2014年中文第9期

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1 半 滑 舌 鳎 促 黄 体 激 素 基 因 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 血 清 浓 度 测 定 柳 学 周, 史 宝, 王 珊 珊, 徐 永 江, 李 晓 晓 ( 中 国 水 产 科 学 研 究 院 黄 海 水 产 研 究 所, 农 业 部 海 洋 渔 业 可 持 续 发 展 重 点 实 验 室, 青 岛 市 海 水 鱼 类 种 子 工 程 与 生 物 技 术 重 点 实 验 室, 山 东 青 岛 ) [ 摘 要 ] 利 用 RACE 技 术 首 次 克 隆 了 半 滑 舌 鳎 脑 垂 体 中 促 黄 体 激 素 (LH) 基 因 cdna 全 长 序 列 该 基 因 全 长 670 bp, 开 放 阅 读 框 为 477 bp, 编 码 158 个 氨 基 酸 与 其 他 脊 椎 动 物 的 LH 成 熟 肽 氨 基 酸 序 列 同 源 性 比 较 表 明 : 半 滑 舌 鳎 LH 与 鲽 形 目 和 鲈 形 目 同 源 性 高 58 %~68 % 另 外, 半 滑 舌 鳎 LH 含 有 12 个 保 守 的 半 胱 氨 酸 残 基 和 1 个 N- 糖 基 化 位 点 (19~21 NQT) 实 时 荧 光 定 量 组 织 表 达 分 析 表 明,LH mrna 在 脑 垂 体 卵 巢 等 组 织 中 表 达, 垂 体 中 表 达 量 最 丰 富, 其 他 组 织 尤 以 脑 性 腺 表 达 量 较 高, 推 测 半 滑 舌 鳎 LH 可 能 具 有 广 泛 的 垂 体 外 生 理 功 能 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR 方 法 对 繁 殖 周 期 雌 性 半 滑 舌 鳎 LH 表 达 水 平 进 行 测 定, 结 果 表 明, LH mrna 在 Ⅱ~Ⅵ 各 繁 殖 周 期 的 脑 垂 体 卵 巢 3 种 组 织 都 有 表 达, 但 表 达 水 平 有 差 异, 在 Ⅳ Ⅴ 期 表 达 量 125 最 丰 富, 说 明 LH 主 要 促 进 卵 母 细 胞 最 终 成 熟 及 排 卵 利 用 I 标 记 的 放 射 免 疫 测 定 (RIA) 技 术 检 测 繁 殖 周 期 半 滑 舌 鳎 血 清 LH 浓 度, 结 果 表 明 LH 在 Ⅴ 期 含 量 最 丰 富, 也 说 明 LH 主 要 促 进 卵 母 细 胞 最 终 成 熟 及 排 卵 [ 关 键 词 ] 半 滑 舌 鳎 ; 促 黄 体 激 素 (LH);cDNA 克 隆 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR; 放 射 免 疫 测 定 [ 中 图 分 类 号 ] S96 [ 文 献 标 识 码 ] A [ 文 章 编 号 ] (2014) 前 言 脊 椎 动 物 生 殖 活 动 主 要 受 下 丘 脑 脑 垂 体 性 腺 轴 (HPG)3 个 不 同 层 次 的 内 分 泌 系 统 调 控 促 性 腺 激 素 (GTH) 是 由 垂 体 合 成 和 分 泌 的 一 类 糖 蛋 白 激 素, 在 鱼 类 的 性 腺 发 育 性 类 固 醇 及 多 肽 类 激 素 调 控 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用 脑 垂 体 GTH 包 括 促 滤 泡 激 素 (FSH) 和 促 黄 体 激 素 (LH), 它 们 是 异 源 二 聚 体, 都 是 由 α 和 β 亚 基 以 非 共 价 键 相 连 组 成 的 二 聚 体 结 构, 其 中 α 亚 基 氨 基 酸 组 成 相 同, 而 β 亚 基 明 显 不 同, 具 有 特 异 的 生 物 学 作 用 通 过 对 大 马 哈 鱼 (Oncorhynchus keta)gth 生 物 学 功 能 的 研 究, 发 现 两 种 GTH 在 表 达 模 式 及 生 殖 周 [1] 期 不 同 发 育 阶 段 的 水 平 有 所 不 同 生 理 学 研 究 表 [2~4] 明,LH 主 要 调 控 性 腺 成 熟 及 排 精 / 排 卵 LH 由 脑 垂 体 前 叶 细 胞 分 泌, 通 过 血 液 循 环 到 达 性 腺 及 其 他 组 织, 鱼 类 LH 相 应 生 物 学 功 能 及 水 平 的 变 化 规 律 已 有 报 道 用 放 射 免 疫 法 测 定 虹 鳟 鱼 (Oncorhynchus mykiss) [5] 的 GTH, 发 现 LH 在 排 精 及 卵 母 细 胞 最 终 成 熟 和 排 卵 时 大 量 分 泌 并 达 到 最 高 峰, 促 使 卵 母 细 胞 和 精 子 最 终 成 熟 并 刺 激 排 卵 排 精 半 滑 舌 鳎 (Cynoglossus semilaevis Günther) 是 [6] 重 要 的 海 水 养 殖 经 济 鱼 类, 属 秋 季 产 卵 型 鱼 类, 自 然 繁 殖 季 节 为 9 10 月 份, 卵 巢 内 卵 母 细 胞 发 育 不 [7] 同 步, 是 分 批 成 