Microsoft Word xb 王静

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word xb 王静"

案蔚锺
5 years ago
Views:

1 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2017, 57(8): DOI: /j.cnki.wsxb Research Article 研究报告融合淀粉酶 AmyP-Clo 对大米生淀粉的高效降解 * 王静, 翟璐, 张销寒, 李风玲, 肖亚中, 彭惠安徽大学生命科学学院, 安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心, 安徽合肥摘要 : 目的获得能高效降解大米生淀粉的 α- 淀粉酶方法将来源 Clostridium butyricum T-7 的 α- 淀粉酶的淀粉结合结构域与能快速偏好性降解大米生淀粉的 α- 淀粉酶 AmyP 的催化结构域融合重组表达结果融合蛋白 AmyP-Clo 保留了野生型 AmyP 催化优势的基础上, 对大米生淀粉的比活为 (373.9±8.4) U/mg,4 h 内对 5% 大米生淀粉的最终降解率为 (42.7±1.1)%, 对大米生淀粉的最高结合率为 (71.1±1.6)%, 这些数据相比 AmyP 分别提高了和 1.3 倍结论融合蛋白 AmyP-Clo 能高效降解生大米淀粉, 是一个具有优良应用价值的酶关键词 :α- 淀粉酶, 大米生淀粉, 融合表达, 淀粉结合结构域大米是世界约 50% 人口的主粮, 其重要性不言而喻但是大米淀粉的深加工应用却远没有小麦玉米等淀粉广泛 [1] 一个重要原因是大米生淀粉的成分和结构远比小麦玉米等淀粉复杂 [2] 近几年, 随着无需糊化 ( 高温破坏生淀粉结构的耗能过程 ) 就能直接降解生淀粉的酶的深入研究, 生淀粉降解酶在方便食品医药慢消化淀粉多孔淀粉缓释剂新型脂肪替代品等方面显示了广阔的应用前景 [3 4] 但是大部分生淀粉降解酶无法降解大米生淀粉, 或是降解能力很差 α- 淀粉酶 (EC ) 是三大类生淀粉降解酶之一目前报道的 α- 淀粉酶中只有十余个酶具有降解大米生淀粉的能力 [5 7], 而这十余个酶中仅有 2 个酶降解大米生淀粉的能力比降解小麦淀粉强, 它们分别是来自蚯蚓 (Eisenia foetida) 的 Amy II [5] 和来自 Laceyella sacchari 的淀粉酶 [7] 其余的 α- 淀粉酶降解小麦玉米等生淀粉的能力都远比大米强此外, 由于生淀粉具有致密的结晶结构, 绝大部分生淀粉降解酶的降解速度都很慢, 常常需要 24 h 以上已知的 α- 淀粉酶中仅有 2 个能快速降解生淀粉 1 个来自 Anoxybacillus flavothermus, 降解 5% 的玉米生淀粉仅需 2 3 h [8] ; 另 1 个来自 Bacillus licheniformis, 降解 1% 的玉米生淀粉只需 3 h [9] 缓慢的降解速度极大影响了酶的应用基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 安徽省杰出青年科学基金 (170808J04) * 通信作者 Tel: ; pph0259@126.com 收稿日期 : ; 修回日期 : ; 网络出版日期 :

