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诞个纳喇
5 years ago
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1 孕婦乙型鏈球菌流行病學培養檢體處理及常在菌型態特性介紹社團法人台灣醫事檢驗學會 2017/07/ /07/16

2 課程大綱乙型鏈球菌 (GBS) 篩檢臨床意義流行病學乙型鏈球菌 (GBS) 篩檢方法流程演進乙型鏈球菌 (GBS) 培養流程檢體採集與接種方式 Enriched broth 乙型鏈球菌 (GBS) 鑑定乙型鏈球菌 (GBS) 藥物敏感性試驗 (AST) GBS 檢驗醫事機構審查原則 2 2

3 乙型鏈球菌篩檢流行病學及篩檢方法演進

4 乙型鏈球菌 Streptococcus agalactiae Group B Streptococcus (GBS) 孕婦周產期嚴重感染之主要致病菌產婦 : 早產早期破水絨膜羊膜炎產後感染新生兒 : 敗血症腦膜炎肺炎神經系統後遺症早發型感染 : 在出生時發病, 早產兒在生後 6~12 hrs 發病, 足月兒則晚至 24 hrs 以後晚發型感染 : 發生於生後 5 天 ~16 週美國 1970 年代新生兒感染致死率 >50%, 1990 年代早發型新生兒感染率 :1.8/

5 新生兒 GBS 感染發生率與預防準則的演進 1st ACOG & AAP statement 早發型晚發型 MMWR,2010, Nov.19

2 % (1991~1997) 馬偕醫院, 新生兒感染率 0.11/1000 (1985) 1.

6 GBS 相關流行病學美國施行孕婦 GBS 篩檢後, 新生兒感染致死率由 >50% (1970) 下降至 4% (1990) 早發型新生兒感染率由 1.8/1000 (1990) 下降至 0.5/1000 (1999) 台灣馬偕醫院,GBS 造成新生兒腦膜炎 19.1% (1984~1990) 升至 44.2 % (1991~1997) 馬偕醫院, 新生兒感染率 0.11/1000 (1985) 1.39/1000 (1995) 高雄長庚醫院, 新生兒感染率 0/1000 (1996) 1.8/1000 (2001) Aca Paediatr Tw 1999; 40: Chang Gung Med J Vol. 27 No. 7 July

7 台灣 GBS 沿革及國健署福利政策台灣妊娠婦女產道 GBS 帶菌率 ( 約 18%) 台灣新生兒 GBS 感染率 ( 約 1/1,000) 新生兒感染 GBS 致神經後遺症 ( 約 15%) 新生兒因 GBS 感染致死率 ( 約 10~13%) 99 年起先補助低收入戶孕婦篩檢 100 年加入中低收入山地原住民離島孕婦篩檢 101 年 4 月 15 日全面補助孕婦篩檢

8 篩檢時機懷孕 35~37 週 GBS 的移生是短暫的 Yancey et al., OB GYN 1996;88:

各國孕婦 GBS 篩檢之時程國家產檢時程美國妊娠 35-37 週 (CDC 準則建議 ) 加拿大妊娠 35-37 週日本妊娠 33-37 週英國妊娠 33-37 週台灣

9 各國孕婦 GBS 篩檢之時程國家產檢時程美國妊娠週 (CDC 準則建議 ) 加拿大妊娠週日本妊娠週英國妊娠週台灣妊娠第三期 (35-37 週 ) 若孕婦於尚未接受乙型鏈球菌篩檢前, 出現早期子宮收縮或胎膜早破現象而住院者, 除接受常規治療外, 亦應於住院時, 依醫師專業意見接受乙型鏈球菌篩檢 9 9

10 102 年 ~106 年第一季 GBS 檢體量及陽性率件數陽性率

11 檢驗機構孕婦乙型鏈球菌陽性率分佈

12 各級檢驗機構孕婦乙型鏈球菌陽性率分佈 30.00% 25.00% 20.00% 15.00% 10.00% LIM+BAP or CNA LIM+Chrom or GBS detect Carrot+BAP or CNA Carrot+Chrom or GBS detect 5.00% 0.00% 醫學中心區域醫院地區醫院檢驗所 total

