 狀 斑 塊 的 潰 瘍 或 破 裂, 進 而 活 化 血 液 凝 結 的 機 能, 迅 速 形 成 血 栓 粥 狀 斑 塊 的 破 裂, 通 常 會 引 發 內 皮 細 胞 下 層 一 些 容 易 造 成 血 栓 的 分 子, 大 量 釋 放 於 斑 塊 附 近, 導 致 血 小 板 的 堆 積, 進 而 形 成 富 含 血 小 板 的 血 栓 經 由 這 樣 的 途 徑, 許 多 的 刺 激 因 子 便 會 造 成 更 大 量 的 血 小 板 附 著, 而 血 栓 可 能 會 漸 漸 變 大 隨 後 凝 血 纖 維 蛋 白 漸 漸 形 成, 並 會 網 住 紅 血 球, 嚴 重 的 話 最 後 整 條 血 管 都 塞 住, 使 得 血 流 中 斷 某 部 分 血 栓 形 成 時, 是 沒 有 症 狀 的 一 來 血 栓 可 能 一 部 分 溶 解 掉, 或 是 與 壁 斑 塊 融 合, 因 而 沒 有 缺 氧 或 阻 塞 的 臨 床 表 現 事 實 上, 每 個 人 體 內 有 許 多 不 同 的 因 子, 會 決 定 血 栓 形 成 的 嚴 重 程 度, 影 響 其 臨 床 症 狀 表 現, 包 括 粥 狀 斑 塊 瓦 解 的 程 度 血 管 狹 窄 的 程 度 血 管 的 彈 性 血 管 痙 攣 的 程 度 以 及 凝 血 與 溶 血 活 性 的 平 衡 等 (Nesheim et al., 2003) 1.6 冠 狀 動 脈 疾 病 冠 狀 動 脈 疾 病 產 生 有 下 列 以 下 主 因 : 1. 動 脈 粥 狀 硬 化.. 起 因 為 動 脈 的 內 皮 細 胞 受 損, 造 成 膽 固 醇 在 內 皮 細 胞 下 堆 積, 經 由 血 液 中 單 核 細 胞 的 作 用, 使 得 內 皮 細 胞 變 性, 血 小 板 堆 積, 平 滑 肌 增 生, 形 成 粥 狀 腫, 動 脈 管 腔 因 而 逐 漸 狹 窄, 血 流 不 暢 順 這 好 比 是 水 溝 長 期 堆 積 了 淤 泥, 使 得 水 流 不 暢 6

17 2. 血 小 板 凝 集 : 血 小 板 被 活 化 是 產 生 動 脈 血 栓 的 主 因, 如 果 血 小 板 凝 集 力 增 強, 會 阻 塞 動 脈 3. 血 管 痙 攣.. 在 粥 樣 病 灶 附 近 的 血 管, 會 因 張 力 過 度 作 用, 造 成 痙 攣 及 收 縮 4. 血 栓 形 成 : 約 25 ~ 60% 的 病 人 有 血 栓 與 粥 樣 動 脈 硬 化 共 存 的 情 形 美 國 心 臟 學 會 確 立 罹 患 冠 狀 動 脈 疾 病 之 危 險 族 群 包 括 : 大 於 45 歲 的 男 性, 或 大 於 55 歲 停 經 後 的 女 性 家 族 有 心 臟 病 或 猝 死 病 史 者 高 血 壓 高 血 脂 糖 尿 病 及 抽 菸 者 ( 美 國 心 臟 學 會 網 頁 ) 1.7 納 豆 激 酶 功 效 於 血 栓 之 驗 證 Sumi 等 人 於 1990 年 進 行 納 豆 激 酶 的 人 體 臨 床 試 驗, 其 中 試 驗 組 於 三 餐 飯 後 服 用 含 650 mg 納 豆 激 酶 膠 囊 兩 顆 ( 即 1.3 g) 一 回 ; 控 制 組 則 於 早 餐 前 食 用 200 公 克 納 豆 一 次 ; 兩 週 後 同 一 批 志 願 者 改 為 於 早 餐 前 食 用 200 公 克 煮 熟 之 大 豆 攝 取 試 驗 品 ( 納 豆 激 酶 膠 囊 納 豆 或 煮 熟 大 豆 ) 後 及 24 小 時 抽 血 檢 測 血 漿 (plasma) 中 真 球 蛋 白 ( 即 血 塊 ) 溶 解 時 間 (euglobulin lysis time, ELT) 以 及 真 球 蛋 白 血 纖 維 分 解 活 性 (euglobulin fibrinolytic activity, EFA) 統 計 結 果 顯 示, 攝 取 納 豆 的 志 願 者, 其 真 球 7

