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1 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2005, 57 (2): 研究论文胞外钙对豚鼠耳蜗 Deiters 细胞钾电流的调制常青 1, 龚树生 1,*, 丁娟 1, 唐明 2, Jürgen Hescheler 3 1 华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科, 2 同济医学院生理学教研室, 武汉 ; 3 德国科隆大学神经生理系摘要 : 为观察胞外钙对豚鼠耳蜗单个离体 Deiters 细胞钾电流的调控作用并探讨其机制, 实验记录了 Deiters 细胞在正常细胞外液和无钙外液中的全细胞钾电流 (whole cell K + currents, I K ), 并分析了其电生理学特性的改变结果观察到,Deiters 细胞与在正常细胞外液中相比, 在祛除细胞外液中的 Ca 2+ 后,I K 电流幅值明显增加, 弦电导值亦明显增加, 但其平衡电位未明显改变在无钙外液中,I K 电流的反转电位向超极化方向明显移位, 更接近于按照 Nernst 方程得出的 K + 理论平衡电位 ; 而且其稳态激活曲线亦向超极化方向明显移位, 但其激活趋势与正常相比无明显改变此外, 观察了 Deiters 细胞中钙抑制性钾电流的电流 - 电压关系和电导 - 电压关系, 发现两者均呈 S 形, 提示此钙抑制性钾电流可能存在 2 种不同的钾电导成分由此, 推测可能有两种机制参与胞外钙对 Deiters 细胞钾电流的调控 :(1) Deiters 细胞中的 I K 通道可能存在一个 Ca 2+ 敏感结构域, 胞外 Ca 2+ 可能通过改变此结构域而对 I K 电流产生调制 ;(2) Deiters 细胞中可能存在一种新型的双相门控性钾通道或钾通道耦联型受体或是一种新型的钾通道亚型, 祛除胞外 Ca 2+ 可激活此新型钾电导而对 I K 电流产生调制由此推测, 在听觉形成过程中, 胞外钙浓度下降可以对 Deiters 细胞的全细胞钾电流产生调制, 从而更有利于 Deiters 细胞内 K + 外流, 进而有效地缓冲外毛细胞周围的 K + 浓度 ; 而且还可以使 Deiters 细胞产生更快的复极化并有利于维持其静息状态关键词 : 耳蜗 ;Deiters 细胞 ; 胞外钙 ; 全细胞钾电流 ; 调制中图分类号 :Q437 Extracellular calcium modulates the whole cell potassium currents in Deiters cells isolated from guinea pig cochlea CHANG Qing 1, GONG Shu-Sheng 1,*, DING Juan, TANG Ming 2, Jürgen Hescheler 3 1 Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital; 2 Department of Physiology, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan ,China; 3 Institut Fuer Neurophysiologie Universitaet zu Koeln Robert-Koch Str.39,Germany Abstract: To study the modulatory effect of extracellular calcium on the whole cell K + currents (I K ) in isolated Deiters cells, the whole cell K + currents were recorded when Deiters cells bathed in normal physiological solutions and calcium-free saline, respectively. The electrophysiological characteristics of I K currents were then analyzed with the patch clamp technique. Removing extracellular calcium significantly enhanced the amplitude of the I K currents, which increased by 70.2% at +50 mv test pulse. The chord conductance, measured at 30 mv test pulse, also significantly increased from (3.31 ± 3.08) ns (n=42) in the normal solutions to (10.81 ± 6.01) ns (n=42) in the calcium-free solutions, whereas, the zero current potential of the I K currents remained unchanged. In calcium-free solutions, the reversal potential of the I K currents was shifted to the direction of hyperpolarization, which was very close to the equilibrium K + potential based on the Nernst equation. In addition, both the steady state activation curve and the half activation potential, with the averaged value at ( ± 5.64) mv (n=42), were shifted to the negative. However, the