13 影響 GBS 培養陽性率的因素檢體採檢部位不適當採檢容器錯誤採檢後傳送及保存方式錯誤培養方式錯誤人員經驗不足 13

14 GBS 偽陽性與偽陰性對臨床影響 GBS 偽陽性 : 臨床醫師判讀錯誤而使用抗生素 GBS 偽陰性 : 臨床醫師無預防性用藥, 易造成新生兒感染 14

15 生殖道的常在菌叢 15 Clin Infect Dis 2001; 32:e69 77

16 培養皿上有多種細菌, 不容易找出 GBS 16

17 增菌培養液對於 GBS 培養分離率的效益種類 :LIM broth, Strep B carrot broth TM, TransVag 養分 :Todd-Hewitt broth 或 Granada medium 抗生素 :Colistin 和 Nalidixic acid, 抑制 G(-) 效益 : 提高生殖道 GBS 的分離率 17 17

18 增菌培養液對於 GBS 培養分離率的效益加入 LIM broth, 陽性率可提高 %, 陽性件數增加 20-26% 月資料來源 : 林口長庚醫院 18

19 19

20 結論對於孕婦乙型鏈球菌的篩檢, 正確的結果比時效重要約有 ~50% 的孕婦如未經小時增菌培養可能有陰性的結果拭子可以直接接種培養皿, 但不可取代增菌培養步驟增菌培養是做孕婦乙型鏈球菌篩檢最關鍵的步驟 20

21 乙型鏈球菌篩檢培養流程

22 22

23 使用運送培養基執行採檢採檢的時機 : 週的孕婦使用 Amies 或 Sturat s 的運送培養基執行檢體採集採集部位 : 陰道 - 肛門拭子正確標示病患資料檢體於 24 小時內盡速送檢, 並 4 保存 23

24 採檢步驟陰道肛門拭子可使用一支或二支棉棒不要使用 speculum 24

25 台灣目前常用增菌培養基 LIM broth 10 μg/ml 的 cloistin 及 15 μg/ml 的 nalidixic acid Todd-Hewitt 培養液 Strep B carrot broth TM Granada medium 可偵測溶血型 GBS 菌株 25

26 將檢體拭子接種於增菌培養基 -LIM broth 放入檢體拭子, 並沿管壁攪動拭子以確保膠狀成份乳化小心折斷拭子 35 溫箱培養 6-24 小時 26

27 將檢體拭子接種於增菌培養基 Strep B carrot broth TM 使用前先反轉管子一次以混合管中成份接種前加入紙錠, 確認紙錠完全浸潤於培養基 30 分鐘內完成接種 27

28 將檢體拭子接種於增菌培養基 Strep B carrot broth TM 放入檢體拭子 ( 不可使用含 charcoal 的傳送管 ), 並沿管壁攪動拭子以確保膠狀成份乳化小心折斷拭子蓋緊蓋子, 以確保管底的無氧環境 35 溫箱培養 6-24 小時 28

29 將增菌培養基放在培養箱培養 6-24 小時針對 β- 溶血性乙型鏈球菌可產生肉眼可見的顏色, 可直接鑑別 GBS 的存在, 不需另行操作鑑定試驗 GBS 陽性產生橘色色素 LIM broth carrot broth TM 29

30 Strep B carrot broth TM 判讀 (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) 橘色液體或點狀或顆粒, 皆可判讀為 GBS 陽性 30

31 次培養的必要性 Carrot broth(-) 或 LIM broth 皆必需次培養於適當的培養基 Blood agar plate (BAP) Columbia colistin-nalidixic acid agar (CNA) ChromID TM Strepto B agar GBS Detect TM medium 31

32 培養基培養條件接種前培養皿需先回溫 BAP, CNA:35-37 CO 2 溫箱 ChromID TM Strepto B agar, GBS Detect TM medium: 一般溫箱培養小時觀察如果没長, 再放小時 32