熟 多 次 产 卵 类 型 鱼 类 近 年 来, 半 滑 舌 鳎 生 殖 调 控 及 规 模 化 人 工 繁 育 技 术 的 研 究 获 [ 收 稿 日 期 ] [ 基 金 项 目 ] 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金 (CARS-50); 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 ( ); 国 家 国 际 科 技 合 作 专 项 项 目 (2013DFA31410); 山 东 省 优 秀 中 青 年 科 学 家 科 研 奖 励 基 金 项 目 (BS2013SW042);2012 年 度 留 学 人 员 科 技 活 动 项 目 择 优 资 助 经 费 资 助 [ 作 者 简 介 ] 柳 学 周,1959 年 出 生, 男, 山 东 青 岛 市 人, 研 究 员, 主 要 从 事 海 水 鱼 类 繁 育 理 论 与 增 养 殖 技 术 研 究 工 作 ; liuxz@ysfri.ac.cn 50 中 国 工 程 科 学

2 得 重 大 突 破 [8] 目 前, 国 内 外 多 种 硬 骨 鱼 类 的 LH cdna 序 列 已 成 功 克 隆, 包 括 鲤 形 目 [9] 鲈 形 目 [10] 鳗 [11] [12] 鲡 目 和 鲑 形 目 等, 但 关 于 半 滑 舌 鳎 LH 的 研 究 尚 未 见 报 道 本 文 应 用 分 子 生 物 学 和 碘 ( 125 I) 放 射 免 疫 分 析 法 (RIA), 克 隆 得 到 半 滑 舌 鳎 LH 的 全 长 cd- NA 序 列, 对 其 mrna 组 织 表 达 及 繁 殖 周 期 表 达 特 征 进 行 分 析, 并 检 测 血 浆 LH 在 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期 的 变 化 规 律, 揭 示 其 可 能 的 生 理 功 能, 以 期 为 鱼 类 促 性 腺 激 素 及 生 殖 内 分 泌 调 控 的 研 究 提 供 科 学 依 据, 为 提 高 半 滑 舌 鳎 全 人 工 育 苗 和 转 季 节 育 苗 的 生 殖 调 控 效 率 提 供 理 论 参 考 2 材 料 与 方 法 2.1 实 验 材 料 实 验 用 半 滑 舌 鳎 于 2011 年 6 月 2012 年 1 月 采 自 青 岛 忠 海 水 产 有 限 公 司 实 验 鱼 为 野 生 亲 鱼 自 然 产 卵 后, 人 工 育 苗 得 到 的 健 康 苗 种, 经 室 内 人 工 养 成 达 到 性 成 熟 年 龄 的 F1 代 亲 鱼 研 究 用 15 尾 雌 性 亲 鱼 全 长 53~66 cm, 体 重 ~ g 亲 鱼 培 育 条 件 : 全 年 开 放 流 水 培 育, 人 工 调 控 亲 鱼 发 育 及 产 卵 过 程, 产 卵 前 2 个 月 左 右 进 行 亲 鱼 强 化 培 育 水 温 由 20 逐 渐 提 高 到 25, 并 使 用 遮 光 幕 和 白 炽 灯 进 行 光 照 强 度 和 光 照 节 律 的 调 节, 控 制 光 强 200~300 lx, 光 照 时 间 由 8 h/d 逐 渐 增 加 到 12 h/d [13] 将 半 滑 舌 鳎 各 组 织 样 品 取 出, 迅 速 于 液 氮 中 冻 存, 并 转 入 -80 冰 箱 保 存 备 用, 取 样 操 作 要 避 免 各 样 品 间 的 交 叉 污 染 Davidedsons 液 固 定 卵 巢 组 织 用 于 组 织 学 观 察 2.2 药 品 和 试 剂 RNA 提 取 试 剂 RNAiso Plus Taq 酶 DNaseⅠ (RNasefree) RNasin SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ 试 剂 盒 购 自 TaKaRa 公 司,SMART TM RACE cdna 扩 增 试 剂 盒 Advantage 2 PCR 试 剂 盒 购 自 Clontech 公 司,E.Z.N.A Gel Extraction Kit 普 通 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒 购 自 OMEGA 公 司,pEASY-T1 载 体 Trans1-T1 Phage Resistant 感 受 态 细 胞 购 自 全 式 金 公 司, 其 余 均 为 国 产 分 析 纯 所 有 PCR 引 物 由 TaKa- Ra 公 司 合 成, 序 列 由 北 京 华 大 基 因 公 司 测 定 血 浆 中 LH 含 量 的 测 定, 试 剂 盒 Iodine[ 125 I]- LH RIA Kit 购 自 天 津 九 鼎 医 学 生 物 工 程 有 限 公 司 2.3 卵 巢 组 织 学 分 析 卵 巢 组 织 经 常 规 梯 度 乙 醇 脱 水 后, 二 甲 苯 透 明, 石 蜡 包 埋 LEICA RM 2235 型 切 片 机 ( 德 国 ) 切 片, 厚 度 为 5~7 μm,h.e 染 色, 中 性 树 胶 封 片,LEI- CA DW4000B 型 显 微 镜 ( 德 国 ) 下 