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1 植物细胞组织培养 王美 山东大学生命科学院南楼南小楼 104 室 欢迎各位同学! 1

2 第一讲绪论 概念及基本原理 植物细胞组织培养的过程简介 植物细胞培养的发展简史 本门课程的基本框架 2

3 ( 一 ) 概念 : 一 概念及基本原理 植物细胞组织培养 (Plant Cell and Tissue Culture) : 分离植物体的一部分甚至单个细胞, 离体培养于合适的培养介质上 / 中 ( 无菌条件下的培养基 / 培养液 ), 在可控培养条件下进行繁殖及生长 3

4 植物组织培养中的几个概念 外植体 (Explant( Explant): 由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体 脱分化 (Dedifferentiation( Dedifferentiation): 由高度分化的植物器官 组织或细胞产生愈伤组织的过程, 称为植物细胞的脱分化 愈伤组织 (Callus): 外植体脱分化后, 形成的具有分生能力的薄壁细胞团 再分化 (Redifferentiation( Redifferentiation): 脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官, 这一过程称为植物细胞的再分化 4

5 ( 二 ) 植物组织培养类型 : 根据不同分类的依据可以分为不同类型 1 根据培养材料不同分为 : (1) 完整植株培养 (Plant Culture): 对幼苗和较大植株等的培养 (2) 胚胎培养 (Embryo Culture): 包括成熟胚 幼胚 子房 胚珠等的培养 (3) 器官培养 (Organ Culture): 包括离体根 茎 叶 果实 种子 花器官的培养 (4) 组织培养 (Tissue Culture): 如分生组织 薄壁组织 输导组织培养 (5) 细胞培养 (Cell Culture): 指对单细胞或较小的细胞团进行培养 (6) 原生质体培养 (Protoplast Culture): 指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养 5

6 矮牵牛茎尖离体培养 6

7 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖 7

8 微型月季茎段离体培养 8

9 花烛叶片离体快速繁殖 9

10 大蒜根尖培养及植株再生 10

11 2 根据再生途径分为 : (1) 器官发生途径 (Organogenesis): 直接器官发生途径 : 植物器官可以直接由外植体上诱导 如茎尖培养 间接器官发生途径 : 成熟细胞经过脱分化 (dedifferentiation) 及再分化 (redifferentiation) 过程而形成新的组织和器官的过程 如叶片培养 (2) 体细胞胚胎发生 (Somatic embryogenesis): 体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程 经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体 (embryoid) 或体细胞胚 (somatic embryo). 11

12 直接器官发生 间接器官发生 体细胞胚胎发生 12

13 贯叶金丝桃不定芽直接再生过程 13

14 非洲紫罗兰叶片直接培养 优化培养基 无蔗糖 1% 蔗糖 5% 蔗糖 无 BAP BAP 0.1mg/l 无 NAA BAP 5.0mg/l 14

15 台湾百合离体培养 15

16 器官发生途径 ( 原球茎的形成 ): 大花蕙兰原球茎增殖与植株再生 16

17 大蒜愈伤组织培养 17

18 禾本科牧草的体胚发生过程 18

19 菊花体细胞胚胎发生及植株再生 19

20 大蒜体细胞胚胎发生过程 目前, 已在 200 多种被子植物中观察到体细胞胚发生过程 20

21 人工种子 (Artificial seed,synthetic Seed): 是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中, 从而形成能发芽出苗的颗粒体作为繁殖材料 21

22 22

23 3 根据培养基的类型分为 : (1) 固体培养 (Solid culture): 琼脂 卡拉胶等固化 (2) 半液半固体培养 (Semisolid Culture): 固液双层 (3) 液体培养 (Liquid Culture): 震荡 旋转或静置培养 23

24 固体培养 : 液体培养 24

25 细胞悬浮培养 (Plant Cell Culture) 指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞 ( 或小细胞团 ) 进行培养, 形成单细胞无性系或再生植物的技术 25