tendency for activation (slope conductances) was the same as that in the normal solutions. Interestingly, both the I-V and the G-V functions deduced from the calcium-inhibited K + currents in Deiters cells were S shape, implying that at least two different kinds of K + conductance were involved in this calcium-inhibited K + currents. Received Accepted This work was supported by the Teaching and Research Award Program for Outstanding Young Teachers in Higher Education Institutions of Ministry of Education and the National Natural Science Foundation of China (No ) * Corresponding author. Tel: ; Fax: ; gongss@mails.tjmu.edu.cn

2 218 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2005, 57(2): In summary, we hypothesize that there are two mechanisms for this modulation: one is that the I K channels in Deiters cells containing a specific calcium sensitive domain, by which extracellular calcium modulates the structure of the K + channels and then the I K currents; the other is a novel double gated K + channel or an ionotropic receptor coupled to K + channels or a new subtype of outward K + channels. Removing extracellular calcium activates this novel conductance and then modulates the I K currents. These results indicate that a decrease in extracellular calcium not only facilitates the efflux of K + out of Deiters cells but also accelerates the repolorization by enhancing the I K currents, which in turn can effectively buffer the K + concentration around the outer hair cells and maintain the resting membrane potential of Deiters cells. Key words: cochlea; Deiters cells; extracellular calcium; whole cell K + currents; modulation 豚鼠耳蜗 Deiters 细胞不仅可以主动和被动地参与调节耳蜗放大机制 [1], 而且还能够主动地参与耳蜗 K + 再循环 [2,3], 在听觉生理过程中起着十分重要的作用以往对 Deiters 细胞的电生理学研究表明, 外向性钾电流是其主要的膜电流, 可能是由电压依赖性钾通道 (voltage-dependent K + channels, K V ) Shaker 家族中的 K V 1.5 亚型介导形成的 [4,5] 最近有研究发现, 胞外二价阳离子对重组的人类 K V 1.5 通道有调制作用 [6] ; 而且在声音感受过程中, 由于 Corti 淋巴中的 Ca 2+ 进入外毛细胞, 可使得邻近 Deiters 细胞外环境中的 Ca 2+ 浓度降低 [2,7] 为观察祛除胞外 Ca 2+ 对豚鼠耳蜗 Deiters 细胞全细胞钾电流 (whole cell K + currents, I K ) 的调制作用并探讨其作用机制, 我们运用全细胞膜片钳技术, 记录并分析了 I K 电流在正常细胞外液和无钙外液中电生理学特性, 以期为进一步了解 Deiters 细胞在听觉生理中的作用提供一些理论依据 1 材料和方法 1.1 Deiters 细胞分离取健康杂色豚鼠 ( 华中科技大学同济医学院实验动物中心提供 ), 耳廓反射灵敏, 雌雄不拘, 体重 200~300 g 快速断头, 取出听泡, 置于含有正常细胞外液 (Hank 平衡液 ) 的平皿中在解剖显微镜下, 用细钢针剔除蜗壳, 暴露蜗轴在听神经孔处将蜗轴离断, 将其转移到另一含有 Hank 平衡液的平皿中, 撕去螺旋韧带, 剥离出基底膜, 转移到含有木瓜蛋白酶 ( 终浓度为 0.25 mg/ml) 的灌流槽中, 消化 13 min 后, 加入 Hank 平衡液终止消化并吹打数次静置约 30 min, 在倒 [4] 置显微镜下观察, 并根据 Deiters 细胞的形态学特性 ( 呈逗点状, 由胞体指突和细柄三部分组成 ), 选择活性良好的单个 Deiters 细胞, 实验用细胞均为单个离体细胞所有操作均在室温下完成 (20~25 ) 1.2 全细胞电压钳记录采用全细胞膜片电压钳技术, 记录 Deiters 细胞的全细胞膜电流两步法拉制电极, 入水电阻 3~5 MΩ 在胞核处封接, 封接电阻达吉欧 (gigaseal,gω) 以上, 给予负压, 