观 察 及 显 微 摄 影 参 考 半 滑 舌 鳎 卵 巢 发 育 组 织 学 研 究 中 的 分 类 [14] 标 准, 确 定 卵 巢 发 育 情 况 2.4 总 RNA 的 提 取 和 cdna 的 合 成 取 -80 保 存 的 半 滑 舌 鳎 各 组 织 : 脑 垂 体 鳃 心 头 肾 肾 肝 脾 胃 肠 卵 巢 肌 肉 各 50~ 100 mg, 用 RNAiso Plus 抽 提 总 RNA, 通 过 1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 RNA 完 整 性, 采 用 Nanodrop2000 ( 美 国 Thermo 公 司 ) 测 定 总 RNA 浓 度 各 组 织 RNA 经 反 转 录 合 成 cdna 第 一 链, 于 -20 保 存 备 用 2.5 半 滑 舌 鳎 LH 基 因 克 隆 -20 保 存 的 cdna 作 为 PCR 模 板, 通 过 RT- PCR 反 应 获 得 半 滑 舌 鳎 LH 基 因 的 保 守 片 段, 所 用 引 物 为 LHF 和 LHR PCR 产 物 经 2 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 后, 切 下 目 的 条 带, 使 用 E.Z.N.A Gel Extraction Kit 回 收 纯 化 PCR 产 物 ( 操 作 步 骤 严 格 按 照 OMEGA 公 司 胶 回 收 试 剂 盒 说 明 书 ) 回 收 产 物 与 peasy-t1 克 隆 载 体 连 接, 重 组 子 转 化 至 Trans1-T1 Phage Resistant 感 受 态 细 胞, 在 含 氨 苄 青 霉 素 的 LB 平 板 上 37 培 养 过 夜, 挑 取 阳 性 克 隆 送 至 北 京 华 大 公 司 测 序 根 据 扩 增 得 到 的 序 列 设 计 特 异 性 引 物 LHG- SP1 LHNGSP1(5 RACE) 和 LHGSP2(3 RACE), 应 用 SMART TM RACE cdna 扩 增 试 剂 盒 克 隆 半 滑 舌 鳎 LH cdna 全 长 提 取 新 鲜 垂 体 组 织 总 RNA, 用 于 5 -RACE 及 3 -RACE cdna 第 一 链 合 成, 合 成 的 cdna 第 一 链 分 别 用 Advantage 2 PCR 试 剂 盒 (Clontech 公 司 ) 进 行 PCR 扩 增 PCR 反 应 体 系 25 μl, 反 应 条 件 为 s,68 30 s,72 2 min, 共 25 个 循 环 取 5 μl 产 物 于 1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后, 再 次 对 目 的 条 带 进 行 回 收 与 载 体 连 接 转 化 筛 选 阳 性 克 隆 并 测 序 实 验 中 所 用 的 引 物 见 表 序 列 分 析 Dnastar 软 件 分 析 蛋 白 分 子 量 和 等 电 点 ; 所 得 序 列 在 NCBI 数 据 库 中 进 行 BLAST 比 对, 分 析 半 滑 舌 鳎 LH 与 其 他 物 种 的 LH 同 源 性 高 低 ; 从 GenBank 中 选 择 脊 椎 动 物 哺 乳 纲 和 鱼 纲 的 物 种 的 LH 序 列, 鱼 纲 分 类 到 目, 具 体 见 表 2 这 些 序 列 用 于 同 源 性 比 2014 年 第 16 卷 第 9 期 51

3 引 物 名 称 LHF LHR LHGSP1 LHNGSP1 LHGSP2 LHF1 LHR1 18S F 18S R Table 1 表 1 实 验 所 用 引 物 及 其 序 列 Sequences of the primers used for the PCR analysis 引 物 序 列 (5 3 ) 5 - CCATYTGCAGCGGYCAC GCAGCTCAMAGCCACMGG GCTCAAAGCCACAGGGTACGTGATGGTG GGGGCAGTCGGGGAGTTCAAATGTCT AAGATGCCGTCGTTTCAGTCACCCTTCA-3 5 -AGACGGTGTCTCTGGAGAAAGAAG-3 5 -ACGGCACCTTGATGTTTGGT-3 5 -GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC-3 5 -AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC-3 较 及 进 化 树 构 建 运 用 Clustal X2 进 行 多 重 序 列 比 对 ; 系 统 进 化 树 构 建 使 用 MEGA4.0 软 件 中 Neighbor-joining 法 ( 自 展 值 为 1 000) 2.7 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 mrna 组 织 及 周 期 表 达 差 异 根 据 克 隆 得 到 的 半 滑 舌 鳎 LH cdna 的 序 列, 设 计 并 合 成 引 物 LHF1 和 LHR1, 同 时 合 成 18S F 和 