加强研究型大学建设,提升高校国际竞争力 ——中国发展论坛上海交通大学校长的发言

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1 第二篇人工繁殖技术 第 2 讲植物人工繁殖 第 1 节植物组织培养

2 上节课预习思考题 : 1. 为什么植物组织培养能实现植物大规模繁殖? 2. 与传统繁殖途径的优点在哪里?

3 本讲知识点 1. 组织培养再生植物 2. 人工种子 本节重要问题 1. 激素在细胞分化中的调节作用 2. 植物经组织培养的再生途径

4 蓬莱蝶 好素 虎蕊 闻香蝶

5 芝兰生於深谷, 不以无人而不芳 君子修道立德, 不为困穷而改节 孔子 清馨淡雅 空谷幽兰 赵孟坚春兰图

6 达摩登录世界最贵植物 达摩兰产生台湾东部, 达摩日语即不倒翁的意思, 花中带花 徐木盛先生 1971 采集自山野, 及其稀少, 一般每芽百万元台币以上, 是兰花爱好者追求的极品 兰花组织培养 : 旧时王榭堂前燕, 飞入寻常百姓家

7 重要知识回顾 1. 细胞全能性 (totipotency): 是指分化细胞保留着全部的核基因组, 具有生物个体生长 发育所需要的全部遗传信息, 具有发育成完整个体的潜能 2. 细胞分化 (Differentiation): 是指细胞在形态 结构和功能上发生差异的过程, 包括时间上和空间上的分化

8 3. 脱分化 (Dedifferentiation): 又称去分化, 是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程, 即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程 脱分化后的植物细胞经过细胞分裂, 产生无组织结构 无明显极性的松散的细胞团, 称之为愈伤组织 (Callus)

9 4. 再分化 (Redifferentiation): 是指在离体 条件下, 无序生长的脱分化的细胞在适当条件下 重新进入有序生长和分化状态的过程 脱分化与再分化的关系 : 离体培养植物组织或细胞再生植株就是通过细胞脱分化和再分化实现的 脱分化是细胞全能性表现的前提, 再分化是细胞全能性的最终体现, 是再生的基础

10 一植物组织培养 (Plant tissue culture) 定义 : 植物组织培养是将植物器官 组织 细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上, 在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术

11 ( 一 ) 植物组织培养的优点 1. 周期短, 便于人工控制培养条件 繁殖速度快, 经济效益高 2. 占用空间小, 不受地区 季节限制 3. 繁殖珍稀 濒危苗木和突变体, 是优良品种培育的有效途径 4. 利于保持原来品种的特性 形象称为 试管植物

12 ( 二 ) 植物组织培养的应用 1. 快速繁殖 : 例如一株兰花一年可以繁殖到 400 万株 2. 种苗脱毒 : 可以有效地培育出大量的无病毒种苗 已经取得成功的有马铃薯 草莓 香蕉等 3. 突变育种 : 可以直接诱变筛选出具抗病 抗盐以及高赖氨酸 高蛋白等优良性状的品种 4. 基因工程育种 : 基因转导后通过组织培养途径实现植株再生 5. 远缘杂交 : 利用离体受精技术和组织培养结合可以实现远缘杂交, 培育一些罕见的新物种 例如苹果与梨的杂交种

13 1. 生物条件 ( 三 ) 植物组织培养技术 外植体 (Explant) 主要指用于离体培养的植物或组织切段 因素 : 不同植物品种 同一品种不同取材部位 发育阶段 一般 : 生长点 幼嫩组织

14 2. 物理条件 : 培养环境 组织培养室 无菌环境, 人工控制温度 光照 湿度等培养条件 需要一定的设备 器材和用具, 同时还需要

15 3. 化学条件 : 培养基 (1) 无机盐 培养基中无机盐的浓度通常在 25mmol/L 左右 根据添加量多少分为大量元素 ( 浓度大于 0.5mmol/L) 和微量元素 ( 浓度低于 0.5mmol/L) 大量元素 : 主要有氮 硫 磷 钾 钙 镁 氮 硫 磷是蛋白质 氨基酸 核酸和酶的主要成分 微量元素 : 主要包括铁 锰 铜 锌 氯 硼 钼等 这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要, 并参与生物过程的调节

16 (2) 有机物 常用的有机物 : 糖类 氨基酸 维生素 醇类等 糖类 : 既可以作为碳源, 又可以维持渗透压 最常用的碳源是蔗糖, 葡萄糖和果糖也是较好的碳源 麦芽糖 半乳糖 甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用 蔗糖使用浓度在 2% 3% 氨基酸 : 是很好的有机氮源 最常用的氨基酸是甘氨酸, 其他的如精氨酸 谷氨酸, 谷酰胺 天冬氨酸 天冬酰胺 丙氨酸等也常用 通常采用蛋白质水解产物 ( 包括酪蛋白水解物 ) 谷氨酰胺或氨基酸混合物