2 1302 Jing Wang et al. Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(8) α- 淀粉酶 AmyP 是前期工作中从海洋宏基因组文库中获得的一个新型淀粉酶 [10] 它不仅对大米生淀粉具有绝对的偏好降解特性 ( 比活是其他淀粉的 4 倍以上 ), 而且对各种生淀粉的降解速度都很快, 尤其是大米生淀粉, 整个降解时间不超过 4 h, 起始 30 min 内效率极高这种快速偏好降解大米生淀粉的特性从未在其他已知的生淀粉降解酶中发现过 [6] 随后, 我们发现 AmyP 虽然拥有一个淀粉结合结构域 (SBD), 但是该 SBD 对 AmyP 降解生淀粉的贡献较小 [11] 本文报道通过替换 SBD, 将来源 Clostridium butyricum 的 [12] SBD Clo 与 AmyP SBD 融合, 得到了一个具有更高的降解大米生淀粉能力的融合酶 AmyP-Clo 1 材料和方法 1.1 克隆表达和纯化融合蛋白 AmyP-Clo 来源 C. butyricum 的 SBD Clo 基因由上海生工合成, 在 N 和 C 端分别引入酶切位点 EcoR I 和 Xho I 含有缺失 SBD 的 AmyP ΔSBD 重组表达载体 pet28a-amyp ΔSBD 由本实验构建 [11] 使用 EcoR I 和 Xho I 酶切 SBD Clo 和 pet28a-amyp ΔSBD, 然后采用标准的分子克隆技术将片段连接, 在表达载体 pet28a 上形成融合基因 AmyP-Clo 质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 后,16 C 诱导表达,AmyP-Clo 蛋白通过 Ni 2+ 亲和层析一步纯化野生型 AmyP 的重组表达载体 pet28a-amyp 由本实验室构建 [10], 同样的方法得到纯化的 AmyP 1.2 生淀粉酶活测定和蛋白浓度采用 3,5- 二硝基水杨酸 (DNS) 法测定生淀粉降解后释放出的还原糖的量 [13], 以葡萄糖为标准一个标准反应体系包含 50 μl 适当稀释的纯酶和 550 μl 10% (W/V) 大米或玉米生淀粉酶和淀粉均配置在 50 mmol/l 磷酸钠钾缓冲液 (ph 7.5) 中, 在 40 C 反应 10 min, 立刻放置于冰冷的 0.3 mol/l Na 2 CO 3 溶液中, 骤冷终止反应 [14], 随后 4 C 8000 g 离心 5 min, 取上清测定还原糖的量生淀粉使用前用 MilliQ 水洗涤 5 次, 除去可能的还原糖猪胰淀粉酶 (pig pancreas, PPA, 购自 Sigma) 的最适反应条件是 ph 7.0 (50 mmol/l 磷酸钠钾缓冲液 ) 和 37 C 一个标准酶活单位(U) 定义为每分钟释放出 1 μmol 还原糖所需的酶量蛋白浓度采用 Bradford 法测定, 牛血清白蛋白作为标准 1.3 温度和 ph 对活性的影响在 40 C 测定不同 ph 值对大米生淀粉降解活性的影响缓冲液为 50 mmol/l 乙酸 - 乙酸钠缓冲液 (ph 4.0 到 6.0) 磷酸钠钾缓冲液(pH 6.0 到 8.5) 和甘氨酸 -NaOH 缓冲液 (ph 8.5 到 10.0), 间隔区间为 0.5 个 ph 在最适 ph 7.5 下测定温度对降解活性的影响, 温度范围为 10 C 到 65 C, 间隔区间为 5 C 1.4 大米和玉米生淀粉的酶解动力学采用 5% 的大米或玉米生淀粉为底物, 分别加入 60 U 的 AmyP-Clo AmyP 和 PPA, 在这 3 个酶各自的最适 ph 和温度条件下进行酶解加入 0.2% 的甲苯到反应混合液中防止可能的微生物污染 [15], 终反应体系为 6 ml 反应混合液置于 37 C 或 40 C 的水浴锅中温和摇晃 (100 r/min) 反应 4 h, 期间间隔不同的时间取样, 每次取样 0.6 ml 取出的样品 4 C 8000 g 离心 5 min, 取上清测定还原糖的量 1.5 生淀粉吸附能力测定往 1 ml 的 50 mmol/l 磷酸盐缓冲液 (ph 7.5) 中分别加入 0 90 mg 的大米生淀粉和玉米生淀粉, 振荡后形成悬浊液, 然后分别加入 1.8 μmol/l 的 actamicro@im.ac.cn

王静等微生物学报, 2017, 57(8) 1303 AmyP-Clo 和 AmyP 为了避免酶解反应对吸附的的酶活随温度变化的曲线整体上和野生型 AmyP 干扰将试管放置在冰水混合的水浴锅中温和摇的曲线也类似但是各温度下的酶活都比野生型晃(100 r/min)孵育 1 h 然后 4 C 12000 g 离心 AmyP 更高一点例如 30 C 和 50 C 时 AmyP-Clo

