「孕婦乙型鏈球菌檢驗品質保證研究計畫」 品管與實驗室安全
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- 壤靖 盛
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1 105 年孕婦乙型鏈球菌篩檢檢驗品質提升研究計畫 孕婦乙型鏈球菌相關實驗室 內外部品管及實驗室安全 台灣醫事檢驗學會 2016/07/ /07/31
2 大綱 Introduction QC Parameter 品管因素 Personnel 人員 Specimen collection and transport 檢體採集輸送 SOP 標準作業程序書 QC record 品管紀錄 Instruments, media, reagents 設備培養基試藥 AST 藥敏試驗 GBS 外部能力試驗統計探討 Biosafety for GBS Examination 生物安全 2
3 QC parameters General 人員 檢體採集與傳送 標準作業程序書 品管紀錄 病人報告 3
4 QC parameters Specific 儀器 / 設備的性能溫度相關的設備 培養基 CLSI M22-A3 染色 試劑 培養方法 抗微生物製劑敏感性試驗 外部能力試驗 4
5 人員 資格與職掌 技術主管 一般技術人員 持續教育 持續教育 工作訓練 個人能力測試 每年審查 一致性 5
6 檢體採集與傳送 醫囑 提供檢體採集與傳送的說明 重複送檢的頻率與限制 病人辨識 重送規則 無標籤或錯誤標籤 延遲傳送 不適當的容器 採集規範 生物安全 容器的選擇 傳送培養基 避免污染 採檢部位與檢體量 傳送與儲存 監控檢體品質 檢體篩檢 6
7 程序書與品管記錄 標準作業程序書 (SOP) 每年審閱 置於工作人員方便取閱處 作廢文件應續保留三年或至少保留一份過期管制文件複本 所有品管的紀錄 超出品管控制的行動方案 每月審閱 記錄保存三年 7
8 報告 1 陰性報告 : 乙型鏈球菌培養陰性 2 陽性報告 : 乙型鏈球菌培養陽性 3 藥物敏感性試驗結果 : 至少包含 AM or P E CC VA 4 檢驗結果記錄保存三年 8
9 儀器 / 設備 SOP ( 含操作 維修 保養 ) 功能檢查 例行性的預防保養 保留儀器維修紀錄 9
10 Temp-dependent instruments 溫度計或溫度顯示器建議進行校驗 建議每半年一次 二氧化碳培養箱 水盤定期清洗及更換蒸餾水 注意二氧化碳桶氣體量 定期檢測及校正培養箱內 CO 2 濃度 紀錄培養箱溫度及 CO 2 濃度 有培養物滲漏 污染立即清除. 消毒 10
11 CLSI M22-A3 Exempt and Nonexempt Categories for Media Included in CAP Surveys(1984, 1988, 2001) Category Exempt NonExempt General bactereriologic medium Blood culture (B/C) media Media for Gram(+) bacteria Media for Gram(-) bacteria Blood agar; Chocolate agar Thioglycolate broth; Urease agar BHI B/C broth; TSB B/C broth Biphasic B/C medium Centrifugation/isolation tubes Thiol B/C broth; Peptone broth CNA agar; PEA agar; LIM broth Selective media for enterococci Mannitol salt agar; E. faecalis broth Selective media for GAS Sheep blood agar with SXT CIN agar; Citrate agar; CLED agar EMB agar; GN broth; HE agar; XLD agar SS agar; MacConkey agar; TCBS agar TSI agar; TSB with sheep blood with AM Selenite broth Nutrient broth Todd-Hewitt broth Desoxycholate broth Trans-vaginal broth Chocolate agar with pyridoxal MacConkey sorbitol agar Chocolate agar with bacitracin 11
12 QC of LIM Broth( 自配製 ) 步驟: 1. 將培養於 TSB 小時菌落調成懸浮液, 其中 S. agalactiae 的懸浮液稀釋成 1,000 或更低的 CFU/mL, E. coli 的懸浮液稀釋成 1.0 x 10 5 CFU/mL 2. 各取 1.0 ml 稀釋懸浮液接種於 LIM Broth 中 3. 鬆蓋置於 35 ± 2 C 一般培養箱中. 4. 檢查 LIM Broth 上之生長至第三天情形 5. 預期結果如下 : Organisms ATCC Recovery S. agalactiae Growth (moderate to heavy) Escherichia coli Inhibition (partial to complete) 12