18S R 作 为 内 参 引 物 对 繁 殖 周 期 半 滑 舌 鳎 表 达 分 析, 每 个 发 育 阶 段 分 别 取 3 条 半 滑 舌 鳎, 并 且 每 个 实 验 鱼 设 定 3 个 平 行 取 半 滑 舌 鳎 组 织, 合 成 cdna 第 一 链, 应 用 实 时 定 量 PCR(qRT-PCR) 方 法 检 测 LH mrna 在 不 同 组 织 及 繁 殖 周 期 的 相 对 表 达 量 反 应 体 系 参 考 SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ( 宝 生 物 工 程 ( 大 连 ) 有 限 公 司 ) 试 剂 盒 说 明 书, 使 用 2-Step 法, 反 应 条 件 为 :95 预 变 性 30 s,95 预 变 性 5 s,60 预 变 性 22 s, 共 40 个 循 环 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 在 Eppendorf 公 司 的 Mastercycler ep realplex 上 进 行, 并 收 集 反 应 信 息 程 序 运 行 完 成 后 进 行 熔 解 曲 线 分 析 以 确 定 引 物 及 反 应 是 否 正 常 为 保 证 结 果 的 可 靠 性, 进 行 三 次 平 行 试 验 所 得 数 据 采 用 SPSS(13.0) 统 计 进 行 单 因 素 方 差 分 析 (one-way ANOVA) 和 Duncan s 多 重 比 较 分 析,P<0.05 表 示 差 异 显 著 最 后 依 据 2 Ct 方 [15] 法, 制 作 出 mrna 相 对 表 达 量 的 关 系 图 表 分 类 硬 骨 鱼 纲 鲽 形 目 鲈 形 目 银 汉 鱼 目 鲤 形 目 鲇 形 目 鲑 形 目 鳗 鲡 目 鲟 形 目 刺 鱼 目 哺 乳 纲 Table2 表 2 同 源 性 比 较 及 进 化 树 中 引 用 的 基 因 序 列 号 Genbank accession number of genes used for homologue and phylogenesis analysis 种 名 半 滑 舌 鳎 (Tongue sole) 塞 内 加 尔 鳎 (Senegalese sole) 庸 鲽 (Atlantic halibut) 牙 鲆 (Japanese flounder) 狼 鲈 (European seabass) 斜 带 石 斑 鱼 (Orange-spotted grouper 鳢 鱼 (Blotched snakehead) 真 鲷 (Red seabream) 尼 罗 罗 非 鱼 (Nile tilapia) 银 汉 鱼 (Pejerrey) 斑 马 鱼 (Zebrafish) 金 鱼 (Goldfish) 鲤 鱼 (Common carp) 斑 点 叉 尾 鮰 (Channel catfish) 革 胡 子 鲶 (North African catfish) 虹 鳟 (Rainbow trout) 马 苏 大 马 哈 鱼 (Cherry salmon) 细 鳞 鲑 (Lenok) 大 马 哈 鱼 (Chum salmon) 香 鱼 (Sweetfish) 欧 洲 鳗 鲡 (European eel) 日 本 鳗 鲡 (Japanese eel) 星 康 吉 鳗 (Whitespotted conger) 西 伯 利 亚 鲟 (Siberian sturgeon) 三 刺 鱼 (Three-spined stickleback) 人 类 (Human) 学 名 Cynoglossus semilaevis Solea senegalensis Hippoglossus hippoglossus Paralichthys olivaceus Dicentrarchus labrax Epinephelus coioides Channa maculate Pagrus major Oreochromis niloticus Odontesthes bonariensis Danio rerio Carassius auratus Cyprinus carpio Ictalurus punctatus Clarias gariepinu Oncorhynchus mykiss Oncorhynchus masou Brachymystax lenok Oncorhynchus keta Plecoglossus altivelis Anguilla anguilla Anguilla japonica Conger myriaster Acipenser baerii Gasterosteus aculeatus Homo sapiens 序 列 号 AFF59207 ABW81404 CAD10502 BAB47388 AAN40507 AAM28896 AAS01609 BAB18564 AAP49576 AAP85607 AAV31153 Q98849 P01235 Q9DG80 P53543 BAB17687 P48253 AAR99811 P10256 AAM92270 P27767 BAD14302 BAB97391 CAB93502 CAD59185 NP_ 中 国 工 程 科 学