26 3 基本原理 : 细胞学说及细胞全能性 26

27 a, 细胞学说 (cell theory) 最初由德国植物学家施莱登 (M. Schleiden) 和德国动物学家施万 (T. Schwann) 提出的学说 一切生物都由细胞组成 细胞是生命的结构单位 细胞只能由细胞分裂而来 27

28 b, 细胞全能性 (totipotency) 指多细胞生物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息, 具备在合适条件下发育成完整生物体的潜在遗传能力 细胞全能性高低与细胞分化程度有关 分化程度越高, 细胞全能性越低 植物细胞全能性高于动物细胞, 而生殖细胞全能性高于体细胞, 在所有细胞中受精卵的全能性最高 28

29 二 植物细胞组织培养的过程简介 离体的植物器官 组织 细胞 ( 外植体 ) 脱分化 愈伤组织 再分化 丛芽 不定根 植物体 29

30 培养条件 含有全部营养成分的培养基 无菌环境 一定的温度 空气 适合的 PH 适时光照等 培养对象 离体的植物器官 组织 细胞 结果及目的 获得稳定细胞培养系或 再生完整植株 30

31 三 植物细胞培养的发展简史 31

32 探索阶段 Haberlandt 1902 发表了以紫鸭跖草 ( Tradescantia ) 部分叶片栅栏组织的组织培养现象 仅观察到细胞的生长及细胞壁的加厚, 未见细胞分裂 直到 年左右, 由于动物细胞培养技术的突破产生的推动, 植物细胞培养技术才重新开始起步 32

33 Robbins 与 Kotter 于 1922 年分别报道离体培养根尖获得成功 Rehwald 1927 以胡萝卜及其它植物为材料, 使植外体免受病原物感染, 并形成愈伤组织 Laibach (1929), 将亚麻种间杂交幼胚体外培养成熟, 证明了胚培养在植物远缘杂交的可能性 33

34 奠基阶段 1933 年, 李继侗和沈同研究银杏的胚培养, 将银杏胚乳提取物加入培养基 1934 年,White, 用番茄根建立了第一个活跃生长的无性系, 使根的离体培养首次获得了真正成功 ;1937; 年, 他将 3 种 B 族维生素 ( 吡哆醇 硫胺素及烟酸 ) 代替酵母提取物并获成功 1934 年,Gautheret, 发现了在挪威槭 ( Acer pseudoplatanus ) 形成层细胞体外的细胞分裂及生长, 但这些愈伤组织在 18 个月后停止生长 该时期, 吲哚乙酸 (indole( acetic acid; IAA ) 的作用被发现 其作为植物激素, 在植物细胞的分裂及愈伤组织的生长中起作用 34

35 Gautheret (1939) 获得长期稳定生长的形成层植外体愈伤组织, 但需要 IAA 存在 而 White( ) ) 发现, 不施加 IAA,, 粉蓝烟草 (Nicotiana glauca) ) 及美花烟草 ( Nicotiana langsdorffii) ) 的体细胞杂交细胞系也可以长期生长 以该杂交细胞诱导成的植株, 也可以在生长素不存在的情况下生长 35

36 1952 年,Morel, 和 Martin 通过茎尖分生组织培养获得大丽花的无毒植株 1953 年,Muir, 将万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中, 摇床振荡培养, 获得单细胞及细胞团悬浮培养物, 并继代繁殖 1955 年,Miller, 发现激动素 (Kinetin( Kinetin), 比腺嘌呤活性高 3 万倍 1958 年,Steward, 等报道在以胡萝卜韧皮部细胞培养中, 形成了体细胞胚, 并发育成完整植株, 证实了植物细胞的全能性 36

37 Skoog and Miller (1957) ) 利用烟草的髓组织作为植外体, 检验了细胞生长素 (Auxin( Auxin)/ 细胞分裂素 (Cytokinin( Cytokinin) ) 的比值变化对愈伤组织器官分化的影响 在生长素占优势的情况下, 促进不定根的发育 ; 细胞分裂素占优势的情况下, 促进地上茎部分的发育 37