18 蛋 白 溶 解 時 間 較 短 ( 相 對 於 食 用 前 和 食 用 大 豆 時 作 比 較 ); 而 在 食 用 納 豆 後 4 小 時 其 真 球 蛋 白 血 纖 維 分 解 活 性 最 高 大 豆 攝 取 組 在 同 樣 時 間 抽 血 檢 測 血 漿 中 真 球 蛋 白 溶 解 時 間, 則 與 未 食 用 前 無 顯 著 差 異 ; 至 於 真 球 纖 維 蛋 白 溶 解 效 率 則 無 檢 測 出 換 言 之, 攝 取 納 豆 後 其 血 塊 溶 解 時 間 較 攝 取 大 豆 者 短, 即 血 塊 溶 解 效 率 較 高 至 於 三 餐 飯 後 口 服 1.3 g 納 豆 激 酶 膠 囊 者, 其 真 球 蛋 白 血 纖 維 分 解 活 性 (EFA) 明 顯 增 加 至 第 四 天, 且 口 服 後 第 八 天 尚 逐 漸 升 高 ; 而 纖 維 蛋 白 裂 解 產 物 (fibrin degradation product, FDP) 則 從 第 二 天 起 明 顯 減 少 至 第 四 天, 且 口 服 後 第 八 天 仍 逐 漸 下 降 此 實 驗 結 果 顯 示, 納 豆 激 酶 是 一 安 全 且 可 量 產 之 治 療 及 預 防 血 栓 之 產 品 (Sumi et al., 1990) 1.8 納 豆 激 酶 於 高 血 壓 患 者 之 功 效 高 血 壓 已 是 現 今 全 球 性 健 康 議 題 在 台 灣 約 有 四 百 萬 高 血 壓 人 口, 美 國 約 有 五 千 萬 人 口, 而 鄰 國 日 本 及 韓 國 則 將 近 三 分 之 ㄧ 人 口 罹 患 高 血 壓 血 栓 易 引 起 血 管 硬 化 及 高 血 壓 進 而 引 起 腦 栓 塞 等 病 變, 因 此 預 防 及 治 療 高 血 壓 亦 成 為 一 重 要 議 題 西 元 2006 年 起 Kim 等 人, 針 對 初 期 高 血 壓 患 者 ( 三 次 收 縮 壓 量 測 平 均 值 結 果 落 在 130~159 毫 米 汞 柱 ) 執 行 一 臨 床 試 驗, 每 日 隨 機 投 與 含 2000 FU(fibrinolytic unit) 納 豆 激 酶 膠 囊 或 安 慰 劑, 為 期 八 週 試 驗 期 間 除 觀 察 8

19 志 願 者 之 血 壓, 亦 觀 察 記 錄 其 熱 量 攝 取 熱 量 消 耗 碳 水 化 合 物 脂 肪 鹽 分 鈉 及 膽 固 醇 之 攝 取 比 例 或 量 而 後 分 別 分 析 比 較 試 驗 參 與 前 及 八 週 後 的 血 壓 值 (Kim et al., 1990) 完 成 試 驗 組 ( 投 予 納 豆 激 酶 膠 囊 者 ) 共 44 人, 控 制 組 ( 投 與 安 慰 劑 者 ) 共 42 人 結 果 顯 示, 兩 組 志 願 者 其 熱 量 攝 取 及 營 養 分 佈 在 試 驗 初 期 及 後 期 無 顯 著 差 異 之 狀 態 下, 試 驗 組 收 縮 壓 及 舒 張 壓 平 均 降 低 及 5.7 毫 米 汞 柱, 控 制 組 則 分 別 降 低 7.7 及 2.8 毫 米 汞 柱, 前 者 明 顯 較 後 者 降 低 約 2 倍 左 右 由 此 結 果 得 知, 在 無 須 改 變 飲 食 之 狀 態 例 行 服 用 納 豆 激 酶 可 以 有 效 降 低 血 壓 值 1.9 預 防 骨 質 疏 鬆 骨 質 疏 鬆 症 乃 因 骨 質 量 的 減 少, 使 得 骨 骼 變 得 脆 弱, 而 容 易 發 生 骨 折, 尤 其 容 易 發 生 在 停 經 後 的 女 性 目 前 已 知 γ-carboxylated osteocalcin 會 促 使 骨 頭 內 的 成 骨 細 胞 礦 化, 提 高 骨 頭 的 密 度 與 強 度 而 vitamin K 被 指 出 在 進 行 osteocalcin 上 γ-glutamate residues 的 羧 化 過 程 中, 扮 演 一 個 不 可 或 缺 的 重 要 角 色, 所 以 除 了 增 加 鈣 質 的 吸 收 外, 提 高 體 內 的 vitamin K 含 量 亦 可 預 防 骨 質 疏 鬆 症 的 發 生 (Tsukamoto et al., 2001) 而 食 用 納 豆 可 提 高 體 內 維 他 命 K 2 (Takemura et al., 2006), 更 可 有 效 改 善 停 經 婦 女 骨 質 疏 鬆 症 狀 發 生 (Katsuyama et al., 2004) 9