3 王静等微生物学报, 2017, 57(8) 1303 AmyP-Clo 和 AmyP 为了避免酶解反应对吸附的的酶活随温度变化的曲线整体上和野生型 AmyP 干扰将试管放置在冰水混合的水浴锅中温和摇的曲线也类似但是各温度下的酶活都比野生型晃(100 r/min)孵育 1 h 然后 4 C g 离心 AmyP 更高一点例如 30 C 和 50 C 时 AmyP-Clo 10 min 取 100 μl 上清用 Bradford 法测定蛋白含的酶活为最高酶活的 80%和 75% 而同样温度时量然后绘制吸附曲线空白对照组用等体积缓 AmyP 的酶活仅为最高酶活的 53%和 37% 这表冲液替代 SBD 蛋白吸附率(%)=(总蛋白上清中明 AmyP-Clo 的温度适应性更好了可以在更为残留的蛋白)/总蛋白 100% 宽泛的温度下降解生淀粉 2.3 AmyP-Clo 降解大米生淀粉和玉米生淀粉 2 结果和分析 2.1 融合蛋白 AmyP-Clo 构建表达与纯化玉米生淀粉的比活分别为 (373.9±8.4) U/mg 和委托上海生工直接合成 SBDClo 的基因 861 个 (150.2±4.4) U/mg 野生型 AmyP 在最适条件下对大碱基然后运用常规的分子克隆技术与米生淀粉和玉米生淀粉的比活分别为 (118.5± AmyP SBD 的基因连接成功构建了融合基因的重 0.6) U/mg[6]和(39.6±1.4) U/mg[16] 因此融合蛋白组表达质粒 pet28a-amyp-clo 质粒转化大肠杆在最适条件下 AmyP-Clo 降解大米生淀粉和 AmyP-Clo 的比活力分别提高了 3.1 和 3.8 倍菌后低温 16 C 诱导后实现可溶性表达无包涵体重组表达的 AmyP-Clo 蛋白已经融合了载体上的 His-tag 标签直接采用 Ni2+亲和层析获得纯品(图 1) 实验室前期构建的 pet28a-amyp 质粒也同样表达纯化获得野生型 AmyP 的纯酶 AmyP-Clo 蛋白有 779 个氨基酸理论分子量为 85.7 kda 从图 1 中可见重组表达的 AmyP-Clo 分子量与理论分子量吻合野生型 AmyP 的分子量为 70.3 kda 2.2 ph 和温度对融合蛋白 AmyP-Clo 降解活性的影响图 1. SDS-PAGE 分析融合蛋白 AmyP-Clo 和野生型 AmyP 的表达与纯化以大米生淀粉为底物 AmyP-Clo 的最适 ph 为 7.0 (图 2-A) 与野生型 AmyP 相比降低了 0.5 虽然最适 ph 发生了变化但是酶活随 ph 变化的曲线整体上和野生型 AmyP 的曲线类似差别较小 AmyP-Clo 的最适温度没有改变依然与野生型 AmyP 的一样都为 40 C (图 2-B) AmyP-Clo Figure 1. SDS-PAGE analysis of the chimeric AmyP-Clo and wild-type AmyP expression and purification. M: size marker proteins; lane 1: the cell lysates of E. coli harboring pet28a; lane 2: the cell lysates of E. coli harboring pet28a-amyp-clo; lane 3: the purified AmyP-Clo protein; lane 4: the cell lysates of E. coli harboring pet28a-amyp; lane 5: the purified AmyP protein.