4 2.8 血浆 LH 繁殖周期浓度测定 实验用鱼同 2.1 节实验材料 即在每次取样时 3 结果 都对 半 滑 舌 鳎 进 行 抽 血 r/min 4 离 心 3.1 用碘 I RIA 法测定血浆中 LH 含量 先制作标准 LHR 获得长度为 197 bp 的保守片段 经 RACE 反 曲线 当相关系数 R 接近于 1 时 曲线理想 如图 1 所 应后克隆测序 将 5 -RACE 和 3 -RACE 所得片段 示 然后 每个样品双管平行上样于 FJ-2008PS γ放 与所获得保守序列拼接得到 LH 基因 cdna 全长 其 射免疫计数器进行检测 样品间再设两个平行 实 长度为 670 bp 开放阅读框为 477 bp 编码 158 个氨 验数据表示为平均数±标准差 Mean±SD 使用 基酸 其分子量为 18 kd 等电点为 5.9 第 1 到第 25 SPSS16.0 软件进行显著性检验分析 个氨基酸为信号肽 成熟肽序列包含 12 个保守的半 10 min 吸取上清液 血清于-20 保存备用 采 125 LH 序列分析 通过实时荧光定量 PCR 方法 使用引物 LHF 和 胱氨酸残基 Cys 且此序列 3 端非编码区含有一 个加尾信号 AATAAA 见图 2 该序列已提交至 GenBank 序列号 JQ 图 3 为半滑舌鳎 LH 氨基酸与其他物种的比较 3.2 LH 氨基酸序列比对及同源性分析 半滑舌鳎 LH 成熟肽与鲽形目鱼类 LH 成熟肽 的 相 似 性 分 别 为 塞 内 加 尔 鳎 Solea senegalensis 血浆 LH 测定标准曲线 R= % 庸鲽 Hippoglossus hippoglossus 69 %和牙鲆 The determination standand curve of plasma LH Paralichthys olivaceus 67 % 半滑舌鳎 LH 成熟肽 图1 Fig. 1 R= 图2 Fig. 2 半滑舌鳎 LH 全长以及推断的氨基酸序列分析 cdna sequence and putative amino acid sequence of the LH of C.semilaevis 注 起始密码子 ATG 和终止密码子 TGA 以黑框表示 *表示终止密码子 加尾信号以下划线标出 黑体为 Cys 2014 年第 16 卷第 9 期 53

5 图3 半滑舌鳎 LH 氨基酸与其他物种 LH 氨基酸序列的比较 Fig. 3 Alignment amino acid of C.semilaevis LH with other species 注 灰色阴影代表半胱氨酸残基位点 黑色阴影代表 N-糖基化位点 与鲈形目鱼类 LH 成熟肽的相似性分别为斜带石斑 与哺乳类和鸟类等亲缘关系较远 不同物种 LH 氨 鱼 Epinephelus coioides 74 % 真鲷 Pagrus major 基酸序列比较发现 半滑舌鳎 LH 与鲽形目和鲈形 74 % 和 尼 罗 罗 非 鱼 Oreochromis niloticus 73 % 目的 LH 相似性 58 % 68 % 比鲑形目 48 % 半滑舌鳎 LH 成熟肽与鲤形目鱼类 LH 成熟肽的相 50 % 鲤形目 47 % 51 % 鳗鲡目 47 % 鲇形 似性分别为金鱼 Carassius auratus 58 %和斑马鱼 目 48 % 和高等脊椎动物人类 34 % LH 同源性 Danio rerio 54 % 高 但是半滑舌鳎 LH 与鲽形目中的其他鱼类 LH 半滑舌鳎的 LH 成熟肽与其他硬骨鱼类和人类 同源性相对低 58 % 64 % 与鲈形目 LH 同源性 的 LH 进行多序列比对时发现 半滑舌鳎 LH 氨基酸 较接近 64 % 68 % 这可能是导致鲽形目 LH 不 具有糖蛋白激素保守的 12 个半胱氨酸残基 在半 能聚为一簇的原因 滑舌鳎的 LH 成熟肽的氨基酸序列中 发现了一个 3.4 N-糖基化位点 NQT 该糖基化位点在大多 LH mrna 在不同组织的表达分析 采用实时荧光定量 PCR 法 检测 LH 在半滑舌 数硬骨鱼类是保守的 在半滑舌鳎成熟肽序列中 鳎的脑 垂体 鳃 心 头肾 肾 肝脏 脾脏 胃 肠 存在与其他动物高度保守的特征基序如 LH 的第 4 卵巢 肌肉 12 种组织中的表达 结果如图 5 所示 个半胱氨酸残基位点和第 5 个半胱氨酸残基位点之 LH 在所有组织中都有表达 在垂体相对表达量最 间存在着硬骨鱼类特异性的 Cys-Ser-Gly-His CS- 高 在脑和卵巢中表达量相对较丰富 分别比垂体 GH 区域 低约 倍和 倍 另外 在鳃 心 头肾 3.3 LH 系统进化分析 肾 肝 脏 脾 脏 胃 肠 肌 肉 这 9 个 组 织 中 LH 通过 MEGA4.0 软件 Neighbor-Joining 法构建 mrna 虽然表达量非常小 但仍可检测到表达 单 NJ 系统进化树 见图 4 置信度检验 次 获得 因素方差分析结果显示 LH mrna 在垂体的表达 的进化树表明硬骨鱼类 LH 聚类 亲缘关系较近 而 与其他组织中的表达量差异显著 P< 中国工程科学

