DOI: /j.cnki x 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2018,24 ( 2 ) : 产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌 Z

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屈竞申
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1 DOI: /j.cnki.6-687x 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 218,24 ( 2 ) : * 于平 ** 徐超超朱鹏志浙江工商大学食品与生物工程学院杭州 335 摘要原生质体融合技术是一种重要的微生物育种方法. 以能产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌 ZGL14 为出发菌株, 探讨影响其原生质体制备和再生的主要因素. 通过研究菌龄溶菌酶浓度酶解时间酶解温度渗透压稳定剂的 ph 值再生培养基类型和培养方式等对枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体制备与再生的影响, 确定其最优化条件. 结果显示 : 枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体制备的最优条件为菌龄 9 h, 溶菌酶浓度.2 mg/ml, 酶解时间 1 min, 酶解温度 32, 渗透压稳定剂的 ph 值 7.. 在此条件下, 枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体的形成率为 98%, 再生率达 %. 枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体再生培养基以琥珀酸钠作为渗透压稳定剂并结合 Ca 2+ 再生效果较好, 再生方式以单层培养较好. 本研究获得了枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体制备和再生的最佳条件, 可为实现其融合育种提供技术支持. ( 图 7 表 1 参 14) 关键词枯草芽孢杆菌 ; 原生质体制备 ; 原生质体再生 ; 形成率 ; 再生率 ; 渗透压稳定剂 CLC Q813.2 Protoplast preparation and regeneration conditions of Bacillus subtilis ZGL14 producing alkaline pectinase* YU Ping ** XU Chaochao & ZHU Pengzhi College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 335, China Abstract The protoplast fusion technique is one of the important microbial breeding methods. The main factors that affect protoplast preparation and regeneration were investigated using Bacillus subtilis ZGL14 as the starter strain. The optimal conditions for protoplast preparation and regeneration were determined in this study by optimizing the cell age, lysozyme concentration, enzymolysis time, enzymolysis temperature, ph values of the osmotic pressure stabilizer, regeneration medium types, and culture type. The results indicated that the optimal condition for protoplast preparation of B. subtilis ZGL14 was as follows: 9 h of cell age,.2 mg/ml of lysozyme concentration, 1 min of enzymolysis time, 32 C of enzymolysis temperature, and 7. of osmotic pressure stabilizer ph value. Under this condition, the protoplast formation and regeneration rates were > 98% and > %, respectively. A good protoplast regeneration effect can be achieved using the regeneration medium with sodium succinate as osmotic pressure stabilizer in combination