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2 20: ( 2000) Chinese J. Entomol. 20: (2000) RAPD-PCR (Liriomyza spp.) ( ) (Liriomyza) ( ) DNA (genomic DNA) DNA 100 (random primer) DNA (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction, RAPD-PCR) 3 UBC-70 UBC-71 UBC-96 6 (L. asterivora) (L. bryoniae) (L. chinensis) (L. huidobrensis) (L. sativae) (L. trifolii) (colony) DNA RAPD-PCR 6 DNA 23 (Parrella, 1987 Spencer, 1973) 15 7 Spencer (1989) (Shiao, 1991 Shiao and Wu, 1989 Plant Protection and Quarantine Shiao and Wu, 1995 Shiao and Wu, 1998 * shihcj@ccms.ntu.edu.tw RAPD-PCR 293

3 Shiao et al., 1991) 6 RAPD-PCR 6 (molecular markers) DNA (leafminer flies) 95% -80 (Nowakowski, 1962 Spencer, 1990) (30 cm 30 cm 50 cm) (Shiao and Wu, ) 1980 (Newman and Parrella, Parrella and Keil, 1983) 1. (L. asterivora) (The farm of National Taiwan University) (Chuang-wei 294

4 Shiang, Ilan County) (Sanshing Shiang, Ilan County) 6 2. (L. bryoniae) (Blood and Tissue Genomic DNA (Chuang-wei Shiang, Ilan County) (C-lou Jen, Yunlin County) 7 3. (L. chinensis) D ) DNA (Chuang-wei Shiang, Ilan County) (San-shing Shiang, Ilan County) (C-lou ( ) Jen, Yunlin County) ~ 4. (L. huidobrensis) 2 DNA (Chuang-wei Shiang, Ilan County) (San-shing Shiang, Ilan County) (L. sativae) 56 1 ~ 2 70 (The farm of National Taiwan University) (National Taiwan University Department of Plant Pathology and Entomology) spin column 6,000 xg (Chuang-wei Shiang, Ilan County) (San-shing Shiang, Ilan County) (The cultivated land of Taichung) 100 µl (Tien-wei Shiang, Changhua County) (C-lou Jen, Yunlin County) (Tzu-tung Shiang, Yunlin County) genomic DNA ( 2 ~ 4 ng/µl) 4 (Hsin-yich City, Tainan County) (L. trifolii) 10-mers RAPD primer set 100/1 (Pu-li Jen, Nantu County) kit (The University of British Columbia, (Tien-wei Shiang, Changhua County) (Hun-tan Shiang, 1. DNA Viogene DNA Miniprep System kit, Cat. No. GG1001) Omega Biotek DNA (E.Z.N.A. Tissue DNA Kit I, Cat. No. 1.5 ml 200 µl buffer LYS DNA 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) 20 Proteinase K 200 µl buffer EX µl isopropanol ( 10,000 rpm, KUBOTA 6800, RA-155R rotor) 2 wash buffer 500 µl spin column 6,000 xg 2 70 elute buffer ddh 2 O DNA spin column 6,000 xg RAPD-PCR UBC ) 6 RAPD-PCR Perkin-Elmer Changhua County) 25 GeneAmp PCR System 2400 RAPD-PCR 295

5 PCR PCR 0.2 ml 4.0 µl DNA ( 8 ~ 16 ng DNA) 0.6 unit DNA polymerase ( TaKaRa ) 10X reaction buffer ( 15 mm Mg 2+ ) 2.5 µl 2.5 mm dntps 2.5 µl ( 0.25 mm) 1.5 µm random primer 3.5 µl ( 0.2 µm) Rf DNA 25 µl PCR PCR 96 /5 96 /30, 40 /30, 72 / /7 4 5 µl PCR 2.0% agarose gel ( 0.5 µg/ml ethidium bromide) 1X TAE buffer UV DNA DNA (TOPBIO) VGIS-1 (Video Gel Image System) AAB (Advanced American Biotechnology) (L. sativae) Fig. 1 The damage caused by L. sativae to yard long bean and external morphology of growing periods. A. Ovipositing traces of adults; B. The damage caused by larva; C. and D. Larva; E. Pupa; F. Emergencing of pupa; G. Adult, male (left) and female (right). 296

6 6 Fig. 2 Six similar external morphology of female adults Liriomyza spp. A. L. trifolii ; B. L. sativae ; C. L. bryoniae ; D. L. asterivora ; E. L. chinensis ; F. L. huidobrensis. RAPD-PCR Table 1. Base-pair sequence of RAPD-PCR primers used. Primer UBC-70 UBC-71 UBC-96 Base-pair sequence (5 3 ) GGG CAC GCG A GAG GGC GAG G GGC GGC ATG G 1987 Parrella and Robb, 1982) 3 ( ) (Lu, RAPD-PCR 297