4 1304 Jing Wang et al. Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(8) (42.7±1.1)%, 而 AmyP 的降解率为 (15.5±0.5)% 相同时间内的 PPA 的降解率仅为 (11.1±0.3)% 这 3 个酶对 5% 的玉米生淀粉的酶解动力学如图 3-B 所示与 AmyP 相比,AmyP-Clo 对玉米生淀粉的降解能力提高 3.3 倍,4 h 的最终降解率达到 (16.2±0.4)%, 而 AmyP 的降解率为 (4.9±0.2)% 在多种生淀粉中,PPA 对玉米生淀粉的降解能力最强 [17] 4 h 时 PPA 的降解率为 (17.2±0.6)%, 略高于 AmyP-Clo 图 2. ph (A) 和温度 (B) 对 AmyP-Clo( ) 和 AmyP( ) 生淀粉降解酶活的影响 Figure 2. Effects of ph (A) and temperature (B) on the activity of AmyP-Clo ( ) and AmyP ( ) towards raw starch. Values are the means±sd of three experiments (n=3). 为了进一步衡量比较 AmyP-Clo 的降解能力, 将 AmyP-Clo AmyP 和 PPA 在酶量相同的条件下加到 5% 的大米生淀粉的悬浊液中, 测定其在 4 h 内的酶解动力学如图 3-A 所示 AmyP-Clo 的酶解动力学曲线和 AmyP 类似, 依然是典型的两阶段式, 即先为快速降解阶段, 然后是缓慢降解阶段作为对照的典型生淀粉酶 PPA 则是持续增长模式与 AmyP 相比,AmyP-Clo 对大米生淀粉的降解能力提高 2.8 倍,4 h 的最终降解率达到图 3. 融合蛋白 AmyP-Clo( ) AmyP( ) 和 PPA( ) 对大米 (A) 和玉米生淀粉 (B) 的降解 Figure 3. Ability of the chimeric AmyP-Clo ( ), AmyP ( ) and PPA ( ) to digest raw rice (A) and corn (B) starches. Values are the means±sd of three experiments (n=3). actamicro@im.ac.cn

5 王静等微生物学报, 2017, 57(8) AmyP-Clo 对大米生淀粉和玉米生淀粉的吸附能力 SBD 的主要功能是吸附生淀粉颗粒, 进而帮助酶在淀粉颗粒表面聚集, 提高酶降解生淀粉颗粒的能力 AmyP-Clo 对大米和玉米生淀粉的降解能力都比野生型 AmyP 显著提高, 那么 SBD Clo 对生淀粉的结合能力极可能比 SBD AmyP 强为了验证融合蛋白 AmyP-Clo 降解生淀粉能力的提高确实是由于 SBD 结合能力的提高所致, 在蛋白的摩尔质量相同的条件下, 我们测定了 AmyP-Clo 和 AmyP 对大米 ( 图 4-A) 和玉米生淀粉 ( 图 4-B) 的结合能力结果表明, 融合蛋白 AmyP-Clo 对这两种生淀粉的结合能力确实都明显高于野生型 AmyP 的结合能力对大米生淀粉而言,AmyP-Clo 的最高结合率为 (71.1±1.6)%,AmyP 的最高结合率为 (54±1.4)%; 对玉米生淀粉而言,AmyP-Clo 的最高结合率为 (86.6±2.5)%,AmyP 的最高结合率为 (32.5±1.1)% 这说明, 融合蛋白 AmyP-Clo 有了对生淀粉结合能力更强的 SBD Clo 的帮助, 能更有效地结合生淀粉, 进而展示出比野生型 AmyP 更强的生淀粉降解能力 3 讨论不同植物来源的生淀粉具有不同的颗粒大小表面微结构和内部结晶模式, 因此酶对不同来源的生淀粉的降解能力相差很大 α- 淀粉酶 AmyP 在降解大米生淀粉方面具有几个显著优势 : 比活高反应速度快最适反应温度 (40 C) 远低于淀粉的糊化温度不需要添加 Ca 2+ 因此 AmyP 是一个具有应用价值的生淀粉降解酶我们注意到将 AmyP 自身的 SBD 去除后, 虽然 AmyP SBD 对大米生淀粉的降解能力有所下降, 但是下降幅度不算很大 [11] 因此, 理论上可以采用替换 SBD 的办法进一步提高其降解能力能降解大米生淀粉的 α- 淀粉酶不多, 综合考虑酶的最适作用温度和 ph 等因素之后, 选择来源 C. butyricum T-7 的淀粉酶的 SBD Clo 作为对象 [12] 这个酶降解生淀粉的能力依次是玉米 > 小麦 > 大米 > 土豆图 4. 融合蛋白 AmyP-Clo( ) 和 AmyP( ) 对大米 (A) 和玉米生淀粉 (B) 的结合能力 Figure 4. Ability of the chimeric AmyP-Clo ( ) and AmyP ( ) to bind raw rice (A) and corn (B) starches. Values are the means±sd of three experiments (n=3). 与预计结果类似, 融合蛋白 AmyP-Clo 对大米和玉米生淀粉的降解能力都得到了显著提高, 分别为野生型 AmyP 的 3.1 和 3.8 倍单就提高倍数而言, 对玉米生淀粉的比活增加得更多, 这应