13 CLSI M22-A3 ( 可排除 QC 之驗貨步驟 ) 1. 完整的培養皿 ( 無破損 ) 2. 培養基與培養皿接觸良好 ( 無剝離 ) 3. 含血的培養基是不透明 ( 無溶血 ) 4. 培養基顏色適當 5. 包裝中是最低的含水量 6. 沒有冷凍或乾燥 7. 沒有污染 8. 培養基厚度至少 3 mm 9. 培養基表面光滑 ( 無氣泡或表面粗糙 ) 10. 無沉澱物出現 13
14 Strep B Carrot broth 品管證明
15
16 QC for StrepB Carrot Broth Test Organisms Streptococcus agalactiae** ATCC Streptococcus agalactiae clinical strain Streptococcus pyogenes ATCC Escherichia coli ATCC Proteus mirabilis ATCC Inoculation Method* A A Incubation Time 6-24hr 18-24hr Results Growth; bright orange to red color change Growth; light orange to red color change A 18-24hr Growth; no color change B B 18-24hr 18-24hr Partial to complete inhibition; no color change Partial to complete inhibition; no color change * 準備 0.5 McFarland 懸液, 方法 A 稀釋 1:100, 方法 B 稀釋 1:10, 接種 0.01 毫升至培養液中 16
17 QC for StrepB Carrot Broth 使用者品管操作 使用說明 使用者應檢查是否污染與變質 操作品管時至少選擇上述陽性與陰性各一株 ** 勿使用 Streptococcus agalactiae ATCC 作為品管, 此菌不溶血, 因此不產生橘色反應 17
18 QC for Catalase test Performed once per lot / shipment Organisms ATCC Reaction Staphylococcus aureus 立即出現氣泡 Streptococcus pyogenes 沒有氣泡 18
19 QC of CAMP test Test each lot or shipment of BAP Organisms ATCC Reaction Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes 在 24 小時內發生一個典型清楚的箭頭或月牙形在 Streptococcus 與 S. aureus ATCC 的交界處 沒有箭頭的形成 ( 在兩株菌株畫線的交界處可能會出現輕微的溶血 ) 19
20 QC for Hippurate Hydrolysis Rapid test 品管執行在 each new lot number 和 shipment 並且至少每個月覆測一次 如果品管結果不通過應重新配製試劑 Organisms ATCC Reaction Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes hippurate positive,30 分鐘內成深藍色 hippurate negative, 淡淡的紫色或無顏色變化. 20
21 Lancefield Group Antigen 品管執行於 each shipment of serogrouping 試劑或依製造商說明 Organisms ATCC Reaction Streptococcus pyogenes Group A agglutination Streptococcus agalactiae Group B agglutination Streptococcus dsygalactiae subsp. equisimilis Group C agglutination Enterococcus faecalis Group D agglutination Streptococcus sp. type Group F agglutination Streptococcus dsygalactiae subsp. equisimilis Group G agglutination 21
22 品管菌株的維護 菌株冷凍管 次培養於適當的培養基 CLSI M02-A11. App E. CLSI M07-A9. App E. 再次次培養後, 每天由 Day1 培養基次培養後使用, 重複至第 7 天 由 Day1 培養基次培養後使用, 重複至第 7 天 每週重覆上述步驟至第四週, 四週後再從菌株冷凍管次培養重覆前述動作 某些菌株如,P. aeruginosa ATCC 27853, E. faecalis ATCC 51299, S. pneumoniae ATCC 每二週即須從冷凍管次培養重複動作 22
23 Quality Control Protocol Flow Charts 紙錠擴散試驗日品管 (Daily QC) 測試規範 每日測試 30 測試結果有 3 超過範圍 20 測試結果有 >1 超過範圍 持續每日測試 ( 直到符合轉至週品管 ) 已知錯誤原因 矯正行動 錯誤原因不明 重新測試 立即採取矯正行動 結果落在範圍內持續每日測試 所有的結果在範圍內 重新測試, 且連續測試 5 天 任何一次超出範圍 CLSI, M100 S-23 持續每日測試 附加的矯正行動 調查可能的錯誤來源 23