20 1.10 保 健 食 品 及 藥 物 服 用 之 準 則 根 據 中 央 健 保 局 的 血 脂 異 常 之 起 步 治 療 準 則, 非 心 血 管 疾 病 患 者, 具 有 以 下 三 種 狀 況 任 ㄧ 者, 都 要 接 受 三 到 六 個 月 非 藥 物 治 療, 包 括 飲 食 運 動 使 用 保 健 食 品 等 1. 總 膽 固 醇 200 mg/dl 或 壞 膽 固 醇 130 mg/dl 且 有 2 個 危 險 因 子 ;2. 總 膽 固 醇 240 mg/dl 或 壞 膽 固 醇 160 mg/dl;3. 三 酸 甘 油 脂 200 mg/dl ( 需 同 時 合 併 有 總 膽 固 醇 >35 mg/dl) 其 中 危 險 因 子 指 的 是 高 血 壓 糖 尿 病 男 性 45 歲 有 早 發 性 冠 心 病 家 族 史 女 性 55 歲 或 停 經 沒 用 雌 激 素 療 法 者 吸 菸 以 上 具 危 險 因 子 則 群 可 服 用 紅 麴 魚 油 可 可 亞 天 然 蜂 膠 等 營 養 食 品, 而 納 豆 保 健 食 品 則 具 經 濟 及 食 用 便 利 之 優 勢 納 豆 中 的 有 效 成 分 是 納 豆 激 酶, 可 促 使 纖 維 蛋 白 溶 解 酶 原, 轉 變 為 具 活 性 得 纖 維 蛋 白 溶 解 酶, 進 而 達 到 局 部 溶 解 血 栓 或 血 塊 的 作 用, 亦 可 降 低 總 膽 固 醇 與 壞 膽 固 醇 但 納 豆 保 健 食 品 吃 太 多, 可 能 會 有 出 血 不 止 的 情 況 曾 經 就 有 案 例 長 期 過 量 使 用 納 豆 保 健 食 品, 日 食 劑 量 為 2 顆, 但 他 卻 吃 5 顆, 不 久 便 因 痔 瘡 出 血 不 止 而 送 醫, 經 抽 血 檢 查, 其 血 紅 素 值 僅 3.7 mg/dl ( 正 常 健 康 男 性 應 達 14 mg/dl) 除 了 孕 婦 和 正 在 使 用 抗 凝 血 藥 病 人, 其 實 一 般 民 眾 使 用 保 健 食 品 時 一 定 要 先 向 醫 師 藥 師 詢 問, 並 依 據 建 議 或 標 示 使 用 量 食 用, 切 勿 自 行 10

21 增 加 或 減 少 尤 其 是 消 化 性 潰 瘍 痔 瘡 預 備 接 受 手 術 及 拔 牙 患 者, 或 女 性 經 期 期 間, 應 審 慎 使 用 納 豆 激 酶 產 品 包 括 aspirin 在 內 的 水 楊 酸 鹽 類 (salicylates) 具 有 解 熱 止 痛 消 炎 及 抗 風 濕 作 用 它 們 能 使 末 梢 血 管 擴 張, 促 進 熱 度 的 消 散 而 降 低 體 溫 消 炎 及 止 痛 效 果 可 能 經 由 抑 制 前 列 腺 素 合 成 而 產 生 亦 具 有 不 可 逆 的 血 小 板 凝 集 抑 制 作 用 單 次 劑 量 的 aspirin 可 延 長 出 血 時 間, 它 會 使 血 小 板 內 的 cyclo-oxygenase 乙 醯 化, 而 防 止 一 種 強 力 血 管 收 縮 劑 及 血 小 板 凝 集 及 釋 出 的 誘 發 劑 -thromboxane A 2 的 合 成 這 項 不 可 逆 反 應 使 aspirin 的 血 小 板 凝 集 抑 制 作 用 長 達 7-10 天, 因 此 Aspirin 可 用 於 血 栓 栓 塞 患 者, 作 為 抗 血 小 板 劑 正 在 服 用 aspirin 患 者 需 謹 慎 服 用 納 豆 激 酶 類 之 藥 品 或 保 健 食 品, 避 免 因 交 互 作 用 影 響 凝 血 功 能 (Chang et al., 2008) 1.11 研 究 目 的 使 用 E. coli 異 源 表 現 蛋 白 質 常 會 產 生 沒 有 活 性 的 inclusion body, 目 前 解 決 此 問 題 的 策 略 包 括 降 低 培 養 溫 度 調 整 誘 導 劑 濃 度 添 加 compatible solutes 於 培 養 液 與 chaperon 共 同 表 現 等 先 前 研 究 ( 林, 2006) 以 添 加 compatible solutes-sorbitol 和 betaine 於 培 養 液 和 調 整 培 養 溫 度 的 方 式, 成 功 改 善 納 豆 激 酶 於 E. coli 中 的 異 源 表 現, 獲 得 具 活 性 的 蛋 白 本 研 究 參 考 其 方 法, 但 置 換 誘 導 劑 或 改 變 誘 導 劑 濃 度, 期 望 以 11

22 較 具 經 濟 效 益 方 式 獲 得 納 豆 激 酶 由 於 亦 有 先 前 研 究 (Tseng et al., 2007) 顯 示,lactose 和 IPTG 共 同 作 為 誘 導 劑 誘 導 E. coli 的 異 源 表 現, 可 使 蛋 白 表 現 量 超 過 任 一 誘 導 劑 單 獨 使 用 時, 故 本 研 究 亦 嘗 試 以 lactose 搭 配 不 同 濃 度 IPTG 進 行 誘 導 12