6 1306 Jing Wang et al. Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(8) 该是由于来源 C. butyricum T-7 的淀粉酶的最适作用生淀粉是玉米 SBD 在生淀粉降解过程中的功能是捕获底物因此, 催化结构域对最终的降解率酶的作用方式的贡献更大从图 3 中可见, 融合蛋白 AmyP-Clo 对大米和玉米生淀粉的酶解动力学过程与野生型 AmyP 的高度相似, 保持了典型的两阶段式只是由于 AmyP-Clo 的比活提高, 整个降解率均提高对优势底物大米生淀粉 (5%), AmyP-Clo 在 4 h 的最终降解率达到 (42.7±1.1)%, 是 AmyP 的 2.8 倍, 是商品化的 PPA 的 3.8 倍这表明 AmyP-Clo 是一个具有优良应用价值的酶另外,AmyP-Clo 对玉米生淀粉的降解率虽然也显著提高为 AmyP 的 3.3 倍, 但是 AmyP 本身对玉米生淀粉的降解能力不强,AmyP-Clo 在 4 h 的最终降解率略低于 PPA 通过融合 SBD 提高酶的活力在多个酶中获得过成功例如 : 大麦 α- 淀粉酶融合来源 Aspergillus niger 的葡糖糖化酶的 SBD [18],Bacillus acidicola 的 α- 淀粉酶融合来源 Geobacillus thermoleovorans 的 α- 淀粉酶的 SBD [19], 它们的酶活都显著增加为了验证底物结合能力与降解能力之间的关系, 我们测定了融合蛋白 AmyP-Clo 和野生型 AmyP 对生大米和玉米的结合能力 AmyP-Clo 确实对这两种生淀粉的结合能力都明显强于 AmyP, 对生大米的最高结合率是 AmyP 的 1.3 倍, 对生玉米的最高结合率是 AmyP 的 2.7 倍比较出人意外的是 AmyP-Clo 对生大米的最高结合率提高的倍数只有 1.3 倍, 但是比活增加了 3.1 倍, 最终降解率增加了 2.8 倍这也暗示了如果能寻找到与生大米淀粉结合能力更佳的 SBD, 就有进一步提高酶活的可能性参考文献 [1] Bemiller JN. Starch modification: challenges and prospects. Starch/Stärke, 1997, 49(4): [2] Buléon A, Colonna P, Planchot V, Ball S. Starch granules: structure and biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules, 1998, 23(2): [3] Sun HY, Zhao PJ, Ge XY, Xia YJ, Hao ZK, Liu JW, Peng M. Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 160(4): [4] Robertson GH, Wong DWS, Lee CC, Wagschal K, Smith MR, Orts WJ. Native or raw starch digestion: a key step in energy efficient biorefining of grain. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(2): [5] Ueda M, Asano T, Nakazawa M, Miyatake K, Inouye K. Purification and characterization of novel raw-starch-digesting and cold-adapted α-amylases from Eisenia foetida. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 150(1): [6] Lei Y, Peng H, Wang Y, Liu YT, Han F, Xiao YZ, Gao Y. Preferential and rapid degradation of raw rice starch by an α-amylase of glycoside hydrolase subfamily GH13_37. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(6): [7] Lomthong T, Chotineeranat S, Kitpreechavanich V. Production and characterization of raw starch degrading enzyme from a newly isolated thermophilic filamentous bacterium, Laceyella sacchari LP175. Starch/Stärke, 2015, 67(3/4): [8] Tawil G, Viksø-Nielsen A, Rolland-Sabaté A, Colonna P, Buléon A. Hydrolysis of concentrated raw starch: a new very efficient α-amylase from Anoxybacillus flavothermus. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): [9] Božić N, Ruiz J, López-Santín J, Vujčić Z. Production and properties of the highly efficient raw starch digesting α-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC 9945a. Biochemical Engineering Journal, 2011, 53(2): [10] Liu Y, Lei Y, Zhang XC, Gao Y, Xiao YZ, Peng H. Identification and phylogenetic characterization of a new subfamily of α-amylase enzymes from marine microorganisms. Marine Biotechnology, 2012, 14(3): [11] Peng H, Zheng YY, Chen MJ, Wang Y, Xiao YZ, Gao Y. A starch-binding domain identified in α-amylase (AmyP) represents a new family of carbohydrate-binding modules that contribute to enzymatic hydrolysis of soluble starch. FEBS Letters, 2014, 588(7): [12] Tanaka T, Ishimoto E, Shimomura Y, Taniguchi M, Oi S. Purification and some properties of raw starch-binding amylase of Clostridium butyricum T-7 isolated from actamicro@im.ac.cn