24 Quality Control Protocol Flow Charts 紙錠擴散試驗週品管 (Weekly QC) 測試規範 1 out of 20 tests out of range or 3 out of 30 tests out of range 日品管有滿意的結果 QC 測試的頻率 : 任何結果超出範圍可實行週品管測試可從日品管轉換至週品管已知錯誤原因 矯正行動 錯誤原因不明 重新測試結果不在範圍內 shipment or Lot QC: 立即矯正行動 Each new 結果在範圍內 shipment 或 lot 培養基或紙錠或商品化套組重新測試, 且連續測試 5 天任何一次超出範圍所有的結果在範圍內 CLSI, M100 S-23 回到週品管測試 附加的矯正行動 調查可能的錯誤來源 回到週品管測試 24
25 15-Replicate (3 5 day) Plan Flow Chart Test 3 replicates of each QC strain for 5 days using individual prepared inoculum 0-1 of 15 out of range? 2-3 of 15 out of range? 4 of 15 out of range? Fail. Continue to include each test day. Take corrective action. Pass. Convert to weekly QC. Test another 3 replicates for 5 days 2-3 of 15 out of range? 4 of 30 out of range? Pass. Convert to weekly QC. CLSI, M100 S-25 25
26 Streptococcus spp. β-hemolytic Group Minimal QC Recommendations QC strain: Streptococcus pneumoniae ATCC Agent Disk conc. Zone size (mm) Acceptable range MIC (μg/ml) Acceptable range Penicillin 10 units Erythromycin 15 μg Clindamycin 2 μg Vancomycin 30 μg Medium : disk diffusion MHA with 5% sheep s blood Penicillin 或 Ampicillin 非敏感性的結果應再進行鑑定與藥敏試驗確認 26
27 外部能力試驗 應有外部能力試驗程序書 包括測試檢體之處理 分析 報告 確認 審閱等程序 對不合格項目調查並有矯正處理措施 外部能力測試之檢體, 應排入例行工作內, 由日常操作者以平時操作病患檢體相同方式分析 禁止將外部測試檢體委託給其他實驗室操作或與其他實驗室做討論 外部能力測試結果之相關紀錄保留 TSLM 27
28 GBS Isolates from Prenatal Screening Samples Agent No. (%) of isolates Susceptible Intermediate Resistant No. of isolates tested Clindamycin a, b 243 (62.8) 2 (0.5) 142 (36.7) 387 Clindamycin a, c 274 (70.8) 2 (0.5) 111 (28.7) 387 Erythromycin a 200 (51.7) 12 (3.1) 175 (45.2) 387 Penicillin d 102 (100) Vancomycin d 102 (100) a Testing was performed by disk diffusion. b D-test-positive isolates are reported as resistant. c D-test data are excluded. d Testing was performed with E-test. Benjamin., (2014) JCM. p
29 Suggestions for Confirmation of AST Results and Organism Identification Streptococcus, β-hemolytic group Ampicillin or penicillin NS, Vancomycin NS Not reported or only rarely reported to date CLSI, M100 S-25, p
30 微生物實驗室生物安全 30
31 生物實驗意外感染主要途徑及類型 生物實驗意外感染主要途徑 吸入氣溶膠 ( 氣霧 )( 意外導致或由於工作操作吸入 ) 通過皮膚接觸 黏膜接觸污染物 典型生物實驗意外類型 針頭 / 注射器刺傷 感染性物質溢出 / 噴霧接觸或吸入 碎玻璃 / 其他銳器扎傷 31
32 GBS 於實驗室的危害 實驗室獲得性感染 : 1976 年報告 78 人因鏈球菌屬造成實驗室的感染 檢體來源 : GBS 可從血液 腦脊液 關節液 腹膜透析液 胸腔液 骨 陰道 咽喉和直腸培養, 氣膠和糞便等處分離 主要危害 : 當作業人員操作此菌因意外注射接種, 食入 吸入傳染性氣膠和直接接觸是主要的危害 特殊危害 : 無 來源 : 加拿大衛生部病原體安全資料表 (PSDS) 32