使细胞破膜形成全细胞记录模式膜片钳放大器为 Axopatch 200-A 放大器 (Axon Instruments,CA, USA), 与计算机相连由 ISO2 软件 (MFK 公司, Frankfurt,Germany) 完成刺激信号及电压输入信号的采集, 信号采集频率 10 khz, 滤波频率 2 khz, 放大器增益为 2 根据公式 E K = (RT/F)*ln([K] o /[K] i ) 计算 K + 的理论平衡电位 (E K ), 即 E K =2.303(RT/F) log 10 ([K] o /[K] i ) 采样后数据存盘, 实验完成后, 用 ISO2 软件 Microsoft Excel 2000 (Microsoft 公司,USA) SigmaPlot 2000 (SPSS Inc. Chicago, USA) 及 Origin 5.0 (USA) 分析结果用 mean ± SD 表示 1.3 实验条件溶液及试剂含 Deiters 细胞的正常细胞外液置于倒置显微镜 (Zeiss,Axovert- 100,Germany) 的灌流槽中所用玻璃毛坯由南京六合县泉水教学实验器材厂生产正常细胞外液成分 (mmol/l): NaCl 150 KCl 5 CaCl 2 2 MgCl 2 1 Hepes 10 D-glucose 10 用 1 mol/l NaOH 调节 ph 为 7.4, 调节渗透压为 (300 ± 2) mmol/l, 使用前经 95% O 2 和 5% CO 2 饱和电极内液成分 (mmol/l): KCl 140 CaCl MgCl 2 5 Na 2 ATP 5 Hepes 10 EGTA 5 用 1 mol/l KOH 调节 ph 为 7.2, 调节渗透压为 (290 ± 2) mmol/l 无钙细胞外液成分 (mmol/l): NaCl 154 KCl 5 MgCl 2 1 D-glucose 10 Hepes 10 用 1 mol/l NaOH 调节 ph 为 7.4, 调节渗透压为 (300 ± 2) mmol/l, 使用前经 95% O 2 和 5% CO 2 饱和木瓜蛋白酶 (papain) Na 2 ATP Hepes EGTA 均为 Sigma 公司产品 ( 美国 ), 其余药品为国产分析纯

3 常青等 : 胞外钙对豚鼠耳蜗 Deiters 细胞钾电流的调制 219 图 1. 1 个单个离体 Deiters 细胞在正常细胞外液 (A) 和无钙外液 (B) 中的 I K 电流 Fig. 1. I K currents elicited from a Deiters cell in the normal solutions (A) and in the calcium-free solutions (B). Removing extracellular calcium could not only increase the magnitudes of the outward currents but also elicit the tail currents at the end of the stimulation. However, neither in the normal solutions nor in the calcium-free solutions were the inward currents recorded. 2 结果 2.1 胞外钙对 Deiters 细胞全细胞钾电流的影响钳制电压为 70 mv, 阶跃电压从 +50 mv 到 110 mv 逐渐超极化 ( 阶跃电压 10 mv, 持续时间 150 ms), 分别记录 Deiters 细胞在正常细胞外液和无钙外液中的全细胞钾电流 (I K, 图 1) 在无钙外液中, 去极化电压刺激可引出逐渐增大的外向电流 ; 且刺激结束时, 此外向电流未见明显失活, 表现出一定的尾电流在正常细胞外液和无钙外液中均未记录到明显的内向电流取稳态电流幅值 ( 刺激结束前 10 ms 至结束之间的电流均值 ), 分别做出 Deiters 细胞的 I K 电流在正常细胞外液和无钙外液中的稳态电流 - 电压关系 ( 图 2) 可以看出, 在无钙外液中,+50 mv 的刺激电压引出的 I K 电流的稳态电流幅值约为 (6.67 ± 2.06) na(n=42), 较其在正常细胞外液中的稳态电流值 [(3.92 ± 2.1) na,n=42] 增大了 70.2%, 两者相比, 具有极其显著性差异 (t = ,P<0.01); 但在无钙外液中,Deiters 细胞 I K 电流的零电流电位 ( 平衡电位,E K ) 约为 70 mv, 与其在正常细胞外液中相比, 未发生明显移位为进一步观察在无钙外液中,Deiters 细胞 I K 电流弦电导 (chord conductance) 的变化, 我们分别测量了刺激电压为 30 mv 时,I K 电流在正常细胞外液和无钙外液中的稳态电流幅值, 并根据改良的欧姆定律, 即 G=I/(V m E K ), 计算出相应的弦电导值结果发现, 在正常细胞外液中, 30 mv 时 I K 电流的弦电导为 (3.31 ± 3.08) ns (n=42); 而在无钙外液中, 在同样的膜电位情况下 ( 30 mv),i K 电流的弦电导增大为 (10.81 ± 6.01) ns (n=42) 图个单个离体 Deiters 细胞在正常细胞外液 ( ) 和无钙外液 ( ) 中 I K 电流的电流 - 电压关系 Fig. 2. Current-voltage relation obtained from the whole cell currents of 42 Deiters cells in standard solutions ( ) and the calcium-free solutions ( ). The outward K + currents in calciumfree solutions showed a strong voltage dependency and outward rectifier. However, the equilibrium potential remained unchanged.