7 王静等微生物学报, 2017, 57(8) 1307 mesophilic methane sludge. Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51(2): [13] Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): [14] Tahir R, Ellis PR, Butterworth PJ. The relation of physical properties of native starch granules to the kinetics of amylolysis catalysed by porcine pancreatic α-amylase. Carbohydrate Polymers, 2010, 81(1): [15] Hamilton LM, Kelly CT, Fogarty WM. Raw starch degradation by the non-raw starch-adsorbing bacterial alpha amylase of Bacillus sp. IMD 434. Carbohydrate Research, 1998, 314(3/4): [16] Peng H, Lei Y, Liu YT, Wang Y. Degradation of raw corn starch by an α-amylase (AmyP) from marine environment. China Biotechnology, 2012, 32(7): (in Chinese) 彭惠, 雷寅, 刘源涛, 汪颖. 海洋环境来源的淀粉酶 AmyP 对生玉米淀粉的降解特性. 中国生物工程杂志, 2012, 32(7): [17] Iefuji H, Chino M, Kato M, Iimura Y. Raw-starch-digesting and thermostable α-amylase from the yeast Cryptococcus sp. S-2: purification, characterization, cloning and sequencing. Biochemical Journal, 1996, 318(3): [18] Juge N, Nøhr J, Le Gal-Coëffet MF, Kramhøft B, Furniss CSM, Planchot V, Archer DB, Williamson G, Svensson B. The activity of barley α-amylase on starch granules is enhanced by fusion of a starch binding domain from Aspergillus niger glucoamylase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2006, 1764(2): [19] Parashar D, Satyanarayana T. A chimeric α-amylase engineered from Bacillus acidicola and Geobacillus thermoleovorans with improved thermostability and catalytic efficiency. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2016, 43(4): Hydrolysis of raw rice starch by a chimeric α-amylase engineered with α-amylase from Clostridium butyricum T-7 Jing Wang, Lu Zhai, Xiaohan Zhang, Fengling Li, Yazhong Xiao, Hui Peng * Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, School of Life Sciences, Anhui University, Hefei , Anhui Province, China Abstract: [Objective] To obtain efficient raw rice starch-digesting enzymes. [Methods] α-amylase AmyP can hydrolyze raw rice starch efficiently. We constructed a chimeric α-amylase (AmyP-Clo) by fusion of the catalytic domain of AmyP and a starch binding domain of α-amylase from Clostridium butyricum T-7. [Results] AmyP-Clo retained the advantages of AmyP, and increased catalytic efficiency towards raw rice starch. The specific activity was (373.9±8.4) U/mg. The final hydrolysis degree was (42.7±1.1)% for the hydrolysis of 5% raw rice starch suspension after 4 h. The maximal fraction of bound protein was (71.1±1.6)%. [Conclusion] AmyP-Clo could efficiently hydrolyze raw rice starch. Keywords: α-amylase, raw rice starch, chimeric protein, starch binding domain ( 本文责编 : 张晓丽 ) Supported by the National Natural Science Foundation of China ( ) and by the Science Fund for Distinguished Young Scholars of Anhui Province, China (170808J04) * Corresponding author. Tel: ; pph0259@126.com Received: 31 March 2017; Revised: 2 June 2017; Published online: 9 June 2017

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