17 维生素 : 对植物生长 分化等有促进作用 大多数植物组织培养通常需加入一至数种维生素 : 盐酸硫胺素 (Thiamine,V B1 ) 盐酸吡哆醇 (Pyridoxin,V B6 ) Vc( 抗坏血酸 ) 有时还使用生物素 叶酸 V B12 等 V B1 对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,V B6 能促进根的生长 Vc 有防止组织变褐的作用 肌醇 : 对糖类的相互转化有促进作用 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成 对组织和细胞的繁殖 分化有促进作用, 对细胞壁的形成也有作用 腺嘌呤 : 是合成细胞分裂素的前体物质之一 添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素, 有利于细胞的分裂和分化, 促进芽的形成

18 (3) 调节物质 植物激素 (Phytohormone): 是植物自然状态下产生的 对生长发育有显著作用的微量有机物 能影响生长和分化 在个体发育中, 不论是种子发芽 营养生长 繁殖器官形成以至整个成熟过程, 主要由激素控制 植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后, 影响 DNA RNA 和蛋白质的合成, 并对特殊酶的合成起调控作用, 从而表现出调节代谢的功能

19 生长素 (auxin) 生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的 在植物组织培养中, 生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化 常用的生长素有 : 吲哚乙酸 (IAA) 2,4- 二氯苯氧乙酸 (2,4-D) 萘乙酸 (NAA) 吲哚丁酸 (IBA) 等 IAA 活力较弱 NAA IBA 是促进发根能力较强的生长调节物质, 广泛用于生根, 并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 2,4 D 起动能力比 IAA 高 10 倍, 特别在促进愈伤组织的形成上活力最高, 但它强烈抑制芽的形成

20 细胞分裂素 (Cytokinin) 细胞分裂素大多是嘌呤族衍生物, 自然状态下分裂素主要在根中形成 ; 茎端 种子 果实也能合成分裂素 分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长 促进细胞分裂与扩大 多用于诱导不定芽的分化和茎 苗的增殖 在生根培养时使用较少或用量较低 主要有激动素 (KT) 6- 苄基腺嘌呤 (BA) 和玉米素 (ZT) 等 其中最常用的是 6 苄基腺嘌呤 其中 ZT 活性最强, 但昂贵 ; 常用的是 6 BA

21 植物激素控制器官形成 1956 年米勒 (Miller) 与斯库格 (Skoog) 提出 高 : 利于根和愈伤组织形成 生长素 适中 : 有利于根芽的分化 分裂素 低 : 有利于芽的形成

22 (4) 培养基及分类 富盐平衡培养基 : 是目前使用最广泛的一类, 代表性的培养基有 MS LS BL BM ER 等 特点是 : 无机盐浓度高, 微量元素种类齐全, 浓度高 ; 元素间比例适当, 离子平衡性好, 具有较强的缓冲能力 稳定性好 营养丰富, 一般培养时无需再加入有机成分 中盐培养基 : 代表性培养基有 Nitsch Miller Blaydes H 大多是在 MS 培养基基础上进行改良设计 特点是 : 大量元素无机盐为 MS 的一半, 微量元素种类减少 含量增高 维生素种类比 MS 增多, 例如增加了生物素 叶酸等 低盐培养基 : 代表性培养基有 White WS HE HB 特点是 : 无机盐 有机成分含量浓度低, 多用作生根培养的培养基 高硝态氮培养基 : 代表性培养基有 B5 N6 SH 特点是 : 硝酸钾浓度高, 氨态氮浓度低, 含有较高浓度的硫胺素 (VB1)

23 4. 植物组织培养再生植株的途径 (1) 器官发生途径 : 成熟细胞 愈伤组织 出根出芽 完整植株 (2) 体细胞胚发生途径 : 成熟细胞 分生细胞 胚状体 完整植株

24 以胡萝卜为例

25 器官发生途径 (1) 启动期 : 启动诱导外植体细胞脱分化和分裂 培养基中添加一定浓度 种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化, 重新获得分裂能力 需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂 ( 如 NAA IAA 2-4D 等 ) 或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂 (2) 愈伤组织诱导 : 即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程 这个阶段一般需要降低激素浓度, 有些情况下甚至不需要生长素和分裂素

26 (3) 拟分生组织的形成 : 将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养, 细胞内部开始发生一系列形态和生理变化, 分化出形态和功能不同的细胞 在若干部位出现类似形成层的细胞群, 通常称为 生长中心, 又可称为 拟分生组织 该过程是器官发生的一个转变时期 (4) 器官原基和器官的形成 : 拟分生组织形成后, 一些细胞分化成为管状细胞, 进而形成维管组织, 形成不同的器官原基, 进一步分化出相应的组织和器官 调节激素比例, 促进生根 发芽

27 体细胞胚发生途径 体细胞胚 (Somatic embryo) 又叫胚状体, 是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物 体细胞胚发生途径 : 是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程 体细胞胚起源于非合子细胞, 因此不同于合子胚