4 220 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2005, 57(2): 胞外钙对 Deiters 细胞 I K 电流瞬时电流 - 电压关系的影响给予双脉冲刺激电压 ( 钳制电压 70 mv, 条件刺激电压 +50 mv, 刺激电压从 +40 mv 以 10 mv 为阶跃逐渐超极化到 110 mv, 持续时间 150 ms), 记录 Deiters 细胞 I K 电流在正常细胞外液 ( 未显示 ) 和无钙外液中的尾电流 ( 图 3) 测量阶跃电压引出的瞬时尾电流幅值 ( 刺激电压开始 3 ms 内 ), 对应相应的刺激电压, 分别做出 I K 电流在正常细胞外液和无钙外液中的瞬时尾电流 - 电压关系 ( 图 4) 可以看出, 在正常细胞外液中,I K 电流的零电流电位 ( 反转电位,E rev ) 为 ( ± 2.34) mv(n=42); 而在无钙外液中, 其反转电位变为 ( ± 1.81) mv (n=42), 向超极化方向明显移位, 而且非常接近于按照 Nernst 方程得到的 K + 理论平衡电位 2.3 胞外钙对 Deiters 细胞 I K 电流激活动力学的影响钳制电压为 70 mv, 预刺激电压从 +50 mv 逐图个单个离体 Deiters 细胞的 I K 电流在正常细胞外液 ( ) 和无钙外液中 ( ) 的瞬时尾电流 - 电压曲线 Fig. 4. Current-voltage relation of the instantaneous tail currents recorded from 42 Deiters cells in the normal solutions ( ) and in the calcium-free solutions ( ) respectively. Both the curves were linear like and the latter curve demonstrated the reversal potential was ( ± 1.81) mv, which was shifted to the negative direction. 图 5. 1 个单个离体 Deiters 细胞的 I K 电流在无钙外液中的稳态激活过程 Fig. 5. Steady state activation process of I K currents of one Deiters cell in the calcium-free solutions. It was demonstrated that at the prepulse potential of 60 mv, the tail currents elicited by the 30 mv test pulse was the minimum. 图 3. 1 个单个离体 Deiters 细胞的 I K 电流在无钙细胞外液中的瞬时尾电流 Fig. 3. Instantaneous tail currents elicited by a two-pulse potential from a Deiters cell in the calcium-free solutions. The tail currents were asymmetrical and reversed from outward direction to inward at the test potential of 90 mv. 渐超极化至 90 mv( 阶跃电压 10 mv), 刺激电压 30 mv, 持续时间均为 100 ms, 记录 Deiters 细胞 I K 电流在无钙外液中的激活过程 ( 图 5), 可见在钳制膜电位 60 mv 时, 30 mv 的刺激电压引出的尾电流最小分别测量刺激电压为 30 mv 时的瞬时尾电流幅值 ( 刺激电压开始 3 ms 内 ), 并除以最大的尾电流幅值, 得出标准化的尾电流值, 再用 Boltzmann 方程拟和, 可得到 I K 电流在无钙细胞外液中的激活曲线 ( 图 6) 可以看出, 在无钙外液中,I K 电流在膜电位为 60 mv 附近开始激活, 当膜电位去极化到 +40 mv 时,I K 电流达到最大激活, 激活过程具