with Ca 2+. The single-layer culture was better than double-layer for regeneration. The optimal condition for protoplast preparation and regeneration of B. subtilis ZGL14 was determined in this study, which provides technical support for protoplast fusion breeding of B. subtilis. Keywords Bacillus subtilis; protoplast preparation; protoplast regeneration; formation rate; regeneration rate; osmotic pressure stabilizer 果胶酶是指可以降解果胶类物质的多种酶的总称, 是一种复合酶 [1]. 微生物果胶酶占全球酶制剂销售额的 % [2], 是一种重要的工业酶制剂, 普遍存在于高等植物和微生物中, 在昆虫和原生动物中也有发现. 在微生物中, 细菌放线收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 浙江省自然科学基金 (M87) 和食品科学与工程浙江省重中之重一级学科项目 (217SIAR214) 资助 Supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang, China (M87) and the Food Science and Engineering-the Most Important Discipline Project of Zhejiang (217SIAR214) ** 通讯作者 Corresponding author ( yup922@hotmail.com) 菌和真菌都能代谢产生果胶酶 [3-4]. 碱性果胶酶在麻类的生物脱胶棉织物的精练造纸业动物饲料果胶废水预处理咖啡发酵和茶发酵等众多领域有着广泛的应用 [5-6], 具有重要的开发价值. 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)zgl14 是本实验室从土壤中分离的一株能够产碱性果胶酶的菌株. 由于该菌株所产碱性果胶酶能够分泌到胞外, 分离纯化过程相对简单 ; 但与国内外报道的其他菌株相比, 该菌株所产碱性果胶酶的活力只有 IU/ ml [7], 相对偏低. 原生质体融合育种是提高微生物产酶活力的一种有效

2 358 2 期方法. 与其他方法相比, 该方法具有广泛的随机性和适应性, 它能够使遗传物质的传递更加完整, 增加更多的基因重组机会 [8-1]. 鉴于此, 我们首先对影响枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体制备和再生的关键因素进行研究, 得到最优化条件, 为下一步通过原生质体融合育种提高该菌株产碱性果胶酶的活力提供良好基础. 1 材料与方法 1.1 材料与试剂菌种枯草芽孢杆菌 ZGL14, 来自本实验室分离的产碱性果胶酶的优良菌株主要试剂溶菌酶 L- 色氨酸和琥珀酸钠, 均购自 BBI 公司. 高渗缓冲溶液 SMM: 蔗糖.5 mol/l,mgcl 2.2 mol/ L, 顺丁烯二酸.2 mol/l, 调 ph 6.5,121 灭菌 2 min. 溶菌酶溶液 : 称取.5 g 溶菌酶, 用高渗缓冲溶液溶解并定容至 1 ml, 用无菌过滤器 ( 直径为.45 μm) 进行过滤除菌, 分装成单次使用量,- 2 保存备用. 高渗结晶紫染液 [11] : 称取结晶紫.2 g, 草酸铵.8 g, 溶解于 ml SMM 溶液中培养基 LB 液体培养基 : 胰蛋白胨 1. g, 酵母膏 5. g, NaCl 1. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 种子培养基 : 蛋白胨 1. g, 牛肉膏 3. g, 葡萄糖 1. g,nacl 5. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 8.. LB 固体培养基 : 胰蛋白胨 1. g, 酵母膏 5. g,nacl 1. g, 琼脂 2. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 再生培养基 1: 酵母膏 5. g, 胰蛋白胨 1. g,nacl 35. g, 琼脂 2 g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 7.. 再生培养基 2 [12] : 牛肉膏 5. g, 酵母膏 5. g, 蛋白胨 1. g,nacl 5. g, 葡萄糖 1. g, 蔗糖.5 mol,mgc1 2 6H 2 O.2 mol, 琼脂 2. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 7.. 再生培养基 3 [13] : 牛肉膏 5. g, 蛋白胨 1. g,nacl 5. g, 葡萄糖 1. g,cac1 2.3 mol,mgc1 2 6H 2 O.2 mol, 琥珀酸钠.3 mol,l- 色氨酸.2 g, 琼脂 2. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 7.. 以上培养基配置完成后于 121 灭菌 2 min 备用主要仪器设备 LRH 系列生化培养箱 : 上海一恒科技有限公司 ;SKY-2B 恒温培养振荡器 : 上海苏坤实业有限公司 ;Nikon Eclipse E 显微镜 : 上海泽仕光电科技有限公司 ; YXQ-LS-511 压力蒸汽灭菌器 : 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ;ZK-8D 电热恒温水浴槽 : 上海精宏实验设备有限公司 ;TGL-16M 台式离心机 : 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 ;SW-CJ-1FD 洁净工作台 : 苏州市金净净化设备科技有限公司. 1.2 试验方法菌种的活化将枯草芽孢杆菌 ZGL14 从 -8 保藏的甘油管中转接至 LB 液体培养基中,2 r/min 37 恒温振荡活化 h 枯草芽孢杆菌 ZGL14 的生长曲线取 5% 经活化后的枯草芽孢杆菌 ZGL14 菌液, 接种到装有 5 ml 种子培养基的锥形瓶中,2 r/min 37 恒温培养. 每隔 2 h 进行取样, 用酶标仪在 6 nm 处测定菌液的 D 值并记录, 以培养时间为横坐标,D 6 nm 为纵坐标, 绘制枯草芽孢杆菌 ZGL14 的生长曲线原生质体的制备取 5 ml 对数中期的菌液,8 r/min 离心 1 min 后, 收集菌体, 用无菌生理盐水洗涤两次, 再用高渗缓冲液重悬, 调整菌浓为 1 8 个 /ml, 加入溶菌酶混合均匀, 放置恒温水浴锅中酶解, 定时取样在显微镜下观察原生质体形成情况, 待视野中大部分成圆球状时终止反应. 酶解结束后 3 5 r/min 离心 2 min, 去除反应液, 收集原生质体, 用高渗缓冲液洗涤两次, 并加入等体积缓冲液重悬备用. 将酶解前菌液与酶解后的原生质体菌悬液分别用无菌生理盐水稀释涂布 LB 固体培养基,37 恒温培养 24 h, 记录菌落数, 计算原生质体形成率菌龄对原生质体形成与再生的影响分别选取 6 9 和 12 h 菌龄的枯草芽孢杆菌制备原生质体, 考察不同菌龄对原生质体形成与再生的影响溶菌酶浓度对原生质体形成与再生的影响考察溶菌酶终浓度分别为 mg/ml 时, 对原生质体形成与再生的影响酶解温度对原生质体形成与再生的影响考察酶解温度分别为时, 对原生质体形成与再生的影响酶解时间对原生质体形成与再生的影响考察酶解时间分别为 5 1 和 2 时, 对原生质体形成与再生的影响渗透压稳定剂的 ph 值对原生质体形成与再生的影响考察渗透压稳定剂的 ph 值分别为和 7.5 时, 对原生质体形成与再生的影响再生培养基类型对原生质体再生效果的影响考察 3 种不同的再生培养基对原生质体再生效果的影响再生方式对原生质体再生效果的影响考察单层培养与双层培养对原生质体再生效果的影响. 1.3 计算方法原生质体形成率计算方法 : 原生质体形成率 = X - Y X % 式中,X 为总菌落数, 即未经溶菌酶处理的菌体在 LB 固体培养基上形成的菌落数,Y 为溶菌酶处理后菌体在 LB 固体培养基上形成的菌落数原生质体再生率计算方法 : 原生质体再生率 = Z - Y X - Y % 式中,X 为总菌落数, 即未经溶菌酶处理的菌体在 LB 固体培养基上形成的菌落数,Y 为溶菌酶处理后菌体在 LB 固体培养基上形成的菌落数,Z 为再生菌落数, 即溶菌酶处理后菌体在再生培养基上形成的菌落数. 2 结果与分析 2.1 枯草芽孢杆菌 ZGL14 的生长曲线枯草芽孢杆菌 ZGL14 的生长曲线如图 1 所示. 由图 1 可知, 枯草芽孢杆菌 ZGL14 经活化后, 大约培养 3 h 进入对数生长期, 持续至 14 h 后, 生长趋于平稳, 进入稳定期. 2.2 菌龄对原生质体形成和再生的影响本研究在 37, 溶菌酶浓度.2 mg/ml, 酶解时间 1 min 和渗透压稳定剂 ph 值为 6.5 的条件下, 分别考察了不同菌龄对枯草芽孢杆菌原生质体形成与再生的影响, 实验结果如图 2 所示. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

3 24 卷于平等 359 D 6 nm t/h 图 1 枯草芽孢杆菌 BGL14 的生长曲线. Fig. 1 Growth curve of Bacillus subtilis ZGL14. Formation rate Regeneration rate Cell age (t/h) 图 2 菌龄对原生质体形成与再生的影响. Fig. 2 Effect of cell age on the protoplast formation and regeneration. 从图 2 可以看出, 处于对数中前期的原生质体形成率达 99% 以上, 说明此时菌体的细胞壁均已被完全去除, 后期及稳定期原生质体形成率有所下降, 原因可能是细胞形态和生理特征趋于稳定, 细胞壁的完整性较高, 酶解效果有所降低. 由此可知, 生长时期的不同, 菌体细胞对溶菌酶的敏感程度也不同, 处于对数中前期的枯草芽孢杆菌经酶解以后能够得到更多的原生质体. 原生质体的再生率也受到菌龄的影响, 对数前期的再生率较对数中期的再生率低, 原因可能是因为对数前期的菌体细胞器发育不完全, 细胞壁的合成生理机制处于发展阶段, 所以原生质体再生能力较低 ; 对数中期的菌体各项生理调控机制完善, 有利于细胞壁的合成, 再生效果好. 