23 第 二 章 實 驗 材 料 2.1 菌 株 使 用 E. coli strain BL-21(DE3) [F - ompt hsds B (r B - m B - ) gal dcm (DE3)] 為 expression host 2.2 質 體 本 實 驗 所 使 用 之 ppronat 為 先 前 所 建 構 ( 林, 2006), 乃 將 納 豆 激 酶 基 因 由 pet-26b(+) 之 納 豆 激 酶 表 現 載 體 MscI/XhoI 切 位 銜 接 殖 入 而 成 2.3 表 現 載 體 pet26b 的 製 備 pet26b 質 體 大 小 為 5360 base pairs ( 購 自 Novagen, 圖 1), 具 有 kanamycin selection marker 因 為 在 其 multiple cloning sites (MCS)5 端 有 pelb leader sequence, 所 以 由 此 重 組 殖 入 的 基 因 表 現 後, 所 產 生 的 蛋 白 N-terminal 具 有 pelb signal sequence, 可 被 導 引 至 periplasm 而 在 MCS 3 端 有 六 個 連 續 His codon, 所 以 表 現 出 來 蛋 白 的 C 端 具 6 個 His residues (His Tag), 利 用 此 特 性 可 以 metal chelating affinity chromatography 進 行 純 化 13

24 納 豆 激 酶 完 整 的 蛋 白 質 序 列 包 含 signal peptide propeptide 及 mature 納 豆 激 酶 三 個 部 份 Bacllus subtilis 可 利 用 signal peptide 將 納 豆 激 酶 分 泌 到 胞 外, 而 propeptide 則 可 以 幫 助 表 現 出 的 納 豆 激 酶 正 確 摺 疊 PProNAT 則 僅 帶 有 具 propeptide 對 應 基 因 序 列 的 納 豆 激 酶 基 因 2.4 實 驗 藥 品 及 材 料 Agar sodium chloride 購 自 Amresco (USA) ; kanamycin 購 自 Calbiochem (USA);BugBuster Protein Extraction reagent Benzonase 購 自 Novagen (Darmstadt, Germany);azocasin sorbitol 購 自 Sigma (St. Louis, MO, USA) ; tryptone yeast extract 購 自 USB (USA) ; dipotassium hydrogenphosphate glycerol hydrogen chloride potassium hydrogenphate sodium hydroxide 購 自 Wako (Osaka, Japan);Tris base 購 自 生 工 有 限 公 司 (Taipei, Taiwan);Genemark plasmid miniprep purification kit 購 自 禾 鑫 (Taipei, Taiwan) 2.5 實 驗 儀 器 ph 電 極 (Mettler Toledo combination ph electrode); 分 光 光 度 計 (Multiskan Spectrum Microplate Spectrophotometer, Thermo Labsystems); 微 量 離 心 機 (Microcentrifuge, z233mk2, Hermle); 恆 溫 培 養 14

25 箱 (Dry bath incubator); 震 盪 培 養 箱 (Shaking incubator, TV-400, Yihder); 電 磁 加 熱 攪 拌 器 (Stirrer/Hot Plate, Corning) ; 震 盪 器 (Vortex, Vortex-Genie-2, Scientific Industries) 15

26 第 三 章 實 驗 方 法 3.1 質 體 抽 取 挑 取 單 一 菌 落 培 養 於 3 ml 含 有 30 μg/ml kanamycin LB broth 內, 於 37 o C 下 以 200 rpm 震 盪 培 養 overnight 後, 將 培 養 液 以 13,000 g 離 心, 完 全 去 除 上 清 液 ( 培 養 基 ) 並 收 集 pellet 於 微 量 離 心 管 內 首 先 加 入 200 μl solution I (Genemark plasmid miniprep purification kit 購 自 禾 鑫, 型 號 : DP01-300),vortex 使 菌 體 重 新 懸 浮 後, 再 加 入 200 μl solution II, 反 覆 倒 置 微 量 離 心 管 數 次, 最 後 加 入 200 μl solutionⅢ, 同 樣 反 覆 倒 置 微 離 心 管 數 次, 於 4 o C 下 以 13,000 g 離 心 10 分 鐘 另 將 spin column 放 入 collection tube 中, 把 離 心 後 得 到 之 上 清 液 放 入 spin column 中, 以 13,000 g 離 心 1 分 鐘 去 除 collection tube 內 的 液 體 後, 再 加 入 600 μl washing solution 於 spin column, 並 以 13,000 g 離 心 1 分 鐘, 丟 棄 collection tube 內 的 液 體 再 重 複 此 清 洗 步 驟 一 次, 離 心 3 分 鐘 隨 後 將 spin column 放 在 一 個 乾 淨 的 微 離 心 管 上, 置 於 60 o C 5 分 鐘, 去 除 殘 餘 的 酒 精 再 加 入 30 μl elution buffer 靜 置 室 溫 3 分 鐘 後, 以 13,000 g 離 心 3 分 鐘, 此 時 在 微 離 心 管 內 的 液 體 即 含 欲 純 化 之 質 體 保 存 於 -20 o C 待 用 16