5 常青等 : 胞外钙对豚鼠耳蜗 Deiters 细胞钾电流的调制 221 图 6. Deiters 细胞的 I K 电流分别在无钙外液 ( ) 和正常细胞外液 ( ) 中的稳态激活动力学曲线 Fig. 6. Steady state activation curves of I K currents of Deiters cells in the calcium-free solutions ( ) and in the normal solutions ( ). The former curve ( ) was shifted to the hyperpolarized direction, whereas both of the two curves were S shape and had the similar activation tendency. 有明显的电压依赖性本实验得到 I K 电流在无钙外液中的半量激活电压 (V 1/2 ) 为 ( ± 5.64) mv (n=42), 斜率电导为 (13.93 ± 1.47) mv(n=42); 而在正常细胞外液中, 给予同样的刺激电压, 得到 I K 电流的半量激活电压为 (10.76 ± 6.47) mv (n=42), 斜率电导为 (15.08 ± 1.59) mv(n=42) 可以看出, 在无钙外液中,I K 电流的半量激活电压向超极化方向明显移位, 但两者之间的斜率电导相差不大 2.4 Deiters 细胞中的钙抑制性钾电流分别测量 Deiters 细胞在正常细胞外液和无钙外液中 I K 电流的稳态电流幅值并相减, 可得出一个稳态电流幅值, 再与相对应的刺激阶跃电压作图, 得到了 Deiters 细胞中由于祛除胞外钙而引起的一种新的钾电流成分 ( 我们称之为钙抑制性钾电流,Ca 2+ - inhibited K + currents) 的电流 - 电压关系 ( 图 7) 可见此钙抑制性钾电流的零电流电位 ( 平衡电位 ) 仍接近于 70 mv, 而且其电流 - 电压关系为非线性, 并具有一定的电压依赖性和外向整流性, 但其电压依赖性非常特殊, 即在刺激电压介于 60 mv 和 10 mv 之间时, 随着刺激电压的增大, 电流逐渐增大, 且电流幅值较其在正常细胞外液中增大 ; 而在 10 mv 以上, 随着刺激电压的增加, 电流的增加较缓慢, 且电流幅值较正常值减少, 即此电流 - 电压关系表现出一定的电压区间性由改良的欧姆定律, 可得到此钙抑制性钾电流的电导 - 电压关系 ( 图 8), 可以图个 Deiters 细胞正常的电流 - 电压关系 ( ) 和钙抑制性钾电流的电流 - 电压关系 ( ) Fig. 7. Current-voltage relations deduced from the I K currents( ) and the calcium-inhibited K + currents ( ),both of which were voltage-dependent. The magnitude of the calcium-inhibited K + currents was slowly increased as the test potential was depolarized gradually. However, the enhancement of the K + currents showed a voltage limitation. At the test pulse of +10 mv, the amplitude of the calcium-inhibited K + currents was almost equal to the normal. 看出, 此弦电导在 60 mv 附近开始激活, 在刺激电压为 0 mv 时, 电导达到最大 ; 在 0 mv 以上, 随着刺激电压的增加, 电导的增加非常缓慢, 使得整个 G-V 曲线呈现为 S 形图个 Deiters 细胞中钙抑制性钾电流的电导 - 电压关系 Fig. 8. Chord conductance-voltage relation of the calcium-inhibited K + currents in 42 Deiters cells, which was shown as S curve. It was demonstrated that the chord conductance began to activate at the test potential of 60 mv, and activated almost fully at 0 mv. Then the chord conductance increased very slowly at the varied test potentials positive to 0 mv.