综合考虑, 在后续试验中采用培养至 9 h 的菌体来进行原生质体的制备和再生条件的研究. 2.3 溶菌酶浓度对原生质体形成和再生的影响研究了溶菌酶浓度对原生质体形成和再生情况的影响, 结果如图 3 所示. 从图 3 可以看出, 随着溶菌酶浓度的增加, 原生质体的形成率逐渐增大, 在浓度为.2 mg/ml 和.4 mg/ml 时,1 min 的酶解效果已使原生质体形成率达到 99%. 根据文献报道, 有的菌种在制备原生质体过程中要加入青霉素或甘氨酸来抑制细胞壁的合成, 或酶解时间长达 1 h 以上. 相比之下, 本实验菌株的细胞壁对溶菌酶非常敏感, 溶菌酶浓度为.4 mg/ ml 时的再生率明显低于.2 mg/ml, 仅为 6.96%, 推测可能是酶浓度过大导致细胞壁裂解过于彻底, 再生过程中细胞壁重新形成困难, 另外酶对细胞也有一定的伤害作用 ; 而浓度为.5 mg/ml 时, 虽再生率高, 达.89%, 但是由于溶菌酶浓度过低, 制备所得的原生质体数量相对较少. 综合考虑原生质体形成率与再生效果, 后续试验中溶菌酶的浓度选用.2 mg/ml 较为适宜. 2.4 酶解时间对原生质体形成和再生的影响探讨了在 37 水浴条件下, 采用浓度为.2 mg/ml 的溶菌酶分别酶解 min 时, 其原生质体的形成率与再生率如图 4 所示 Formation rate Regeneration rate Enzymolysis time (t/min) 图 4 酶解时间对原生质体形成和再生的影响. Fig. 4 Effect of different enzymolysis times on the protoplast formation and regeneration. 图 4 结果表明, 随着酶解时间的延长, 原生质体形成率逐渐增加, 但是增长趋势逐渐趋于平缓. 酶解时间为 5 min 时, 原生质体形成率最低, 为 92.1%, 酶解 1 min 以后, 原生质体形成率均达到 99%, 即当酶解时间达到一定时, 再延长酶解时间, 原生质体形成率无明显增加 ; 相反, 酶解时间过久, 原生质体的再生率大大降低, 酶解 min 所得的原生质体再生率为 2.3%,2 min 所得的原生质体再生率仅为 1.57%. 由上述试验结果可知, 经.2 mg/ml 溶菌酶酶解 1 min 后, 原生质体形成率和再生率分别为 99.2% 和 19.7%, 原生质体形成与再生情况均为良好, 因此, 酶解时间选择 1 min 作为制备原生质体的最适条件之一. 2.5 酶解温度对原生质体形成和再生的影响探讨了终浓度为.2 mg/ml 的溶菌酶分别在下酶解 1 min 时, 原生质体形成率和再生率的差异, 实验结果如图 5 所示 Lysozyme concentration (ρ/mg ml -1 ) 图 3 溶菌酶浓度对原生质体形成和再生的影响. Fig. 3 Effect of the lysozyme concentration on the protoplast formation and regeneration Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

36 2 期 9 8 27 32 37 42 Enzymolysis temperature (θ/ ) 图 5 酶解温度对原生质体形成和再生的影响. Fig. 5 Effect of different enzymolysis temperatures on the protoplast formation and regeneration.

4 36 2 期 Enzymolysis temperature (θ/ ) 图 5 酶解温度对原生质体形成和再生的影响. Fig. 5 Effect of different enzymolysis temperatures on the protoplast formation and regeneration. 实验结果表明, 原生质体形成率随着酶解温度的升高而不断增大, 当酶解温度为 42 时, 原生质体形成率达到最大, 为 99.7%, 但是同时其原生质体再生率也为最低, 仅为 4.2%,37 酶解所得的原生质体形成率与 42 所得较为相近, 不过其原生质体再生率也不高 ; 而相比之下, 当酶解温度为 32 时, 其原生质体形成率为 98.1%, 原生质体再生率则为 27.3%, 分别是 37 和 42 下的 1.4 倍和 6.5 倍. 因此, 后续试验中采用 32 作为制备枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体的最适温度. 2.6 渗透压稳定剂的 ph 值对原生质体形成和再生的影响采用 ph 值分别为和 7.5 的渗透压稳定剂,32 水浴中, 浓度为.2 mg/ml 的溶菌酶酶解 1 min, 计算各自的原生质体形成率和再生率, 实验结果如图 6 所示 ph ph value of osmotic stabilizer 图 6 渗透压稳定剂的 ph 值对原生质体形成和再生的影响. Fig. 6 Effect of ph values of osmotic stabilizer on the protoplast formation and regeneration. 从图 6 可以看出, 当渗透压稳定剂的 ph 值为 7. 时, 其原生质体形成率与再生率均达到最高, 分别为 99.3% 和 34.1%, 说明原生质体在渗透压稳定剂的 ph 值为 7. 