27 3.2 勝 任 細 胞 (Competent Cell) 的 製 備 1. 取 單 一 菌 落 Escherichia coli strain BL21(DE3) 接 種 於 3 ml LB 培 養 液 中, 在 37 o C 下 200 rpm 震 盪 培 養 12~16 小 時 2. 取 300 μl 隔 夜 震 盪 培 養 之 菌 液, 接 種 於 30 ml LB 培 養 液 中,37 o C 下 200 rpm 震 盪 培 養 至 菌 液 濃 度 OD 600 為 0.5, 置 於 冰 上 5~10 分 鐘 後 以 1,600 g 4 o C 下 離 心 10 分 鐘, 去 除 上 清 液 3. 加 入 5 ml 冰 冷 的 CaCl 2 solution (60 mm CaCl 2 15% glycerol 和 10mM PIPES,pH 7 autoclaved), 以 溫 和 的 方 式 使 菌 體 均 勻 懸 浮 後, 再 以 1,600 g 4 o C 下 離 心 5 分 鐘, 去 除 上 清 液 4. 再 加 入 5 ml 冰 冷 的 CaCl 2 solution, 以 溫 和 的 方 式 使 菌 體 均 勻 懸 浮, 置 於 冰 上 30 分 鐘 後, 以 1,600 g 4 o C 下 離 心 五 分 鐘, 去 除 上 清 液 5. 最 後 再 加 入 3 ml 冰 冷 的 CaCl 2 solution, 輕 輕 搖 晃 使 菌 體 均 勻 懸 浮 後, 分 裝 200 μl 至 事 先 預 冷 之 微 量 離 心 管 中, 置 於 冰 上 立 即 使 用 或 儲 存 於 -80 o C 備 用 3.3 轉 形 作 用 (Transformation) 將 建 構 好 重 組 質 體 加 入 200 μl 的 competent cell 中, 接 著 靜 置 於 冰 上 30 分 鐘 接 著 放 入 42 o C 的 水 浴 中 1 分 鐘, 以 進 行 heat shock, 而 後 隨 即 放 回 冰 上 15 分 鐘 加 入 1 ml 的 LB medium 至 微 量 離 心 管 中, 並 於 37 o C 下

28 rpm 震 盪 培 養 1 小 時 取 適 量 之 菌 液 塗 佈 於 含 有 適 當 kanamycin 的 LB agar plate 上, 並 倒 置 培 養 於 37 o C 下 12~16 小 時 3.4 重 組 納 豆 激 酶 的 誘 導 表 現 首 先 挑 取 帶 ppronat 的 E.coli strain BL21(DE3) 單 一 菌 落, 置 於 含 3 ml 0.1mg/ml kanamycin 的 Luria-Bertani (LB) 培 養 液 (0.5%yeast extract 1%tryptone 1%NaCl 及 0.02%NaOH), 於 37 o C 下 以 200 rpm 震 盪 培 養 至 菌 液 濃 度 OD 600 約 0.4 ~ 0.5 時, 分 別 取 菌 液 200 μl 塗 佈 於 含 0.1mg/ml kanamycin 的 LB 固 態 培 養 基 上, 而 後 放 入 37 培 養 箱 中 培 養 12~16 小 時 接 著 取 出 培 養 基 將 所 有 菌 落 刮 於 5 ml terrific broth (TB; 2.4% yeast extract 1.2% tryptone 0.4% glycerol 2.31% potassium hydrogenphosphate 12.54% dipotassium hydrogenphosphate) 中, 使 其 完 全 懸 浮 以 作 為 接 種 源 取 1 ml 菌 液 接 種 於 有 擋 板 的 500 ml 錐 形 瓶 中, 內 含 100 ml 含 0.1 mg/ml kanamycin 之 TB 於 37 o C 下 以 200 rpm 震 盪 培 養 達 OD 600 約 為 1.8 時, 將 菌 液 離 心, 另 以 含 有 2.5 mm betaine 及 1 M sorbitol 的 TB 重 新 懸 浮 後, 分 別 加 入 不 同 濃 度 IPTG (isopropy-β-d-thiogalactopyranoside) 或 lactose 誘 導 表 現, 並 調 整 誘 導 培 養 溫 度 為 25 o C 隨 後, 於 不 同 的 時 間 分 別 收 集 200 μl 菌 液, 以 13,000 g 離 心 10 分 鐘 後, 收 集 上 清 液 直 接 進 行 胞 外 活 性 測 試, 而 pellet 以 40 μl 18

29 BugBuster Protein Extraction Reagent ( 含 0.2 unit benzonase), 進 行 菌 體 破 碎 15 分 鐘 後, 再 以 13,000 g 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 檢 測 納 豆 激 酶 胞 內 活 性 3.5 Caseinolytic activity 的 檢 測 使 用 經 修 改 的 Singh 等 人 方 法 測 定 誘 導 後 胞 外 及 胞 內 重 組 納 豆 激 酶 的 活 性 (Singh et al., 2001), 乃 以 azocasein 為 受 質, 檢 測 產 物 於 波 長 420 nm 的 吸 光 值 1 unit 定 義 為 每 10 分 鐘, 吸 光 值 增 加 1 操 作 步 驟 如 下 : 取 200 μl 的 菌 液, 經 離 心 後, 分 別 收 集 pellet 和 上 清 液 pellet 以 40 μl BugBuster Protein Extraction Reagent ( 內 含 0.2 unit benzonase) 重 新 懸 浮, 並 處 理 15 分 鐘 取 150 μl 0.8% azocasein ( 溶 於 0.23 M Tris buffer, ph 10) 放 置 於 37 o C 下 5 分 鐘 預 熱, 加 入 200 μl 上 清 液 或 40 μl 破 菌 液 ( 加 入 160 μl 無 菌 水 補 足 體 積 ), 於 37 o C 下 反 應 10 分 鐘 後, 加 入 650 μl 10 % TCA, 於 37 o C 下 靜 置 10 分 鐘 以 沉 澱 未 反 應 的 azocasein 最 後 以 12,500 rpm 離 心 10 分 鐘, 收 集 上 清 液 並 加 入 200 μl 2N NaOH, 測 量 OD 420 的 吸 光 值 檢 視 以 不 同 誘 導 劑 誘 導 下 的 活 性, 將 重 組 納 豆 激 酶 培 養 至 菌 液 (OD 600 ) 達 1.8, 分 別 以 10 mm lactose 10 mm lactose mm IPTG 10 mm lactose mm IPTG, 及 0.05 mm 0.1 mm 1 mm IPTG 進 行 誘 導 後, 再 收 集 樣 品 進 行 活 性 分 析 19