6 222 3 讨论现有的电生理学研究证实, 豚鼠耳蜗 Deiters 细胞主要表达一种电压依赖性的外向钾电流 (I K ) [4,5], 故本实验研究主要观察了胞外钙对 I K 电流电生理学特性的影响我们在实验中, 采用无钙外液置换正常细胞外液, 以观察祛除胞外 Ca 2+ 对 Deiters 细胞 I K 电流的影响结果发现, 在无钙外液中,I K 电流的稳态电流幅值较其在正常细胞外液中明显增大, 由于 Deiters 细胞 I K 电流的 I-V 曲线为非线性, 因此我们根据改良的欧姆定律, 即 I=(V m - E K )/R=(V m - E K )*G(V m 为刺激电压,E K 代表 I K 电流的平衡电位 ), 推测其原因可能有 :(1) 驱使 Deiters 细胞中 K + 外流的驱动力增加, 这种动力由腔内外电化学梯度决定, 即由电梯度 (V m - E K ) 和化学梯度共同决定 ; (2) Deiters 细胞膜中允许 K + 通过的钾电导增加 ; (3) Deiters 细胞膜中开放的钾电导和使 K + 外流的驱动力都增加在无钙外液中, 由于细胞内外液中的 K + 浓度没有改变, 即驱使 K + 外流的化学梯度没有改变 ; 而且从 I K 电流的稳态电流 - 电压关系可以看出, I K 电流的平衡电位 (E K ) 不发生改变, 因此, 在相同的刺激电压 (V m ) 下, 驱使 K + 外流的电驱动力并没有增加这表明在无钙外液中, 驱使 K + 外流的电化学梯度并无改变, 但其电导值却明显增加故我们认为, 在实验中祛除细胞外液中的 Ca 2+ 后, 使得 Deiters 细胞的钾电导增加, 进而增大了 I K 电流幅值, 即胞外钙主要是通过改变 Deiters 细胞的钾电导而对 I K 电流产生负性调制因为我们在实验中, 采用的是全细胞膜片钳记录方式, 故 Deiters 细胞钾电导的增加又取决于三个因素 :(1) I K 通道电导的增加, 由于我们在实验过程中并没有改变细胞内外液中的 K + 浓度, 故电导的增加主要取决于 I K 通道的通透性 (permeability), 而通道的通透性又是由其本身的内在结构所决定 ;(2) Deiters 细胞中允许 K + 通透的总的电导增加, 即 K + 除经传统的 I K 钾通道外流外, 还可能经由其它的通道电导 ( 如祛除胞外钙后激活一种新型的钾电导或非选择性阳离子通道电导 ) 外流 ;(3) Deiters 细胞中的 K-Cl 共载体 Kcc4 在无钙外液中转运效率增加因为 Boettger 等证实 Kcc4 并不受胞内外钙的调控 [8], 而且 Nevov 等曾报道在 Deiters 细胞中不存在非选择性阳离子通道 [4], 因此我们推测, 胞外钙可能是通过调控特异性的钾通道 (I K 通道和 / 或一种新型的钾通道 ), 而不是通过非选择性的阳离子通道或者 Kcc4 共载体来调控的 I K 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2005, 57(2): 电流我们进一步观察了祛除胞外 Ca 2+ 对 Deiters 细胞 I K 电流激活过程的影响结果显示, 在无钙外液中,I K 电流的稳态激活曲线向超极化方向明显移位, 即 I K 电流的半量激活电压较其在正常细胞外液中变得更负, 表明在无钙外液中,I K 电流的电压敏感性增加提示祛除胞外 Ca 2+ 可能影响了 I K 通道中的电压敏感结构域 (S4), 从而使得 I K 电流在更负的电压下便能激活 [9] 有趣的是, 在无钙外液中 I K 电流的斜率电导与其在正常细胞外液中很相近 [4,5], 表明 I K 通道的激活趋势与其在正常细胞外液中非常相似, 提示在无钙外液中,I K 通道从关闭状态到开放状态的开启过程并没有受到影响此外, 我们还发现, 在无钙外液中 I K 电流的反转电位 (E rev ) 较其在正常外液中向超极化方向明显移位, 更接近于 K + 理论平衡电位, 表明此钾电流成分完全是由 K + 外流介导形成的, 不存在其它离子成分的流动提示祛除胞外 Ca 2+ 可能影响了 I K 通道中的特异性允许 K + 通过的 P 环区 [9], 从而使其反转电位更接近与 K + 理论平衡电位据此, 我们推测 I K 通道结构中可能存在一种受钙离子调整的敏感结构域, 胞外钙可能通过改变此敏感结构域进而影响 I K 通道中的电压敏感结构域和 P 环区, 从而对 I K 电流的电生理学特性产生调制, 但此敏感结构域的特性仍需进一步实验阐明为探讨祛除胞外 Ca 2+ 是否激活了 Deiters 细胞中一种新型的钾电导成分, 我们通过分别测量 I K 电流在正常细胞外液和无钙外液中的电流幅值, 得到了 Deiters 细胞在正常细胞外液和无钙外液中的 I K 电流差值及其相应的电流 - 电压关系因为此外向钾电流成分只有在去除胞外 Ca 2+ 的情况下才能被去极化刺激电压激活, 故此钾电流对胞外 Ca 2+ 敏感, 我们称之为钙抑制性钾电流, 以区别于经典的钙依赖性的钙激活钾电流 (Ca 2+ -activated K + currents) [10] 可以看出, 此钙抑制性钾电流的电流 - 电压关系为非线性, 并且具有一定的电压依赖性和外向整流性, 提示此电流是由 K + 经过具有电压依赖性的钾通道外流形成的 ; 而且我们还发现, 此钙抑制性钾电流具有较特殊的电压依赖性, 即表现出明显的电压区间性, 提示此钙抑制性钾电流可能是由 2 种不同的钾电导介导形成的我们进一步分析了此钙抑制性钾电流的电导 - 电压关系, 结果发现其 G-V 曲线表现为明显的 S 形, 亦表明此钙抑制性钾电流中至