33 三區劃法檢體種在 A 區或用已滅菌的接種環在 A 區劃開滅菌的接種環並冷卻由 A 區拉出 2-3 條線後在 B 區劃開滅菌的接種環並冷卻由 B 區拉出 2-3 條線後在 C 區劃開再劃至 D 區 33

34 GBS(BAP) 觀察 BAP 上灰色半透明菌落 ( 窄型 β 溶血 ) 34

35 GBS-r (BAP) 觀察 BAP 上灰色半透明菌落 ( 不溶血或 g- 溶血 ) 35

36 BAP GBS GBS-r Enterococcus SA GAS 36

37 GBS (CNA) GBS GBS-r 37

38 CNA GBS GBS-r Enterococcus SA GAS 38

39 ChromID TM Strepto B agar GBS GBS 產生粉紅或紅色菌落可偵測所有溶血與非溶血的 GBS 可抑制大部份其他菌株以顏色清楚區分 GBS 與其他菌株 GBS-r 39

40 ChromID TM Strepto B agar GBS GBS-r E.faecalis E.faecium GAS 40

41 ChromID TM Strepto B agar 依照試劑書明說執行 2-8 暗室保存不可使用過期及呈粉紅色之培養基 GBS 產生粉紅或紅色菌落菌落再用生化反應或凝集法確認干擾菌 : S. pyogenes, S. porcinus 41

42 GBS Detect TM medium GBS 42

43 GBS Detect TM medium GBS GBS-r Enterococcus SA (NG) GAS 43

44 GBS Detect TM medium 依照試劑書明說執行 2-8 暗室保存 ( 對光及溫度敏感 ) 不可使用過期培養基 GBS 產生透明, 大溶血圏的菌落菌落再用生化反應或凝集法確認干擾菌 : S.pyogenes 44

45 檢體範例由 LIM broth 次培養 CO 2 溫箱培養培養 24 小時, 未懷疑 GBS, 再培養 24 小時 ( 共 48 小時 ) 45

46 BAP CNA 檢體 A- 48 小時 GBS(+ ) ChromID GBS Detect 46

47 檢體 B- 48 小時 GBS(-) BAP CNA ChromID GBS Detect 47

48 BAP CNA 檢體 C- 48 小時 GBSr(+) ChromID GBS Detect 48

49 檢體 D-GBS + (BAP) 將培養皿對着光觀察所有疑似 b 溶血皆需作確認 49

50 檢體 D- GBS+ (CNA) 將培養皿對着光觀察 50

51 檢體 D-GBS+ ChromID TM GBS agar GBS Detect TM medium 51

52 使用 GBS 選擇性培養皿 (Chromo ID/GBS detect agar) 及傳統培養皿 ( 使用 BAP/CNA) 比較調查細項回覆結果家數總家數百分比 LIM broth( 包含 todd) % 使用增菌培養液種類 Carrot broth % 調查細項回覆結果家數總家數百分比一般培養基 GBS 專用培養基 BAP % CNA % BAP+CNA % BAP+ 其他 % ChromID TM Strepto B agar % GBS Detect medium % ChromID TM Strepto B agar + GBS Detect % medium

53 年度使用不同增菌培養液之孕婦乙型鏈球菌篩檢陽性率與比較 Carrot broth 檢驗機構總件數陽性件數平均陽性率 LIM broth 檢驗機構總件數陽性件數平均陽性率 104 年 48 家 % 73 家 % 105 年 50 家 % 71 家 % 106 年 1-4 月 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 49 家 % 72 家 % LIM Carrot LIM Carrot LIM Carrot >28% 20-28% 18-20% <18% 104 年 105 年 106 年 1-4 月 53

54 檢驗機構使用培養皿之孕婦乙型鏈球菌篩檢陽性率與比較 Chrom ID/GBS detect BAP/CNA 年度平均陽性平均陽性檢驗機構總件數陽性件數檢驗機構總件數陽性件數率率 104 年 56 家 % 95 家 % 105 年 61 家 % 94 家 % 106 年 1-4 月 100% 60 家 % 93 家 % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% >28% 20-28% 18-20% <18% 10% 0% Chrom ID/GBS BAP/CNA Chrom ID/GBS BAP/CNA Chrom ID/GBS BAP/CNA 104 年 105 年 106 年 1-4 月