30 第 四 章 實 驗 結 果 與 討 論 4.1 以 TB 為 培 養 液 時 重 組 納 豆 激 酶 之 表 現 於 37 o C 下, 以 TB 培 養 帶 有 ppronat 的 E. coli strain BL21(DE3), 200 rpm 震 盪 培 養 至 OD 600 = 1.8 時, 添 加 1 mm IPTG 進 行 誘 導, 並 將 培 養 溫 度 調 整 為 25 o C 下 進 行 蛋 白 表 現 在 誘 導 後 不 同 時 間 點 收 集 樣 品 檢 測 活 性, 於 胞 內 外 皆 未 測 得 納 豆 激 酶 活 性 4.2 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 IPTG 作 為 誘 導 劑 時 之 酵 素 活 性 表 現 同 上 述, 先 以 TB 震 盪 培 養 帶 有 ppronat 的 E.coli strain BL21(DE3) 至 OD 600 = 1.8 時, 將 培 養 液 置 換 成 含 有 1M sorbitol 和 2.5 mm betaine 的 TB, 並 分 別 加 入 1 mm IPTG 0.1 mm IPTG 及 0.05 mm IPTG 進 行 誘 導, 並 將 培 養 溫 度 下 降 為 25 o C 在 誘 導 後 不 同 時 間 點 收 集 樣 品 分 別 檢 測 胞 外 和 胞 內 酵 素 活 性, 結 果 如 表 1 和 圖 2 所 示 在 相 同 培 養 誘 導 條 件 下, 胞 內 活 性 接 較 胞 外 活 性 為 高, 而 且 活 性 高 峰 出 現 的 較 胞 外 的 早 約 8 小 時 0.05 mm IPTG 誘 導 後 24 小 時 的 胞 外 酵 素 最 佳 活 性 2.3 U/ml,0.1 及 1 mm IPTG 誘 導 後 24 小 時 的 胞 外 酵 素 最 佳 活 性 分 別 為 2.7 和 3.2 U/ml; 20

31 胞 內 酵 素 活 性 最 高 均 為 誘 導 後 8 小 時, 及 1 mm IPTG 誘 導 最 佳 活 性 分 別 為 及 4.3 U/ml; 生 長 曲 線 則 於 誘 導 後 4 小 時 達 一 高 峰 後 逐 漸 下 降 又 於 24 小 時 達 一 高 峰 後 逐 漸 下 降 比 較 胞 外 與 胞 內 酵 素 活 性, 發 現 胞 內 酵 素 活 性 約 為 胞 外 1.5 至 2 倍, 表 示 菌 體 所 製 造 的 酵 素 大 部 分 留 存 於 胞 內, 一 部 分 則 滲 透 至 胞 外, 但 胞 外 酵 素 活 性 可 維 持 較 長 的 時 間 因 此 添 加 sorbitol 和 betaine 能 使 具 pro-sequence 之 納 豆 激 酶 正 確 摺 疊 而 展 現 活 性 4.3 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 lactose 作 為 誘 導 劑 時 之 酵 素 活 性 表 現 如 同 上 述 培 養, 將 培 養 液 置 換 成 含 有 1M sorbitol 和 2.5 mm betaine 的 TB 後, 分 別 改 以 加 入 6 8 及 10 mm lactose 進 行 誘 導, 則 結 果 如 表 2 和 圖 3 所 示 在 相 同 誘 導 劑 條 件 下, 胞 內 活 性 接 較 胞 外 活 性 為 高, 而 且 胞 內 活 性 高 峰 明 顯 較 胞 外 出 現 得 早 6 mm 及 8 mm IPTG 誘 導 後 45 小 時 測 得 較 高 之 胞 外 酵 素 活 性 皆 為 1.2 U/ml,10 mm lactose 誘 導 後 16 小 時 的 胞 外 酵 素 最 佳 活 性 則 為 1.3 U/ml; 胞 內 酵 素 活 性 最 高 均 為 誘 導 後 8 小 時,6 8 及 10 mm lactose 誘 21