6 图4 基于 MEGA4.0 中的 NJ 方法的半滑舌鳎 LH 与其他物种分子进化树聚类分析 Fig. 4 Phylogenetic tree of the LH from C.semilaevis and other vertebrates in MEGA4.0 注 所用物种的 GenBank 的序列号见表 2 胞为主 可见少量Ⅱ时相和Ⅲ时相卵母细胞 体积 3.5 半滑舌鳎组织学 显著增加 辐射带增厚 胞质内卵黄颗粒充满 偏嗜 对实验用鱼的卵巢进行组织切片和 H-E 染色 酸性 见图 6c Ⅴ期卵巢 以Ⅴ时相卵母细胞为 并进行半滑舌鳎卵巢发育分期 见图 6 Ⅱ期卵 主 体积继续增大 胞质中充满粗大的卵黄颗粒 并 巢 几乎全为Ⅱ时相卵母细胞 胞质嗜碱性 可见数 逐渐融合成块状 细胞核偏位 核膜逐渐模糊 见图 个核仁 见图 6a Ⅲ期卵巢 排列紧密 以Ⅲ时相 6d Ⅵ期卵巢 可见正在退化的卵母细胞 有少数 卵母细胞为主 也有Ⅱ时相卵母细胞存在 细胞体 积增大 呈规则的椭圆形 胞质嗜碱性 胞核内可 Ⅱ和Ⅲ时相的卵母细胞 放射膜厚 卵黄颗粒 胞核 模糊消失 可见闭锁空泡 见图 6e 见大量核仁 见图 6b Ⅳ期卵巢 以Ⅳ时相卵母细 图5 半滑舌鳎 LH mrna 在不同组织中的表达水平 Fig. 5 Expression level of LH mrna in different tissues of C.semilaevis tissues 注 不同字母表示差异显著 P 年第 16 卷第 9 期 55

7 3.6 LH mrna 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的表达 3 个组织中的表达水平 表明 LH mrna 在Ⅱ Ⅵ各 模式 繁殖周期的脑 垂体 卵巢 3 个组织都有表达 但表 采用实时荧光定量 PCR 方法检测雌性半滑舌 达水平有差异 具体结果见图 7 鳎 LH mrna 在繁殖周期Ⅱ Ⅵ期的脑 垂体 卵巢 图6 Fig. 6 半滑舌鳎卵巢不同发育时期的组织切片 The stained sections for each of ovarian development stage of C.semilaevis Günther 注 a Ⅱ期卵巢 箭头示Ⅱ时相卵母细胞 标尺=100 μm b Ⅲ期卵巢 箭头示Ⅲ时相卵母细胞 标尺=100 μm c Ⅳ期卵巢 箭头示Ⅳ时相 卵母细胞 标尺=200 μm d Ⅴ期卵巢 箭头示Ⅴ时相卵母细胞 标尺=200 μm e Ⅵ期卵巢 箭头示Ⅵ时相卵母细胞 标尺=200 μm 各繁殖周期脑组织的表达水平差异显著 P<0.05 垂体组织中 LH mrna 的表达水平在Ⅱ Ⅴ期稳 步上升 Ⅴ期达最高水平 Ⅵ期下降基本与Ⅱ期表 达 水 平 相 同 显 著 性 检 验 分 析 表 明 垂 体 LH mrna 在Ⅱ Ⅵ发育期的表达处于同一低水平 差 异不显著 P>0.05 并与Ⅲ Ⅳ Ⅴ发育期的高表达 水平差异显著 P<0.05 说明垂体组织的 LH 在性 LH mrna 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的表达水平 腺成熟及排卵时期 尤其Ⅴ期 水平高 而卵巢发育 Fig. 7 Expression level of LH mrna in reproductive 前期和排卵后水平较低 卵巢组织中 LH mrna cycles of female C.semilaevis 的表达水平在Ⅱ Ⅴ期逐渐上升 到Ⅴ期时达最高 图7 注 不同字母表示差异显著 P < 0.05 水平 Ⅵ期急剧下降 达最低值 显著性检验分析 表明 卵巢 LH mrna 各发育期的表达水平差异显 脑组织中 LH mrna 在Ⅱ Ⅴ期表达水平下 降 Ⅳ期急剧下降 到Ⅴ期时达最低水平 并明显低 于 其 他 发 育 期 水 平 Ⅵ 期 时 又 有 所 回 升 由 SPSS16.0 软件显著性检验分析得出 LH mrna 在 56 中国工程科学 著 P<0.05 推测卵巢 LH 主要对卵母细胞最终成 熟及卵子排出的卵巢起作用 Ⅴ期卵巢已完全成 熟 Ⅵ期卵巢退化 此时卵巢除含有很多退化的卵 母细胞外 一部分卵母细胞退化至Ⅱ Ⅳ时相 此时

8 卵 巢 LH 发 挥 相 对 较 弱 的 生 理 作 用 3.7 血 清 LH 在 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期 的 变 化 规 律 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期 血 清 LH 浓 度 变 化 呈 现 明 显 的 周 期 性 变 化 规 律, 即 呈 先 上 升 后 下 降 的 趋 势 Ⅱ 期 时 浓 度 最 低, 均 值 为 3.24 miu/ml; 之 后 上 升,Ⅴ 期 时 达 到 最 大 浓 度, 均 值 为 4.80 miu/ml, 说 明 LH 在 卵 巢 发 育 至 Ⅴ 期 ( 即 卵 母 细 胞 成 熟 及 排 卵 ) 时 发 挥 最 大 作 用,LH 主 要 参 与 卵 子 的 成 熟 及 排 放 过 程 ;Ⅵ 期 浓 度 明 显 下 降 (P<0.05), 均 值 只 有 3.55 miu/ml, 说 明 卵 母 细 胞 退 化 时 LH 作 用 有 所 减 弱 ; 但 浓 度 高 于 Ⅱ 期, 此 时 卵 巢 内 存 在 退 