28 (1) 器官外植体直接发生途径 茎表皮 叶 子叶 下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体 以叶片为外植体直接形成体细胞胚为例, 一般经过两个阶段 : 1) 诱导期 叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受刺激后进入分裂状态, 形成小的瘤状突起 ; 2) 胚胎发育期 瘤状物继续发育, 经过球形胚 心形胚等阶段最后形成体细胞胚

29 (2) 悬浮培养细胞发生途径 : 在悬浮培养的细胞中一些细胞可以产生胚性细胞团, 一个胚性细胞团可以发育成一个胚状体, 也可以产生多个胚状体 这种方式可以得到大量的胚状体 (3) 愈伤组织发生途径 : 愈伤组织内部或表面细胞均可以产生胚状体 包括三个阶段 : 1) 诱导外植体形成愈伤组织 ; 2) 诱导愈伤组织胚性化 ; 3) 体细胞胚形成

30 5. 植物组织培养存在的问题 (1) 玻璃化问题 植物组织培养中, 常会出现一些半透明状的畸形试管植物, 这类植物体被称为 玻璃苗, 这种现象称为玻璃化 (Vitrification) 现象, 又称过度水化现象 由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常, 因此分化能力低, 难以增殖成芽, 也难以生根成苗, 移栽大田更难成活, 已成为组培的一大问题 组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题, 是不能很好适应培养基和培养环境的结果

31 (2) 褐变问题 褐变 (Browning) 可分为酶促褐变和非酶促褐变, 主要是酶促褐变 酶促褐变是由多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase, PPO) 催化多酚类化合物, 使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水 ; 醌类物质经过非酶促聚合, 形成黑褐色物质 ( 羟醌与黑色素等 ), 引起褐变的发生

32 (3) 微生物污染 造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌 外部污染菌 : 主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成 内源菌 : 外植体带菌引起的污染与外植体的种类 取材季节 部位 预处理及消毒方法等密切相关 应该严格按照无菌操作, 取材时应选择嫩梢 新芽或胚作为外植体材料, 对外植体进行彻底消毒

33 (4) 品种限制 目前被子植物组织培养成功的比较多 裸子植物很难脱分化诱导成具有全能性的细胞, 因此组织培养成功的比较少 对于人工诱导体细胞的脱分化, 不同生物的细胞脱分化能力不同, 决定了组织培养再生的难以

34 6. 植物组织培养应用举例 寒兰叶姿碧绿清秀 香气沁人, 是秋冬不可多得的名花, 花期 天

35 培养技术 注意愈伤组织诱导 发芽 生根过程中激素等调节物质的选择 总路线 : 以寒兰种子萌发后形成的根状茎为外植体, 对类原球茎诱导 增殖 分化 材料 : 以寒兰种子萌发后形成的根状茎为外植体

36 1) 类原球茎诱导愈伤组织培养基 : B5+TDZ( 噻苯隆 )0-0.80mg/L+NAA( 萘乙酸 ) mg/L; 噻苯隆 (Thidiazuron): 一种植物生长调节剂, 具有极强的细胞分裂活性 NAA( 萘乙酸 ): 生长素

37 2) 继代增殖培养基 : B5+ 优康唑 mg/L+NAA mg/L+ 蔗糖 2-5% ( 降低了 NAA 浓度, 增加了调节物质 ) 烯效唑属三唑类化合物, 具有强烈生长调节功能

38 3) 分化培养基 : B5+ 烯效唑 mg/L+6-BA(6- 苄基腺嘌呤 ) mg/l+naa mg/l; 蔗糖浓度为 3.5%( 较高的分裂素比例 ) 6-BA: 细胞分裂素 类原球茎芽 当类原球茎上分化出的幼苗长到 3-5cm 时, 切割转到生根培养基中进行生根培养

39 4) 生根培养基 : B5+AC( 活性炭 )0.05%, NAA0.20mg/L 和琼脂粉 0.68% 蔗糖浓度为 3.5% ( 去掉了分裂素, 生长素利于生根 )

40 谢谢

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( ) 5. 自 行 車 有 吱 吱 喳 喳 的 聲 音 可 能 是 什 麼 原 因 所 造 成?(1) 鈴 號 的 聲 音 (2) 螺 栓 ( 帽 ) 鬆 動 (3) 腳 踏 板 磨 損 ( ) 6. 下 列 敘 述 何 者 是 對 的?(1) 輪 胎 的 胎 壓 是 愈 高 愈 好, 所 以 填 一 是 非 題 :( 每 題 2 分, 共 20 分 ) ( )1. 發 生 交 通 事 故 時, 為 了 使 失 去 知 覺 的 傷 者 儘 快 恢 復 意 識, 應 向 傷 者 拍 打 搖 動 ( )2. 腳 踏 自 行 車 煞 車 壞 掉 不 修 沒 關 係, 因 為 用 腳 也 可 以 煞 車 ( )3. 雖 然 腳 踏 自 行 車 速 度 比 機 車 慢, 但 是 為 了 安 全 起 見,

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