55 陽性率使用培養皿之孕婦乙型鏈球菌篩檢陽性率與比較 25.0% 24.0% 23.0% 22.0% 21.0% 20.0% 19.0% 18.0% 17.0% 16.0% 15.0% Chrom or GBS Chrom or GBS BAP orcna BAP orcna detect detect LIM broth Carrot broth 月 19.8% 20.2% 20.8% 22.9% 月 20.0% 20.2% 21.4% 22.4% 月 20.9% 20.6% 22.1% 23.6% 55

56 孕婦乙型鏈球菌檢驗作業 Q & A 56

57 Q1: 何時最適合作孕婦乙型鏈球菌篩檢? A: 研究證實在生產前 5 週內作作孕婦乙型鏈球菌篩檢可以到最正確的結果此時期的陰性預測值 (NEGATIVE PREDICTIVE VALUE) 95-98%, 陽性預測值 (POSITIVE PREDICTIVE VALUE ) % 如果檢測時間離生產超過 6 週, 陽性預測值降至 43% 所以規範要求採檢的時間點為懷孕週 57

58 Q2: 如果在第 35 週作孕婦乙型鏈球菌篩檢, 結果為陰性, 此孕婦 41 週才生產 ( 離培養已超過 5 週 ), 是否需再作一次篩檢? A: 不需要因為孕婦在週作乙型鏈球菌篩檢培養, 如果為陰性, 是不需要再作篩檢然而, 如果孕婦在 35 週前作篩檢, 她應該在 5 週後再作篩檢 58

59 Q3: 作孕婦 GBS 篩檢, 應該採檢 1 支 vaginal 拭子 1 支 rectal 拭子或二種? A: 目前根據美國 CDC 的規範, 應該採檢 VAGINAL- RECTAL 拭子, 因為 VAGINAL-RECTAL 拭子比單一 VAGINAL 拭子或 RECTAL 拭子, 有較高的敏感度採檢方式為請孕婦平躺雙腳弓起, 將採檢拭子置放入孕婦陰道口內約 2 公分處, 採集黏膜分泌物 ( 勿使用窺陰器 ) 使用同一採檢拭子, 置放入孕婦肛門口內約 2.5 公分處, 以旋轉之方式採集檢體將採檢拭子放回採集容器中可使用同一支或分二支拭子採檢 59

60 Q4: 可接受含有 charcoal 的傳送培養基嗎? A:CHARCOAL 不會影響乙型鏈球菌的生長, 採檢拭子應放在非營養性的傳送培養基 ( 如. STUART S 和 AMIES), 可以添加或無添加 CHARCOAL 但如使用產色增菌液, 應確認原廠建議是否可使用含有 CHARCOAL 的傳送培養基 60

61 Q5:GBS 檢體採檢後, 若無法在 24 小時內送送達檢驗機構, 應如何保存? (104 年增修 ) A:GBS 檢體採檢後, 若無法在 24 小時內送達檢驗機構, 應置 4 保存檢體應在採檢後四天內接種完畢 61

62 Q6:GBS 檢體收件後, 若無法立即操作應如何保存? 可否保存於 37? (104 年增修 ) A: 培養棒應盡速送檢或接種, 若無法馬上送檢或接種, 應於 4 下可保存不可保存於 37 62

63 Q7: 實驗室可以直接將拭子檢體接種於瓊脂平板上嗎? A: 可以, 但陰道 / 直腸拭子直接接種於瓊脂平板後仍需要再將拭子放入選擇性增菌培養液接種, 增加乙型鏈球菌檢出率註 : 這種產前篩檢結果的正確性比快速得到結果重要 63

64 Q8: 被推薦使用於 GBS 篩檢有那些增菌培養液? A:LIM BROTH TRANSVAG 或為一種偵測產色素乙型鏈球菌的選擇性增菌培養液, 如 CARROT BROTH 64

65 Q9:LIM broth 培養後如果没有混濁應如何處理?(103 年增修 ) A:LIM BROTH 可抑制部分 GRAM(-) 細菌, 所以加入 VAGINAL-RECTAL 拭子的 LIM BROTH 一定會混濁, 如果没有混濁, 可能是未採到檢體, 應該重新送檢 65