32 導 最 佳 活 性 分 別 為 及 1.8 U/ml; 誘 導 後 45 小 時, 生 長 仍 持 續 增 加 比 較 胞 外 與 胞 內 酵 素 活 性, 發 現 胞 內 酵 素 活 性 於 誘 導 後 45 小 時 僅 剩 微 量, 但 胞 外 活 性 卻 仍 持 續 上 昇 而 菌 液 的 生 長 則 於 誘 導 後 4 小 時 達 高 峰 後 逐 漸 下 降 又 於 16 小 時 後 逐 漸 上 昇 4.4 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 為 培 養 液 並 以 lactose 與 IPTG 共 同 誘 導 時 之 酵 素 活 性 表 現 將 誘 導 劑 再 分 別 改 為 10 mm lactose, 搭 配 或 1 mm IPTG 的 混 合 誘 導 劑, 結 果 如 圖 4 和 表 3 所 示 在 相 同 培 養 誘 導 條 件 下, 胞 內 活 性 與 胞 外 活 性 表 現 高 峰 相 似, 但 胞 外 活 性 高 峰 較 胞 內 出 現 的 較 晚, 且 高 峰 持 續 時 間 較 長 10 mm lactose 另 加 或 1 mm IPTG 誘 導 後, 於 20 小 時 後 的 胞 外 酵 素 最 佳 活 性 分 別 為 和 3.2 U/ml; 胞 內 酵 素 最 高 活 性 則 依 次 均 為 誘 導 後 4 小 時 的 及 3.3 U/ml 而 其 生 長 則 皆 於 誘 導 後 24 小 時 達 到 高 峰 22

33 第 五 章 結 論 1. 以 TB 培 養 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli, 於 本 研 究 所 嘗 試 的 條 件 下, 不 論 胞 外 或 胞 內 皆 未 檢 測 得 酵 素 活 性 若 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 時 便 會 產 生 酵 素 活 性 2. 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 培 養 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli, 並 以 或 1 mm IPTG 分 別 誘 導 時, 以 1 mm IPTG 誘 導 的 胞 外 活 性 3.2 U/ml 較 高, 而 胞 內 活 性 以 0.1 mm IPTG 誘 導 所 得 的 4.7 U/ml 較 高 但 整 體 而 言, 以 1/10 或 1/20 濃 度 IPTG 誘 導 時, 胞 外 活 性 雖 有 15 % 及 25 % 之 差 異, 但 胞 內 活 性 並 無 顯 著 差 異 3. 以 含 有 sorbitol 和 betaine 的 TB 培 養 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli, 但 改 以 mm lactose 誘 導 時, 胞 外 和 胞 內 活 性 皆 以 10 mm lactose 誘 導 時 較 高, 分 別 為 1.3 和 1.8 U/ml, 較 以 IPTG 為 誘 導 劑 時 為 低, 不 及 其 二 分 之 一 4. 同 樣 的 TB 培 養 帶 有 ppronat 的 重 組 E. coli, 但 同 時 以 10 mm lactose 和 不 同 濃 度 IPTG 進 行 誘 導 時, 最 佳 胞 外 和 胞 內 活 性 出 現 於 以 10 mm lactose 和 mm IPTG ( 最 低 組 合 測 試 IPTG 濃 度 ) 的 誘 導, 分 別 為 3.4 和 3.5 U/ml 5. 本 研 究 檢 視 單 獨 以 lactose 或 以 lactose 和 IPTG 共 同 誘 導 E. coli strain 23

34 BL21(DE3) 表 現 納 豆 激 酶, 是 否 可 進 一 步 提 升 蛋 白 表 現 量, 若 能 產 生 與 IPTG 單 獨 誘 導 時 相 似 之 活 性, 便 能 以 較 低 之 成 本 生 產, 提 高 產 能 結 果 顯 示 : 若 單 獨 以 lactose 誘 導, 並 無 法 使 重 組 納 豆 激 酶 活 性 提 升 ; 若 以 IPTG 加 lactose 共 同 誘 導, 雖 可 獲 得 較 佳 之 胞 外 活 性, 但 胞 內 活 性 卻 降 低 ; 因 此 仍 以 IPTG 的 誘 導 可 有 較 佳 表 現 量 24

35 第 六 章 圖 與 表 a 表 1. 以 IPTG 誘 導 時 的 納 豆 激 酶 活 性 比 較 IPTG, mm caseinolytic activity, U/ml a extracellular intracellular ± ± ± ± ± ± 0.03 a 所 列 數 據 為 該 培 養 條 件 下, 所 測 得 最 高 之 納 豆 激 酶 caseinolytic activity a 表 2. 以 lactose 誘 導 時 的 納 豆 激 酶 活 性 比 較 Lactose, mm caseinolytic activity, U/ml a extracellular intracellular 6 1.2± ± ± ± ± ± 0.06 a 所 列 數 據 為 該 培 養 條 件 下, 所 測 得 最 高 之 納 豆 激 酶 caseinolytic activity 25

36 a 表 3. 以 lactose 加 入 不 同 濃 度 IPTG 誘 導 的 納 豆 激 酶 活 性 比 較 Lactose/IPTG, mm caseinolytic activity, U/ml a extracellular intracellular 10/ ± ± / ± ± /1 3.2± ± 0.38 a 所 列 數 據 為 該 培 養 條 件 下, 所 測 得 最 高 之 納 豆 激 酶 caseinolytic activity 26

37 圖 1. pet26b 之 基 因 圖 譜 引 自 /docs/docs/prot/tb071.pdf 27

38 (a) Extracellular activity (U/ml) Time after induction (h) (b) 5 4 Intracellular activity (U/ml) Time after induction (h) 28