7 6 primer UBC-70 RAPD-PCR DNA Fig. 3 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of six Liriomyza spp. genomic DNA by using primer UBC-70. Lane 1: L. trifolii, ; Lane 2: L. asterivora, ; Lane 3: L. chinensis, ; Lane 4: L. sativae, ; Lane 5: L. huidobrensis, ; Lane 6: L. bryonia, ; M: 100 bp DNA ladder. 6 primer UBC-71 RAPD-PCR DNA Fig. 4 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of six Liriomyza spp. genomic DNA by using primer UBC-71. Lane 1: L. trifolii, ; Lane 2: L. asterivora, ; Lane 3: L. chinensis, ; Lane 4: L. sativae, ; Lane 5: L. huidobrensis, ; Lane 6: L. bryonia, ; M: 100 bp DNA ladder. 298

8 6 primer UBC-96 RAPD-PCR DNA Fig. 5 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of six Liriomyza spp. genomic DNA by using primer UBC-96. Lane 1: L. trifolii, ; Lane 2: L. asterivora, ; Lane 3: L. chinensis, ; Lane 4: L. sativae, ; Lane 5: L. huidobrensis, ; Lane 6: L. bryonia, ; M: 100 bp DNA ladder. (A) (B) 46 L. trifolii 25 (C) (D) (E) (F) (G) ( ) ( ) 6 RAPD-PCR ( ) ( ) ( ) ( ) DNA (template) UBC ~ UBC-100 RAPD-PCR ( ) 3 95 UBC-70 UBC-71 UBC-96 ( ) 3 PCR DNA 117 L. asterivora 6 L. bryoniae 7 bryoniae L. chinensis L. huidobrensis L. chinensis 15 L. huidobrensis 14 L. sativae 100 RAPD-PCR 6 6 (L. asterivora L. L. sativae L. trifolii) ( ~ ) RAPD-PCR 299

9 6 3 RAPD-PCR DNA Table 2. Size in base pairs of amplification patterns of RAPD-PCR products of three different primers of the six Liriomyza species Species UBC-70 UBC-71 UBC-96 L. trifolii L. asterivora L. chinensis L. sativae L. huidobrensis L. bryoniae

10 UBC-71 UBC-96 RAPD-PCR DNA UBC-70 L. trifolii L. asterivora L. sativae 3 PCR DNA UBC-71 ( ) DNA L. trifolii L. asterivora 430 bp 582 bp 846 bp 3 DNA L. asterivora L. trifolii 494 bp 950 bp 2 DNA L. sativae 764 bp 402 bp DNA L. trifolii L. asterivora ( ) UBC-96 DNA L. trifolii 591 bp DNA L. asterivora L. sativae L. asterivora 414 bp DNA L. trifolii L. sativae ( ) DNA L. trifolii L. asterivora L. sativae 3 RAPD 6 DNA 2 L. asterivora L. sativae L. trifolii Shiao, 1991 Spencer, 1986) L. bryoniae L. chinensis L. huidobrensis 3 (Frick, 1952 Sasakawa, 1961 Shiao, L. trifolii L. asterivora L. sativae 3 3 L. bryoniae L. chinensis L. huidobrensis RAPD-PCR DNA RAPD- PCR DNA 6 DNA ( ~ ) DNA RAPD-PCR DNA RAPD-PCR DNA RAPD-PCR (Nowakowski, 1962 Sasakawa, ( ) 1991) 6 RAPD-PCR 301

11 L. asterivora RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 6 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. asterivora genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from San-Shing Shiang Ilan County, host is Brazilian fireweed; Lane 5 and 6: using male and female, collected from the farm of National Taiwan University, host is Brazilian fireweed; Lane 7: using female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is tomato; M: 100 bp DNA ladder. L. bryoniae RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 7 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. bryoniae genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is oriental pickling melon; Lane 5: using female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is wax gourd; Lane 6: using female, collected from San-shing Shiang Ilan County, host is Tomato; M: 100 bp DNA ladder. 302

12 L. chinensis RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 8 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. chinesis genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is spring onion; Lane 5: using female, collected from C-lou Jen Yunlin County, host is spring onion; Lane 6: using female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is spring onion; M: 100 bp DNA ladder. L. huidobrensis RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 9 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. huidobrensis genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is white-flowered gourd; Lane 5: using female, collected from San-shing Shiang Ilan County, host is mustard; Lane 6: using female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is mustard; M: 100 bp DNA ladder. RAPD-PCR 303