33 生物安全作業基準 (5P) 人員 person 教育訓練 步驟 procedure SOP 實驗室安全 病原 pathogen 風險評估 設施設備 place 防護 Protection PPE 33
34 個人安全防護 1. 進入實驗室應穿實驗衣, 戴口罩, 手戴手套, 必要時戴眼罩或面罩 2. 負責實驗室清潔工作人員, 要穿工作服, 戴口罩及手套 4. 實驗室工作人員要事先留存血液檢體, 以利健康管理及追蹤監視 5. 不得在實驗室內穿露出腳趾之鞋子 6. 在實驗室內用過之實驗衣不得與日常服裝放在同一櫃子內 34
35 生物防護 (Biocontainment) 初級防護 (Primary Barrier) 採基本的方式, 隔離人員與微生物接觸的界面, 如直接隔離人員與對人員有害的生物材料之防護設備 如口罩 防護衣 手套等 二級防護 (Secondary Barrier) 實驗室內建築 設施與設備等針對生物防護的特別設計或其它安全項目 35
36 初級防護 (Primary Barrier) 36
37 生物安全第二等級實驗室 Biosafty level 2 (BSL-2 Lab.) 生物病原可能會引致作業人員 動物產生疾病或環境之中度風險 工作人員需受過使用致病物質的特殊訓練並由適任的專家指導 工作進行中應有門禁管制 需特別小心受污染的尖銳物品, 可能產生氣膠 (Aerosol) 或濺灑的操作程序 應使用生物安全櫃或各式物理性防護設備 37
38 GBS 的暴露控制 / 個人防護 風險群分類 :Risk group 2 防堵需求 : 對作業於感染或潛在感染性的物質 動物或培養, 應使用於 2 級之設施 設備與操作規範 個人防護 : 實驗衣 手套時 當已知或潛在的風險飛濺暴露時, 必須使用保護眼睛的設備 其他注意事項 : 所有程序可能會產生氣膠, 或涉及高濃度應在生物安全櫃 (BSC) 進行 應嚴格限制使用針頭, 注射器和其他尖銳物體 來源 : 加拿大衛生部病原體安全資料表 (PSDS) 38
39 標準微生物操作程序 (I) 1. 實驗室外面要標示實驗室安全等級 負責人及聯絡電話 2. 實驗進行中實施門禁管制 3. 實驗衣必須與平時穿著之衣服分開放置 4. 感染性物質工作區必須備妥有效消毒劑 5. 創傷傷口要以防水之衣物覆蓋 6. 處理感染性物質, 脫掉手套後及離開實驗室前須洗手 7. 戴手套在實驗室內必須先脫掉才可接聽電話或開門窗 開冰箱 培養箱或顯微鏡觀察應更換手套 8. 實驗室及實驗動物房內禁止飲食 抽煙 化妝或處理隱 形眼鏡 39
40 標準微生物操作程序 (II) 9. 實驗室禁止用口吸取檢品或溶液 10. 小心操作以減少濺灑及氣霧之產生 11. 實驗室保持乾淨整潔, 書寫紀錄要與感染性工作區分開 12. 工作檯面須每天至少清理消毒一次, 如有任何活性感染物灑落, 立即消毒 13. 所有培養物及實驗之感染性廢棄物應妥善包裝並依法規規定處理 14. 禁止穿著實驗衣離開實驗區到餐廳 員工休息區 辦公室及其他公共場所 40
41 氣體鋼瓶上鏈加蓋 41
42 Q & A (16) Q: 使用鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping) 鑑定 GBS, 是否應操作品管測試? A: 正確, 依試劑操作說明執行陽性品管與陰性品管測試 42
43 Q & A (17) Q: GBS 各項鑑定, 品管操作方法及頻率為何? (103 年增修 ) A: 台灣醫事檢驗學會網站上的資料下載中可下載乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus) 檢驗標準作業手冊 (102 年版 ), 上面有規範詳細範圍提供參考 可上學會網站 ( 查詢 43
44 Q & A (18) Q:CLSI M22 規範之品管排除的培養皿, 如 LIM broth BAP( 作 CAMP 檢測除外 ) CNA, 應如何處理?(104 年增修 ) A: 如為商品化產品只需作外觀檢查, 如包裝是否完整 顏色是否正確 有無污染或溶血 是否過冰 (freezing) 有效期限等, 可不作陽性 陰性品管, 但需廠商提供品管單存查 ; 若自行配製者, 則需作陽性 陰性品管 44
45 Q & A (28) Q: 藥敏試驗有日品管及週品管之分, 何時可以將日品管改成週品管? (104 年增修 ) A: 每日品管連續 20 個結果 1 個或 30 個結果 3 個超過可接受範圍時, 或 (2) 每天作 3 重覆, 連續作 5 天,15 個結果 1 超過可接受範圍時, 可轉換為週品管 45
46 Q & A (30) Q: 我認為我的實驗室已具備醫檢學會所建議的培養與鑑定方法, 但我的實驗室陽性率為什麼比其他實驗室較低? A: 除了確實檢視實驗室的作業流程與品管外, 人員對於菌落的辨識能力是一要項, 所以應對人員加以訓練與考核, 必要時得以產色培養基輔助辨識 另外對於檢體採檢的品質也是一項重要影響因素, 可使用醫檢學會印製之 孕婦乙型鏈球菌篩檢檢體採集 保存與運輸作業須知 宣導單張供採檢醫師參考, 並適時的與採檢單位溝通正確採檢的重要性 46
47 Q & A (31) Q: 各種程序書審閱或保存期限多久才恰當, 及其規範之依據 (103 年增修 ) A: 各個認證機構有不同規範, 各檢驗機構應依自己參加的認證作為標準, 本計畫並沒有硬性規定範圍 47
48
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