39 (c) OD 600) Time after induction (h) 圖 2. 以 IPTG 誘 導 的 納 豆 激 酶 表 現 和 菌 體 生 長 情 形 表 現 添 加 誘 導 劑 濃 度 分 別 為 0.05 ( ) 0.1 ( ) 及 1 mm IPTG ( ) 於 不 同 時 間 點 收 集 菌 液, 經 離 心 分 離 培 養 液 和 菌 體 後, 分 別 檢 測 培 養 液 胞 外 (a) 和 菌 體 胞 內 (b) 活 性 及 生 長 情 形 (c) 29

40 (a) Extracellular activity (U/ml) Time after induction (h) (b) Intracellular activity (U/ml) Time after induction (h) 30

41 (c) OD 600) Time after induction (h) 圖 3. 以 lactose 誘 導 的 納 豆 激 酶 表 現 和 菌 體 生 長 情 形 表 現 添 加 誘 導 劑 濃 度 分 別 為 6 ( ) 8 ( ) 及 10 mm lactose ( ) 於 不 同 時 間 點 收 集 菌 液, 經 離 心 分 離 菌 體 和 培 養 液 後, 分 別 檢 測 胞 外 (a) 和 胞 內 (b) 活 性 及 生 長 情 形 (c) 31

42 (a) 4 Extracellular activity (U/ml) (b) Time after induction (h) 4 Intracellular activity (U/ml) Time after induction (h) 32

43 (c) OD 600) Time after induction (h) 圖 4. 以 10 mm lactose 添 加 不 同 濃 度 IPTG 誘 導 的 納 豆 激 酶 表 現 和 菌 體 生 長 情 形 IPTG 添 加 濃 度 分 別 為 ( ) 0.25 ( ) 及 1 mm ( ) 於 不 同 時 間 點 收 集 菌 液, 經 離 心 分 離 菌 體 和 培 養 液 後, 分 別 檢 測 胞 外 (a) 和 胞 內 (b) 活 性 及 生 長 情 形 (c) 33

44 參 考 文 獻 林 峰 毅 2006 以 大 腸 桿 菌 異 源 表 現 納 豆 激 酶 大 同 大 學 生 物 工 程 學 研 究 所 碩 士 論 文 Cesarone, M. R., G. Belcaro, A. N. Nicolaides, A. Ricci, G. Geroulakos, E. Ippolito, R. Brandolini, G. Vinciguerra, M. Dugall, M. Griffin, I. Ruffini, G. Acerbi, M. Corsi, N.H. Riordan, S. Stuard, P. Bavera, D. A. Renzo, J. Kenyon and B. M. Errichi, Prevention of Venous Thrombosis in Long-Haul Flights with Flite Tabs: the LONFLIT-FLITE Randomized, Controlled Trial. Angiology. 54: Chang, Y.-Y., J.-S. Liu, S.-L. Lai, H.-S. Wu and M.-Y. Lan, Cerebellar Hemorrhage Provoked by Combined Use of Nattokinase and Aspirin in a Patient with Cerebral Microbleeds. Inter Med. 47: Christina, W., K. Michel, J. M. Bard, C.Murielle and B. Doris, Cholesterol Lowering Effect of a Soy Drink Enriched with Plant Sterols in a French Population with Moderate Hypercholesterolemia. Lipids Health Dis. 7: 1-8. Fujita, M., K. Nomura, K. Hong, Y. Ito, A. Asada, S. Nishimuro, Purification and Characterization of a Strong Fibrinolytic Enzyme (Nattokinase) in the Vegetable Cheese Natto, a Popular Soybean-Fermented Food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Commum. 197: Hauschka, P.V., M. L. Reid, Vitamin K Dependence of a Calcium-Binding Protein Containing Gamma-Carboxy-Glutamic Acid in 34

45 Chicken Bone. J.Biol. Chem.130: Homma, K., N. Wakana, Y. Suzuki, M. Nukui, T. Daimatsu, E. Tanaka, K. Tanaka, Y. Koga, Y. Nakajima and H. Nakazawa, Treatment of Natto, a Fermented Soybean Preparation, to Prevent Excessive Plasma Vitamin K Concentrations in Patients Taking Warfarin. J Nutr Sci Vitaminol. 52: Imai, S., H. Kozai, Y. Naruse, K. Watanabo, M. Fukui, G. Hasegawa, H. Obayashi, N. Nakamura, Y. Naito, T. Yoshikawa and S. Kajiyama, RandomizedeControlled Trial of Two Forms of Self-Management Group Education in Japanese People with Impaired Glucose Tolerance. J. Clin. Biochem. Nutr. 43: Kada, S., M. Yabusaki, T. Kaga, H. Ashida and K. Yoshida, Identification of Two Major Ammonia-Releasing Reactions Involved in Secondary Natto Fermentation. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72: Kanazawa, T., T. Osanai, X.-S. Zhang, T. Uemura, X.-Z. Yin, K. Onodera, Y. Oike and K. Ohkubo, Protective Effects of Soy Protein on the Peroxidizability of Lipoproteins in Cerebrovascular Diseases. J. Nutr. 639S-646S. Katsuyama, H, S. Ideguchi, M. Fukunaga, T. Fukunaga, K. Saijoh and S. Sunami, Promotion of Bone Formation by Fermented Soybean (Natto) Intake in Premenopausal Women. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 50: Kim, J. Y., S. N. Gum, J. K. Paik, H. H. Lim, K.-C. Kim, K. Ogasawara, K. Inoue, S. Park, Y. Jang and J. H. Lee, Effects of Nattokinase on Blood 35

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