38 因此, 由于在胡萝卜及烟草中取得的巨大成就, 二者长期作为细胞组织培养的模式材料, 直到近年才为拟南芥 ( Arabidopsis thaliana ) 所替代 但在该阶段的研究中, 主要的研究目的是揭示不同植物组织的生理功能, 推论其在植物体生命活动中的可能作用 期间,White, 的基本培养基 (White s s basal medium) ) 应用广泛, 但培养材料多为愈伤组织 38

39 迅速发展阶段 20 世纪 60 年底初, 全合成的营养基质开始替换复杂的 自然的未知组分 ( 如 coconut milk or yeast extracts ), 形成了以 Murashige Skoog medium (Murashige( and Skoog 1962) 为主的培养基质, 在适用不同的要求时添加不同的培养成分 这就是著名的 MS 培养基 39

40 1960 年,Cocking, 以纤维素酶处理番茄根细胞, 获得原生质体, 开创了原生质体培养及体细胞杂交技术 同年,Morel, 利用兰花茎尖培养, 实现了脱毒及快速繁殖两个目的, 使兰花工业兴起 1964 年,Guha, 及 Maheshwari 成功培养曼陀罗花药获得单倍体植株, 促进了利用单倍体培养技术加速常规育种的开展 1967 年,Bourgin, 及 Nitsch 获得烟草花药培养而来的单倍体植株 40

41 1970 年,Carlson, 通过离体培养获得生化突变体 同年,Power, 等首次成功实现原生质体融合 1971 年,Takebe, 首次利用烟草原生质体培养获得再生植株, 促进了体细胞杂交技术的发展, 为外源基因注入提供了理想受体材料 1972 年,Carlson, 以原生质体融合方法获得两个烟草物种的体细胞杂种 1974 年,Kao, Michayluk 和 Wallin 等建立了 PEG 转化法, 提高了体细胞杂交技术的成功率 1978 年,Melchers, 等获得番茄及马铃薯的体细胞杂交体 41

42 1978 年,Murashige, 提出了人工种子 (Artificial( Seed) 的概念 : 通过组织培养技术, 可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体, 也叫作体细胞胚 这种体细胞胚有于叶 根 茎分生组织的结构 把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构, 即人工种子, 使其具备种子机能 1981 年,Larkin, 和 Scowcroft 提出了体细胞无性系变异 (Somaclonal Variation) ) 的概念 1982 年,Zimmermann, 开发了原生质体电融合法 20 世纪 80 年代中期, 大豆 小麦等主要农作物原生质体再生植株相继成功, 并与体细胞杂交技术结合, 加快育种 同时期, 土壤农杆菌介导的基因转化法成功应用于植物基因转化, 加快了植物基因工程研究进程 42

43 1983 年,Zambryski, 等利用农杆菌转化法, 获得转基因烟草, 是首例转基因植物 1985 年,Horsch, 建立了农杆菌介导的叶盘法转化方法 1987 年,Sanford, 发明了基因枪法 (Gene( Gun;Particle Bombardemnt), 实现了对单子叶植物的转化 植物遗传转化是当前植物细胞组织培养的研究热点, 并开始了大规模种植及商业应用 43

44 四 本门课程的基本框架及研究意义 课程基本内容 植物细胞组织培养的应用 44

45 本门课程的主要内容 绪论 基本技术及设备 植物的离体形态发生 (In vitro Mophogenesis) 植物的胚胎培养 (Embryo( Embryo Culture) 植物的茎尖分生组织培养 (Meristem Culture) 单倍体细胞培养 (Haploid( Haploid Culture) 植物细胞培养 (Plant Cell Culture) 原生质体培养 (Protoplast culture) 体细胞培养 (Somatic( Somatic Hybridization) 体细胞无性系变异 (Somaclonal( Variation) 植物遗传转化 (Plant( Plant Genetic Transformation) 45