7 常青等 : 胞外钙对豚鼠耳蜗 Deiters 细胞钾电流的调制少存在两种不同的电压依赖性钾电导成分由此, 我们认为 Deiters 细胞中除经典的 I K 通道外, 至少还存在一种不同的钾通道, 并初步推测此钾通道可能是一种新型的双相门控性钾通道 ( 受胞外 Ca 2+ 和膜电压共同调控 ) 或是一种新型的钾通道耦联型受体 ( 类似于神经元中的 NMDA 受体 ) 或者是一种 I K 通道的新亚型 ( 其电导较正常 I K 通道大 ), 祛除胞外 Ca 2+ 可激活此新型钾电导, 从而可对 Deiters 细胞的 I K 电流负性调制我们在实验中采用 Na + 代替 Ca 2+ 得到无钙外液, 但 Nevov 等在无钙外液中 ( 用 Mg 2+ 替换 Ca 2+ ) 时并没有记录到 Deiters 细胞外向延迟整流钾电流的改变 [4], 我们推测胞外 Ca 2+ 对 Deiters 细胞 I K 电流的调控作用可能会受到胞外 Mg 2+ 的影响 ; 但由于正常细胞外液中的高 Na + 浓度, 而且在声音感受过程中关于 Corti 淋巴内 Mg 2+ 浓度变化的文献鲜有报道, 我们认为胞外 Ca 2+ 在 Deiters 细胞 I K 电流的调控中起主要作用 ; 同时在实验中, 我们也很难排除用 Na + 代替胞外 Ca 2+, 因为减弱了二价阳离子对细胞表面负电荷的屏蔽作用, 从而消除了其对某些电压依赖性离子通道的调制作用 ; 但 Hill B 等指出, 祛除胞外二价阳离子可对电压依赖性 Na + 通道和内向整流 K + 通道产生调制作用, 但目前关于其对 I K 通道的作用鲜有报道 [11] 而 Masetto 等在分离钙激活钾电流的实验中, 亦是采用 Na + 代替胞外 Ca 2+ 得到无钙外液, 并根据外向钾电流幅值的减少而判断钙激活钾电流的存在 [12] 因此, 我们认为胞外 Ca 2+ 是调控 Deiters 细胞 I K 电流的关键因素, 而进一步阐明 Deiters 细胞中 Shaker 家族钾通道的结构是深入了解这种调制机制的关键所在本实验研究发现胞外钙对豚鼠耳蜗单个离体 Deiters 细胞的 I K 电流有负性调制作用, 我们进一步推测了此调制在听觉生理中的意义在体环境中, 外毛细胞 (outer hair cells, OHCs) 底部和 Deiters 细胞共同浸浴在 Corti 淋巴中, 相互之间形成一个非常狭小的间隙在声音感受过程中, 声刺激引起 OHCs 顶部机械门控阳离子通道开放, 内淋巴中的 K + 经纤毛间的 tip-link 通道进入 OHCs, 细胞去极化, 激活细胞侧壁中的电压依赖性 Ca 2+ 通道,Corti 淋巴中的 Ca 2+ 内流进入 OHCs, 引起 Deiters 细胞外环境中 [Ca 2+ ] o 下降 [2] 在 OHCs 内 K + 外流过程中,Deiters 细胞除可以通过 K-Cl 共载体 Kcc4 主动摄取 K + 外 [8], 还受到胞外各种神经递质 ( 如 ATP, ACh) 的影响, 这 223 两种效应均可引发 Deiters 细胞产生去极化, 而神经递质作用于 Deiters 细胞的同时, 又可通过相应的受体介导引起胞外 Ca 2+ 内流 [13], 最终可引起 Deiters 细胞去极化和细胞外环境中钙浓度下降由我们的实验结果可以看出, 胞外 [Ca 2+ ] o 可对 Deiters 细胞的 I K 电流产生负性调控作用, 有利于 Deiters 细胞内 K + 外流, 从而可以有效的缓冲 OHCs 外周的 K + 浓度, 进而可以避免胞外高浓度的 K + 对细胞产生的毒性作用 [14] ; 并引起 Deiters 细胞产生复极化, 从而有利于维持 Deiters 细胞正常的生理状态, 而细胞内高浓度的 K + 可对细胞产生缓慢的毒性, 引起听力下降 [15] 本实验首次观察并记录到了胞外 Ca 2+ 对豚鼠耳蜗单个离体 Deiters 细胞的全细胞钾电流起负性调控作用, 并初步推测了其调控机制和生理学意义, 为进一步深入研究哺乳动物耳蜗中 Deiters 细胞在听觉生理中的功能提供了理论基础 * * * 致谢 : 我们感谢华中科技大学同济医学院药理学系陈建国教授的支持和帮助! 