时, 细胞最为稳定, 因此原生质体制备的最适渗透压稳定剂的 ph 值为再生培养基组分对原生质体再生的影响再生培养基的组分是影响原生质体再生率的关键因素之一 : 一方面要考虑原生质体的再生要合成细胞壁, 因此要在培养基中加入一些合成细胞壁的前体物质和促进细胞壁合成的金属离子 ; 另一方面要考虑原生质体没有细胞壁的保护, 对周围环境十分敏感, 因此要营造一个等渗透压力的环境, 防止原生质体自身破裂死伤. 选取了 3 种再生培养基研究其对原生质体再生效果的影响, 其结果如表 1 所示. 表 1 再生培养基组分对原生质体再生的影响 Table 1 Effect of regeneration medium compositions on the protoplast regeneration 再生培养基原生质体再生率 Regeneration medium Regeneration rate of protoplast (r/%) ± ± ±.29 将表 1 中的数据进行分析比较, 可以看出再生培养基 1 和 2 的原生质体再生率低, 不适合原生质体的再生, 原因可能是它们的营养不够全面, 无法供给原生质体再生所需的营养物质. 再生培养基 3 的营养相对丰富和全面, 除了基本碳源氮源外, 还添加了琥珀酸钠和 L- 色氨酸. L- 色氨酸可以参与细胞壁的重建, 琥珀酸钠一方面作为渗透压稳定剂, 另一方面作为各个循环的中间产物, 参与细胞壁前体物质的合成. 再生培养基 3 的原生质体再生率分别是其他两种再生培养基的 24.8 倍和 14.9 倍. 因此, 选取再生培养基 3 作为原生质体再生的最佳再生培养基. 2.8 再生方式对原生质体再生效果的影响图 7 显示了原生质体制备和再生的情况. 从该图可以看出, 原生质体制备和再生的效果较好. 将制备好的原生质体涂布于再生培养基 3 中, 研究单层培养与双层培养对原生质体再生效果的影响, 结果显示单层培养效果好于双层培养. 除此之外, 双层培养的菌体生长过程会迅速连成一片, 不利于以后重组菌种的筛选, 因此再生培养以单层培养为宜. 图 7 原生质体制备和再生图. Fig. 7 Photograph of the protoplast preparation and regeneration. 3 讨论与结论原生质体融合技术具有重组频率高操作简单等一系列优点, 在微生物育种领域已经发展成为一种快速有效选育菌株的手段, 且得到了越来越广泛的应用. 本文通过对枯草芽孢杆菌原生质体的制备与再生条件进行研究, 可为基因组改组技术选育优良菌株提供基础. 影响原生质体制备的因素很多, 由于不同微生物的生理构造和细胞壁组成成分不同, 所以制备原生质体的条件也不同. 第一步要去除包裹原生质体的细胞壁. 有研究表明, 有些菌体在酶解前, 要在培养基中加入青霉素和甘氨酸进行预处理 [14], 使菌体合成细胞壁途径受阻, 使其对溶菌酶敏感, 从应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

5 24 卷于平等 361 而可减少作用时间, 获得大量原生质体 ; 除此之外, 酶解时间和温度对原生质体制备的影响也很大, 酶都有其最适作用温度, 温度过高或过低都会增加作用时间, 从而增加对细胞的伤害, 不利于再生. 本研究通过对枯草芽孢杆菌 ZGL14 原生质体制备的条件进行优化, 可使原生质体形成率在 99% 左右. 原生质体的再生主要考察了再生培养基组分以及再生方式等的影响. 去除细胞壁后, 原生质体会自发变成圆球状, 不能正常繁殖, 要获得完整的细胞结构就必须重新合成细胞壁. 再生培养基一方面提供原生质体稳定的渗透压, 避免原生质体破裂死亡 ; 另一方面提供原生质体合成细胞壁的前体物质, 以利于再生. 研究表明, 再生培养基中添加琥珀酸钠和 L- 色氨酸有利于原生质体的再生. 再生培养方式研究表明, 单层培养的再生效果较好. 本研究得到的原生质体制备的最优条件为菌龄 9 h, 溶菌酶浓度.2 mg/ml, 酶解时间 1 min, 酶解温度 32, 渗透压稳定剂的 ph 值 7.. 原生质体再生的最佳培养基为牛肉膏 5. g, 蛋白胨 1. g,nacl 5. g, 葡萄糖 1. g,cac1 2.3 mol,mgc1 2 6H 2 O.2 mol, 琥珀酸钠.3 mol,l- 色氨酸.2 g, 琼脂 2. g, 双蒸水定容至 1 L, 调 ph 为 7.. 参考文献 [References] 1 Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review [J]. Bioresour Technol, 21, 77 (3): Sharma N, Rathore M, Sharma M. Microbial pectinase: sources, characterization and applications [J]. Rev Environ Sci Bio/Technol, 213, 12 (1): Li YH, Hardin IR. Enzymatic scouring of cotton-surfactants, agitation, and selection of enzymes [J]. Textile Chem Color, 1998, (9): 刘惠娟, 陈晟, 华兆哲, 堵国成, 陈坚. 纺织清洁生产用碱性果胶酶的研究进展 [C]. 