66 Q10: 如果使用產色增菌培養液沒有產色, 可以發出乙型鏈球菌陰性報告嗎? A: 不可以, 大部分的產色增菌培養液都是偵測會產生 Β 溶血的菌株, 在最近的研究中, 約 4% 引起新生兒侵入性早發性感染的乙型鏈球菌菌株屬於非 Β 溶血性, 不會產生顏色變化所有不產色的肉湯應以適當的瓊脂平板進行次培養, 以確定是否存在乙型鏈球菌 66

67 Q11: 有需要尋找非溶血性乙型鏈球菌嗎? A: 是的, 產色增菌培養液和一些產色培養基只檢測溶血的乙型鏈球菌, 在最近的研究中, 約 4% 的引起新生兒侵入性早發性感染的乙型鏈球菌株屬於非 Β 溶血性在羊血瓊脂培養基 (BAP),Β 溶血可能並不明顯, 因此, 如果疑似 GBS 的灰白色半透明菌落, 應該進一步測試 67

68 Q12: 不溶血 GBS 不易被辨識, 是否有推薦的辨識方式?(103 年增修 )(105 年修訂 ) A: 接種時建議不要使用 BAP BI-PLATE, 只要有懷疑的菌落, 皆應挑出來鑑定確認 ; 判斷不溶血 GBS 菌落需要經驗, 學會能力試驗有提供過菌株, 可作為人員教育訓練材料目前市面上已有商品化培養基如 CHROMID TM STREPTO B AGAR 和 GBS DETECT TM MEDIUM 可加強辨識 68

69 Q13: 使用 ChromID TM Strepto B agar 培養出紅色或粉紅色菌落, 是否可以直接發出陽性報告? A: 不行, 依據原廠使用說明書, 培養出紅色或粉紅色菌落等疑似菌落, 應需進行相關鑑定試驗, 以避免偽陽性 69

70 Q14: 可用核酸增幅放大試驗法 (nucleic acid amplification test) 直接測拭子檢體的乙型鏈球菌嗎? A: 所有陰道直腸拭子必須先接種於選擇性增菌培養液 ( 例如,TRANSVAG BROTH,LIM BROTH), 培養小時之後再進行核酸增幅放大試驗根據文獻, 直接偵測敏感度較差但是可用於不知乙型鏈球菌狀況, 無危險因子, 但即將要分娩的孕婦檢體 70

71 Thanks for your attention

GBS 檢體採檢後, 若無法在 24 小時內送達檢驗機構, 應置 4 保存檢體應在採檢後四天內接種完畢 8 Q 實驗室可以直接將拭子檢體接種於瓊脂平板上嗎? 可以, 但陰道 / 直腸拭子直接接種於瓊脂平板後仍需要再將拭子放入選擇性增菌培養液接種, 增加乙型鏈球菌檢出率註 : 這種產前篩檢結果

GBS 檢體採檢後, 若無法在 24 小時內送達檢驗機構, 應置 4 保存檢體應在採檢後四天內接種完畢 8 Q 實驗室可以直接將拭子檢體接種於瓊脂平板上嗎? 可以, 但陰道 / 直腸拭子直接接種於瓊脂平板後仍需要再將拭子放入選擇性增菌培養液接種, 增加乙型鏈球菌檢出率註 : 這種產前篩檢結果孕婦乙型鏈球菌檢驗作業問答集 (105 年版 ) 孕婦 GBS 檢體採檢與試驗流程 1 Q 何時最適合作孕婦乙型鏈球菌篩檢? 研究證實在生產前 5 週內作作孕婦乙型鏈球菌篩檢可以到最正確的結果此時期的陰性預測值 (negative predictive value) 95-98%, 陽性預測值 (positive predictive value ) 87-100% 如果檢測時間離生產超過 6