化 的 Ⅱ Ⅲ Ⅵ 时 相 卵 母 细 胞 ( 见 图 8) 图 8 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期 血 浆 LH 的 浓 度 Fig. 8 Concentration of plasma LH in reproductive cycles of female C.semilaevis 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期, 采 用 碘 ( 125 I)RIA 法 测 定 血 浆 LH 变 化 规 律 与 实 时 荧 光 定 量 PCR 方 法 检 测 到 的 LH mrna 水 平 在 垂 体 及 卵 巢 组 织 的 变 化 规 律 基 本 一 致 4 讨 论 4.1 半 滑 舌 鳎 LH 基 因 克 隆 及 序 列 分 析 本 实 验 克 隆 了 半 滑 舌 鳎 LH cdna 的 全 长 序 列, 并 对 半 滑 舌 鳎 的 LH 与 其 他 脊 椎 动 物 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 进 行 比 较, 结 果 显 示 半 滑 舌 鳎 LH 同 鲽 形 目 鲈 形 目 的 LH 相 似 性 较 高, 而 同 哺 乳 动 物 LH 的 相 似 性 相 对 低 半 滑 舌 鳎 LH 成 熟 肽 序 列 包 含 12 个 半 胱 氨 酸 残 基 Cys, 与 所 比 对 的 各 物 种 中 完 全 保 守 ( 见 图 4), 并 与 GTHα 亚 基 交 联 形 成 二 硫 键, 参 与 蛋 白 折 [16] 叠 及 配 体 受 体 相 互 作 用, 因 此, 硬 骨 鱼 类 LH 结 构 的 变 化 会 影 响 到 与 受 体 结 合 能 力 及 异 源 二 聚 体 的 稳 定 性 四 足 类 及 硬 骨 鱼 类 的 LHβ 存 在 与 GTHα 结 合 相 关 的 某 些 重 要 的 氨 基 酸 残 基, 比 如 一 些 硬 骨 鱼 类 第 4 个 和 第 5 个 Cys 位 点 之 间 就 存 在 着 特 异 性 的 [17] Cys-Ser-Gly-His(CSGH) 区 域, 半 滑 舌 鳎 的 这 一 结 构 ( 见 图 4) 也 能 反 映 LH 在 进 化 中 高 度 的 保 守 性 另 有 研 究 发 现, 鳎 目 鱼 LH 多 肽 一 级 结 构 有 一 个 N- 糖 基 化 位 点, 与 其 他 硬 骨 鱼 类 和 高 等 脊 椎 动 物 保 持 高 度 保 守 性, 这 一 结 构 可 能 与 有 机 体 的 生 物 合 成 及 激 素 调 控 有 关 [18] 本 研 究 发 现 半 滑 舌 鳎 LH 也 有 1 个 N- 糖 基 化 位 点 Asn(19~21 NQT)( 见 图 4), 具 体 生 理 机 能 有 待 进 一 步 探 究 依 据 Neighbor-Joining 方 法 构 建 系 统 进 化 树, 发 现 半 滑 舌 鳎 LH 与 鲽 形 目 中 的 其 他 鱼 类 LH 同 源 性 (58 %~64 %) 比 鲈 形 目 (64 %~68 %) 相 对 较 低, 这 可 能 是 导 致 鲽 形 目 LH 不 能 聚 为 一 簇 的 原 因 4.2 LH 基 因 在 繁 殖 季 节 半 滑 舌 鳎 的 组 织 表 达 利 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 方 法 检 测 LH 基 因 在 半 滑 舌 鳎 各 组 织 的 表 达, 结 果 发 现 : 所 有 组 织 中 均 有 表 达, 垂 体 表 达 量 最 丰 富, 其 他 组 织 表 达 量 都 很 小, 脑 和 性 腺 相 对 表 达 量 较 高 在 尼 罗 罗 非 鱼 (Oreochromis niloticus) 红 大 马 哈 鱼 (Oncorhynchus nerka) [19] 金 头 鲷 (Sparus aurata) [20] 和 斑 马 鱼 (Danio rerio) [21] 的 研 究 中, 利 用 半 定 量 实 时 PCR 方 法 和 免 疫 细 胞 化 学 检 测 方 法, 检 测 到 LH mrna 在 非 垂 体 组 织 中 亦 有 表 达, 与 本 研 究 结 果 相 似 但 有 关 LH mrna 在 非 垂 体 组 织 中 广 泛 表 达 的 生 理 机 制 尚 未 明 确, 推 测 半 滑 舌 鳎 LH 可 能 具 有 更 加 广 泛 的 垂 体 外 的 生 理 功 能, 对 此 进 行 深 入 研 究 具 有 重 要 意 义 4.3 雌 性 半 滑 舌 鳎 LH mrna 周 期 表 达 模 式 分 析 本 研 究 表 明 半 滑 舌 鳎 卵 巢 发 育 至 Ⅱ 期,LH mrna 表 达 量 相 对 低, 之 后 mrna 水 平 逐 渐 稳 步 上 升 ; 直 到 Ⅳ~Ⅴ 期 mrna 表 达 量 急 剧 增 大 说 明 LH 主 要 促 进 卵 母 细 胞 最 终 成 熟 及 排 卵 有 研 究 利 用 原 位 杂 交 放 射 免 疫 Northern blot 实 时 荧 光 定 量 PCR 等 方 法, 