功能性纺织品及纳米技术应用研讨会, 无锡, 27 [Liu HJ, Chen S, Hua ZZ, Du GC, Chen J. Research progress of alkaline pectinase for textile clearing production [C]. Symposium on Functional Textiles and Nanotechnology Applications, Wuxi, 27] 5 董毅, 陈嘉川, 姜伟, 杨桂花. 果胶酶处理改善 APMP 质量的研究 [J]. 造纸化学品, 29, 21 (4): 2-5 [Dong Y, Chen JC, Jiang W, Yang GH. A study on quality improvement of APMP by pectinase [J]. Paper Chem, 29, 21 (4): 2-5] 6 Hoondal G, Tiwari R, Tewari R, Beg QK. Microbial alkaline pectinases and their industrial applications: a review [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 22, 59 (4): 李倩. 高产碱性果胶酶菌株筛选发酵条件优化及酶学性质的研究 [D]. 杭州 : 浙江工商大学, 214 [Li Q. Study on screening, fermentation optimizing and enzymatic properties of high yield alkaline pectinase strain [D]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 214] 8 王登字, 臧威, 孙剑秋, 蒋本庆, 王鹏, 李铁. 细菌原生质体融合育种技术及其应用进展 [J]. 中国酿造, 28, 7 (1): 1-6 [Wang DY, Zang W, Sun JQ, Jiang BQ, Wang P, Li T. Application of bacteria protoplast fusion technique in genetic breeding [J]. China Brew, 28, 7 (1): 1-6] 9 谭周进, 杨海君, 林曙, 吴铁. 利用原生质体融合技术选育微生物菌种 [J]. 核农学报, 25, 19 (1): [Tan ZJ, Yang HJ, Lin S, Wu T. Protoplast fusion technology and microbial breeding [J]. Acta Agric Nucleatae Sin, 25, 19 (1): 71-75] 1 吴承龙. 枯草芽孢杆菌原生质体转化的初步研究 [J]. 贵阳医学院学报, 19, 2 (3): [Wu CL. Preliminary study of protoplast transformation of Bacillus subtilis [J]. J Guiyang Med College, 19, 2 (3): ] 11 杨世辉, 方呈祥, 张珞珍. 一种光学显微镜下观察原生质体的染色方法 [J]. 微生物学通报, 2, 27 (1): [Yang SH, Fang CX, Zhang GZ. A staining method used for observing protoplast under the light microscope [J]. Microbiology, 2, 27 (1): 55-57] 12 胡欣荣. 利用原生质体融合技术选育高纤维素酶活枯草芽孢杆菌的研究 [D]. 西安 : 西北大学, 26 [Hu XR. Studies on breeding of high cellulase-producing Bacillus subtilis by the protoplast fusion technology [D]. Xi an: Northwest University, 26] 13 张莉. 枯草芽孢杆菌 BS1 Surfactin 高产菌株的选育研究 [D]. 南京 : 南京农业大学, 213 [Zhang L. Studies on breeding of high BS1 surfactin-producing Bacillus subtilis [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 213] 14 王登宇, 臧威, 孙剑秋, 蒋本庆, 王鹏, 李轶. 细菌原生质体融合育种技术及其应用进展 [J]. 中国酿造, 28, 27 (4): 1-6 [Wang DY, Zang W, Sun JQ, Jiang BQ, Wang P, Li Y. Application of bacteria protoplast fusion technique in genetic breeding [J]. China Brew, 28, 27 (4): 1-6] Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

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