13 L. sativae RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 10 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. sativae genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from Hsin-yich City Tainan County, host is green bean; Lane 5: using female, collected from Chuang-wei Shiang Ilan County, host is green bean; Lane 6: using female, collected from the farm of National Taiwan University, host is tomato; Lane 7: using female, collected from Tzu-tung Shiang Yunlin County, host is white-flowered gourd; M: 100 bp DNA ladder. L. trifolii RAPD-PCR (primer UBC-70) DNA Fig. 11 Ethidium bromude-stained agarose gel (2.0%) electrophoresis of the products following RAPD- PCR amplification of L. trifolii genomic DNA from different growing periods, sexes, and collection sites by using primer UBC-70. Lane 1 ~ 4: using larva, pupa, male, and female, collected from Tien-wei Shiang Changhua County, host is African daisy; Lane 5 ~ 7: using female, collected from Tien-wei Shiang Changhua County, host is African daisy; M: 100 bp DNA ladder. 304

14 1990 Williams et al. RAPD-PCR DNA RAPD-PCR (Apostol et al., genomic DNA PCR 7 ~ 8 Wilkerson et al., 1995) (Black et al., 1992 Cenis et al., 1993) (De Barro and Driver, 1997 Gawel and Bartlett, 1993 Guirao et al., 1997) (Chapco et al., 1992) (Garner and Slavicek, 1996 Reineke and Zebitz, 1999) (Lou UBC-70 UBC-71 UBC-96 6 RAPD- (Haymer and McInnis, 1994) PCR DNA De Barro and Driver (1997) (F2 F12 DNA H9 H16) (Bamisia DNA argentifolii) RAPD-PCR L. asterivora L. bryoniae L. chinensis L. huidobrensis L. sativae L. trifolii RAPD-PCR (Loxdale and Lushai, 1998) DNA DNA 89 RAPD-PCR DNA 1996 Ballinger-Crabtree et al., 1992 et al., 1998) RAPD-PCR 305

15 Apostol, B. L., W. C. Black, P. Reiter, and B. R. Miller Population genetics with RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico. Heredity 76: Balling-Crabtree, M. E., W. C. Black, and B. R. Miller Use of genetic polymorphisms detected by the random-amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD- PCR) for differentiation and identification of Aedes aegypti subspecies and population. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47: Black, W. C., N. M. DuTeau, G. J. Puterka, J. R. Nechols, and J. M Pettorini Use of the random amplified polymorphuc DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) to detect DNA polymorphisms in aphids. Bull. Entomol. Res. 82: Cenis, J. L., P. Perez, and A. Fereres Identification of aphid (Homoptera: Aphididae) species and clones by random amplified polymorphic DNA. Ann. Entomol. Soc. Am. 86: Chapco, W., N. W. Ashton, R. K. B.Martel, and N. Antonishyn A feasibility study of the use of random amplified polymorphic DNA in the population genetics and systematics of grasshoppers. Genome 35: De Barro, P. J., and F. Driver Use of RAPD PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrofidae). Aust. J. Entomol. 36: Frick, K. E A generic revision of the family Agromyzidae (Diptera) with a catalogue of New World species. Univ. Calif. Publ. Entomol. 8: Garner, K. J., and J. M. Slavicek Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asian and North American gypsy moths. Insect Mol. Biol. 5: Gawel, N. J., and A. C. Bartlett Characterization of differences between whiteflies using RAPD-PCR. Insect Mol. Biol. 2: Guirao, P., F. Beitia, and J. L. Cenis Biotype determination of Spanish populations of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Bull. Entomol. Res. 87: Haymer, D. S., and D. O. McInnis Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction. Genome 37: Lou, K. F., M. J. Weiss, P. L. Bruckner, W. L. Morrill, L. E. Talbert, and J. M. Martin RAPD variation within and among geographic populations of wheat stem sawfly (Cephus cinctus Norton). American Genetic Association 89:

16 Loxdale, H. D., and G. Lushai Molecular markers in entomology. Bull. Entomol. Res. 88: Lu, F. M Different staining methods for eggs of diminutive insects. J. Agic. Res. China 36: (in Chinese) Newman, J. P., and M. P. Parrella A license to kill. Greenhouse Management 5: Nowakowski, J. T Introduction to a systematic revision of the family Agromyzidae (Diptera) with some remarks on host plant selection by these files. Polska Akad. Nauk. Inst. Zool. Ann. Zool. 20 (8): Parrella, M. P Biology of Liriomyza. Ann. Rev. Entomol. 32: Parrella, M. P., and C. B. Keil Insect pest management: the lesson of Liriomyza. Bull. Entomol. Soc. Am. 30: Parrella, M. P., and K. L. Robb Technique for staining eggs of Liriomyza trifolii within chrysanthemum, celery, and tomato leaves. J. Econ. Entomol. 75: Reineke, A., and C. P. W. Zebitz Suitability of polymerase chain reaction-based approaches for identification of different gypsy moth (Lepidoptera: Lymantriidae) genotypes in central Europe. Ann. Entomol. Soc. Am. 92: Sasakawa, M A study of the Japanese Agromyzidae (Diptera). Part 2. Pac. Insects 3: Shiao, S. F Systematic Studies on Liriomyza Species in Taiwan (Diptera: Agromyzidae). Master s thesis. National Taiwan University. 129pp. (in Chinese) Shiao, S. F., and W. J. Wu Four new records of Liriomyza leaf-miners (Diptera: Agromyzidae) from Taiwan. J. Taiwan Mus. 42: Shiao, S. F., and W. J. Wu A new Liriomyza species from Taiwan (Diptera: Agromyzidae). Pan-Pacific Entomol. 71: Shiao, S. F., and W. J. Wu Diagnosis of quarantined plants (2) Diptera: Agromyzidae. Bureau of Standards, Methology and Inspection, Ministry of Economic Affairs. pp (in Chinese) Shiao, S. F., and W. J. Wu Ecology and control of the vegetable leafminer (Liriomyza sativae)(diptera: Agromyzidae). Scientific Agriculture 46: (in Chinese) Shiao, S. F., F. J. Lin, and W. J. Wu Redescription of four Liriomyza species (Diptera: Agromyzidae) from Taiwan. Chinese J. Entomol. 11: Spencer, K. A Agromyzidae (Diptera) of Economic Importance. Dr. W. Junk B. V., Publishers, The Hangue. 418 pp. Spencer, K. A Agromyzidae (Diptera) from Thailand: new species, revisionary notes and new records. Proc. Ind. Acad. Sci. 95: RAPD-PCR 307

17 Spencer, K. A Leaf miner. Ch. 5. pp in: R. P. Kahn, ed. Plant Protection and Quarantine, Vol. 2, Selected Pests and Pathogens of Quarantine Significance. CRC Press, Inc. 265 pp. Spencer, K. A Host specialization in the world Agromyzidae (Diptera). Kluwwe Academic Publishers, The Netherlands. 444 pp. Wilkerson, R. C., T. J. Parsons, T. A. Klein, T. V. Gaffigan, E. Bergo, and J. Consolim Diagnosis by random chain reaction of four cryptic species related to Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraquay, Argentina and Brazil. J. Med. Entomol. 32: Williams, J. G. K., A. R. Kubelik, J. A. Rafalski, and S. V. Tingey DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful genetic markers. Nucleic Acid Res. 18:

18 The Application of RAPD-PCR to Develop Rapid Diagnostic Technique for Identification of 6 Species of Liriomyza spp. (Dipter: Agromyzidae) Yi-Chung Chiu, Wen-Jer Wu, Shiuh-Feng Shiao, and Cheng-Jen Shih* Department of Entomology, National Taiwan University Taipei, Taiwan 106, R.O.C. ABSTRACT Leafminer flies (Liriomyza spp.) are important quarantined pests in international trade. However, the Liriomyza spp. are difficult to identify in immature stages (eggs, larvae, and pupae) as well as adult stage, so that many obstacles appeared in the international quarantine. This study attempts to develop the molecular technique of genomic DNA marker to identify 6 species of the genus Liriomyz. In the DNA analysis, we found DNA molecular marker to identify the Liriomyza species with similar morphological characters. In the random amplified polymorphic DNA (RAPD) test, we checked 100 random primers and only 3 primers (UBC-70, UBC71, and UBC-96) are available for distinguishing the 6 species of Liriomyza (L. asterivora, L. bryoniae, L. chinensis, L. huidobrensis, L. sativae, and L. trifolii), and there are no difference in the RAPD patterns among the different stages, sexes, strains of each species, but obvious differences between different species. According to this study, t he RAPD patterns is worth to be suggested for the identification of these species. Key words: Liriomyza, rapid diagnostic techniques, identification, polymerase chain reaction (PCR), random amplified polymorphic DNA (RAPD). RAPD-PCR 309

2 1: 1 7-27 ( 2001) Formosa n Entomol. 2 1 : 1 7-27 (2001) (Orgyia posticus) ( ) * (Orgyia posticus (Walker)) 10 15 20 25 30 35 12L : 12D 25 5 10-35 64.1 40.0 26.2 16.2 16.2 21.1 19.6 16.0 8.2 6.9 6.0

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