检 测 虹 鳟 鱼 [22~24] 许 氏 平 鲉 (Sebastes schlegeli) [25] [26] 斑 点 叉 尾 鮰 的 LH, 发 现 卵 巢 最 终 成 熟 及 排 卵 时 LH mrna 水 平 急 剧 上 升, 并 起 主 导 作 用 与 本 实 验 结 果 一 致 各 时 期 LH 不 同 的 表 达 水 平 可 能 与 其 受 体 时 空 表 达 的 差 异 性 相 关 斑 点 叉 尾 鮰 的 研 究 表 明, 垂 体 LH 水 平 同 卵 巢 LHR 水 平 的 变 化 规 律 基 本 一 致, 推 测 LH 与 其 受 体 结 合 具 有 高 度 的 特 异 性 但 陈 [27] 晓 燕 对 半 滑 舌 鳎 LHR mrna 进 行 相 关 研 究, 显 示 LHR 在 Ⅲ 期 卵 巢 和 脑 中 表 达 量 最 丰 富, 与 本 研 究 结 果 有 所 不 同 因 此, 半 滑 舌 鳎 LH 与 其 受 体 结 合 的 高 度 特 异 性 有 待 进 一 步 研 究 2014 年 第 16 卷 第 9 期 57

9 4.4 雌 性 半 滑 舌 鳎 血 清 LH 周 期 变 化 及 其 与 LH 基 因 表 达 关 系 实 验 采 用 RIA 方 法, 检 测 半 滑 舌 鳎 血 清 LH 在 卵 母 细 胞 生 长 卵 黄 生 成 卵 子 成 熟 及 排 卵 等 各 时 期 的 表 达 水 平 结 果 显 示 : 性 腺 发 育 早 期 ( 即 卵 黄 生 成 作 用 ), 血 清 LH 浓 度 逐 渐 稳 步 上 升, 直 到 排 卵 时 (Ⅴ 期 卵 巢 ) 浓 度 最 大 揭 示 卵 黄 生 成 阶 段 垂 体 内 LH 大 量 合 成 并 积 累, 从 而 排 卵 时 血 清 LH 浓 度 达 到 最 高 由 此 可 见, 半 滑 舌 鳎 血 清 LH 激 素 分 泌 的 变 化 规 律 与 卵 巢 发 育 卵 母 细 胞 生 长 成 熟 及 退 化 基 本 一 致, 在 卵 子 成 熟 及 排 卵 时 期 起 主 导 作 用 这 与 早 期 虹 鳟 的 研 究 结 果 相 一 致 虹 鳟 LH 垂 体 合 成 及 其 血 清 浓 度 不 同 步,LH mrna 先 在 垂 体 合 成, 之 后 LH 激 素 进 入 血 液 循 环 [28], 发 挥 相 应 生 理 学 作 用 本 研 究 同 时 发 现, 雌 性 半 滑 舌 鳎 繁 殖 周 期, 血 浆 LH 浓 度 的 变 化 规 律 同 LH mrna 水 平 在 垂 体 及 卵 巢 组 织 的 变 化 规 律 基 本 一 致 但 对 于 半 滑 舌 鳎 LH 垂 体 合 成 及 血 浆 浓 度 是 否 同 步, 应 进 一 步 进 行 科 学 实 验 研 究 GtH 的 合 成 及 释 放 受 各 种 因 素 制 约, 其 中 性 类 固 醇 激 素 作 用 最 大 许 多 研 究 表 明, 虹 鳟 [29] 欧 洲 鳗 [30] [31] 鲡 及 银 大 马 哈 鱼 血 清 LH 的 含 量 及 mrna 水 平 与 性 类 固 醇 激 素 有 关 在 血 清 FSH 及 E 2 [32] 水 平 已 达 最 高 值 的 卵 黄 生 成 后 期,LH 浓 度 才 急 剧 上 升, 说 明 雌 激 素 能 刺 激 LH 垂 体 内 合 成, 从 而 血 浆 LH 浓 度 增 大 半 滑 舌 鳎 GtH 的 合 成 释 放 与 性 类 固 醇 激 素 的 相 互 作 用 关 系 有 待 进 一 步 研 究 证 实 参 考 文 献 [1] Kajimura S,Yoshiura Y,Suzuki M,et al. cdna cloning of two gonadotropin-β subunits(gth- Ⅰβ and Ⅱ-β)and their expression profiles during gametogenesis in the Japanese flouder(paralichthys olivaceus)[j]. 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11 main function of LH is to promote eggs finally mature and discharge. Radio immunoassay (RIA)marked by 125 I was used to detect the concentration of plasma LH in C.semilaevis. The results showed that the biggest plasma LH concentration appareed on the stage of Ⅴ which also suggested that the main function of LH was to promote eggs finally mature and discharge. [Key words] Cynoglossus semilaevis Günther;LH;cDNA cloning;quantitative real- time PCR;RIA 60 中 国 工 程 科 学