46 植物细胞组织培养的应用 植物育种 植物脱毒及离体快繁 次生代谢产物生产 种质资源保存和交换 在遗传 生理生化及病理研究上的应用 46

47 在植物育种中的应用 技术 : 单倍体培养 胚培养 体细胞杂交 细胞突变体筛选及遗传转化 花粉培养 --- 单倍体植株 --- 秋水仙素处理染色体加倍 --- 纯合基因型个体, 加速育种 已获得烟草 水稻 小麦 油菜等优良品种 胚培养可以克服远缘杂交不亲和, 使自然条件下不能完成发育的幼胚发育成熟, 获得杂种后代 体细胞杂交, 可以打破物种间生殖隔离, 创造新物种, 获得选育新材料 利用细胞水平的突变频率高的特点, 处理细胞获得新的突变体 用遗传转化法, 获得优良品质 ( 抗虫 抗旱等 ) 的作物品系 47

48 花粉 花药培养产生单倍体植株 48

49 体细胞无性系变异筛选 49

50 幼胚拯救克服远缘杂交障碍 50

51 用于基因工程技术创造植物新种质 51

52 在植物脱毒和离体快繁上的应用 是目前植物细胞组织培养应用最多 最有成效的方面之一 病毒侵染是植物 ( 特别是无性繁殖植物 ) 品种退化 产量降低 品质下降的重要原因, 但生长点附近病毒浓度很低或无病毒 茎尖脱毒的应用 : 马铃薯 甘薯 大蒜 苹果及香蕉等 离体快繁的应用 : 观赏植物 经济林木及作物等 52

53 virus-free tissue 茎尖培养脱毒 53

54 兰科植物生产 54

55 A B C E F G 花烛属植物 55

56 厥类植物 56

57 盆栽及切花植物的繁殖 57

58 珍贵树种 58

59 无菌苗快速繁殖 59

60 组培苗驯化移栽 60

61 61

62 62

63 在次生代谢产物生产上的应用 利用植物细胞组织的大规模培养, 可以高效生产各类天然化合物, 如蛋白质 脂肪 糖类 药物 香料 生物碱 天然色素及其它活性物质 生物制药等 63

64 在植物种质资源保护和交换上的应用 目的 : 保护珍贵 濒危的植物资源 优点 : 节省人力 物力及土地, 安全且不受季节 气候及地理因素的影响 ; 便于地区及国际间的交流 64

65 在遗传 生理生化及病理研究中的应用 植物组织细胞培养所建立的技术, 已经成为植物相关研究领域的常规手段 花药及花粉培养获得的单倍体及纯合二倍体, 是遗传研究如基因的功能, 染色体同源性研究的理想材料 细胞培养中的染色体及基因变异, 为染色体工程及育种提供了新的材料 65

66 本节课程回顾 植物细胞组织培养的定义 基本原理 基本流程 基本分类 实际应用 66

67 下列有关细胞全能性的含义, 正确的是 : A 每个生物体内的所有细胞都具有相同的功能 B 生物体内的任何一个细胞可以完成该个体的全部功能 C 生物体的每一个活细胞都具有发育成完整个体的潜能 D 生物体的每个细胞都经过产生 分裂 分化 生长 衰老 死亡的全过程 正确答案 : C 67

68 在生物体内, 细胞没有表现出全能性, 而是分化为不同的组织 器官, 是因为 : A 细胞丧失了全能性 B 基因的表达有选择性 C 不同的细胞内基因不完全相同 D 在个体发育的不同时期, 细胞内的基因发生了变化 正确答案 : B 68

69 植物组织培养形成的愈伤组织, 再进行培养, 又可以分化形成根 芽等器官, 这一过程称为 : A 脱分化 C 再分化 B 去分化 D 脱分化或去分化 正确答案 : C 69

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