参考文献 1 Chen C, Skellett RA, Fallon M, Bobbin RP. Additional pharmacological evidence that endogenous ATP modulates cochlear mechanics. Hear Res 1998; 118 (1-2): Philine Wandgmann. K + cycling and the endocohlear potential. Hear Res 2002; 165: Steel KP. Perspectives: biomedicine. The benefits of K + recycling. Science 1999; 285(5432): Nevov AP, Chen C, Bobbin PR. Outward rectifying potassium currents are the dominant voltage activated currents present in Deiters cell. Hear Res 1998; 123: Yang J, Wang J. Possible function of outward potassium currents in isolated Deiters' cells of guinea pig cochlea. Chin Med J (Eng) 2002; 115(2): Kehl SJ, Eduljee C, Kwan DC, Zhang S, Fedida D. Molecular determinants of the inhibition of human K V 1.5 potassium currents by external protons and Zn 2+. J Physiol 2002; 541(Pt 1): Kros CJ. Physiology of mammalian hair cells. In: Dallos P, Popper A N, Fay R (Eds.), Springer Handbook of Auditory Research: The Cochlea. Springer, Berlin, 1996; Boettger T, Hubner CA, Maier H, Rust MB, Beck FX, Jentsch TJ. Deafness and renal tubular acidosis in mice lacking the K-Cl co-transporter Kcc4. Nature 2002; 416 (6883):

8 224 9 Webster SM, Del Camino D, Dekker JP, Yellen G. Intracellular gate opening in Shaker K + channels defined by high-affinity metal bridges. Nature 2004; 428(6985): Skinner LJ, Enee V, Beurg M, Jung HH, Ryan AF, Hafidi A, Aran JM, Dulon D. Contribution of BK Ca 2+ -activated K + channels to auditory neurotransmission in the guinea pig cochlea. J Neurophysiol 2003; 90(1): Bertil Hille. Ionic Channels of Excitable Membranes. 2nd Ed. Massachusetts: Sinauer Associates INC, 1992, Masetto S, Russo G, Prigioni I. Differential expression of potassium currents by hair cells in thin slices of frog crista 生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2005, 57(2): ampullaris.j Neurophysiol 1994; 72(1): Lagostena L, Mammano F.Intracellular calcium dynamics and membrane conductance changes evoked by Deiters' cell purinoceptor activation in the organ of Corti. Cell Calcium 2001; 29(3): Johnstone BM, Patuzzi R, Syka J, Sykova E. Stimulus-related potassium changes in the organ of Corti of guinea-pig. J Physiol 1989; 408: Van Laer L, Cryns K, Smith RJ, van Camp G. Nonsyndromic hearing loss. Ear Hear 2003; 24(4):

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untitled Acta Physiologica Sinica, February 25, 2007, 59 (1): 63-70 http://www.actaps.com.cn 63 CA3 1 1 2 2 2 2 2,* 1,* 1 2 300071 CA3 (transient outward potassium current, I A )(delayed rectifier potassium current,