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1 第 40 卷第 3 期 2018 年 3 月湖北大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Hubei University( Natural Science) Vol. 40 No. 3 May,2018 文章编号 : (2018) 一种美味猕猴桃金魁快速无性繁殖方法陈永勤 1, 詹婧娴 1, 胡城 1, 陈琪琪 1 2, 王彦昌 (1. 湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心, 湖北武汉 ; 2. 中国科学院武汉植物园, 湖北武汉 ) 摘要 : 研究不同植物激素对美味猕猴桃金魁成熟叶的不定芽分化芽增殖与生根的影响以及组培苗的移栽技术. 结果表明,TDZ( 噻苯隆 ) 比 BA(6 苄基氨基嘌呤 ) 更有利于不定芽的诱导, 在含 1 mg / L TDZ 和 0. 2 mg / L NAA( 萘乙酸 ) 培养基上, 不定芽诱导率达到 90% 以上 ; 通过茎段培养, 芽在含 0. 3 mg / L BA 和 0. 5 mg / L GA 3 ( 赤霉素 ) 培养基上 30 d 可以增殖 4. 5 倍 ; 所增殖的芽 (2 3 cm 长 ) 在含 0. 7 mg / L IBA ( 吲哚丁酸 ) 培养基上 35 d 内可以 100% 生根. 组培苗在温室里炼苗 30 d 后移到室外自然环境中, 生长健壮, 移栽 90 d 后的成活率达到 96%. 关键词 : 金魁猕猴桃 ; 成熟叶 ; 不定芽 ; 植株离体再生 ; 快速无性繁殖中图分类号 :Q 文献标志码 :A DOI: / j.issn A rapid clonal propagation protocol of kiwifruit cultivar Jinkui ( Actinidia chinensis var. deliciosa) CHEN Yongqin 1, ZHAN Jingxian 1, HU Cheng 1, CHEN Qiqi 1, WANG Yanchang 2 (1. Faculty of Life Sciences and Hubei Collaborative Innovation Centre for Green Transformation of Bio Resources, Hubei University, Wuhan , China; 2. Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan , China) Abstract: Effects of plant hormones on adventitious bud induction from mature leaves of Actinidia chinensis var. deliciosa cultivar Jinkui, bud multiplication and rooting were investigated. The results showed that TDZ was much more effective than BA in bud induction, and more than 90% of the mature leaf explants initiated adventitious buds on the medium supplemented with 1 mg / L TDZ and 0. 2 mg / L NAA; averagely, buds multiplied 4. 5 folds by nodal culture within 30 days on the medium containing 0. 3 mg / L BA plus 0. 5 mg / L GA 3 ; and all the shoots 2 3 cm long rooted well when they were cultured on the medium with 0. 7 mg / L IBA within 35 days. The regenerated plantlets grew healthily after they were acclimated in greenhouse for 30 days and then cultured under natural environment; the survival rate of the plantlets was 96% after 90 days of transplantation. Key words: Jinkui kiwifruit; mature leaf; adventitious bud; in vitro plant regeneration; rapid clonal propagation 0 引言猕猴桃为猕猴桃科猕猴桃属 (Actinidia) 植物, 其果富含对人有益的维生素氨基酸胡萝卜素和花青素, 尤其是维生素 C 含量高, 具有很高的营养价值和良好的保健功能. 我国是猕猴桃的故乡, 也是猴桃种植大国. 目前, 栽培的猕猴桃多为中华猕猴桃 (A. chinensis) 品种, 其次有美味猕猴桃 (A. chinensis var. deliciosa, 中华猕猴桃的变种 ) 和软枣猕猴桃 (A. arguta). 收稿日期 : 作者简介 : 陈永勤 ( ), 男, 博士, 教授, 博士生导师, E mail:chenyongqin@ hubu. edu. cn

2 302 湖北大学学报 ( 自然科学版 ) 第 40 卷金魁是湖北省农业科学院果树茶叶研究所选育的一个美味猕猴桃优良品种. 其平均果重 100 g 以上, 最大可达 250 g, 果肉汁多味美甜酸可口, 含可溶性固形物 18% 25%, 总糖 13% 有机酸 1. 6% 1. 8%, 维生素 C 含量 mg / 100 g [1 3]. 由于具有品质佳丰产性好抗逆性强耐贮运货架期长等优点, 近 10 多年来金魁是我国猕猴桃的主栽品种之一, 其栽培技术已有不少报道 [2 7]. 然而, 金魁猕猴桃的扦插生根比较困难, 生产上常用嫁接繁殖, 但用生长素 IBA ( 吲哚丁酸, Indole 3 butyric acid) 处理金魁猕猴桃插穗, 并在温床上扦插, 可使生根率达到 80% [8]. 众所周知, 利用植物组织培养技术繁殖植物具有速度快效率高, 并可以对植物进行脱菌脱毒等优点. 但有关金魁猕猴桃组培技术报道极少. 黄胜男等以茎段培养得到的金魁猕猴桃无菌苗叶片为外植体, 研究了细胞分裂素 6 BA(6 苄基氨基嘌呤,6 benzylaminopurine) 和生长素 NAA ( 萘乙酸,1 Naphthaleneacetic acid) 对不定芽诱导的影响, 发现 3 mg / L 6 BA 和 0. 2 mg / L NAA 的组合不定芽诱导率最高 (94% ), 不定芽在含 0. 7 mg / L IBA 培养基上的生根率为 100%, 但他们没有报道芽增殖和组培苗移栽方法 [9]. 本文报道植物激素对金魁猕猴桃成熟叶分化不定芽芽增殖与生根的影响, 以及组培苗的移栽方法, 总结出一套高效可行的金魁猕猴桃组培快繁技术. 1 材料与方法 1. 1 材料金魁猕猴桃完全伸展健康的叶片采于中国科学院武汉植物园外植体的消毒叶片用自来水和洗涤剂清洗后, 在含 1% 有效氯的次氯酸钠溶液 ( 含 0. 2% 吐温 20) 中消毒 15 min, 然后用无菌水漂洗 3 次. 将叶片边缘切除后, 再将叶片切成 0. 5 cm 0. 5 cm 的小块, 接种在含不同浓度萘乙酸 (NAA) 和 6 苄基氨基嘌呤 (6 BA 或 BA) 或噻苯隆 (TDZ) 的不定芽诱导培养基上. 不定芽诱导试验为 50 d 芽的增殖培养将叶片形成的不定芽切下接种在无激素的培养基上. 1 个月后, 再将芽 ( 长的芽切成 2 3 段 ) 转到含 0. 5 mg / L GA 3 ( 赤霉素 ) 的培养基上. 将在此培养基上增殖的芽切成 cm 长的小段, 每段带 1 2 个芽, 接种到含不同浓度 BA 和 GA 3 的培养基 ( 表 2) 上, 以寻找适合其增殖的激素组合. 1 个月后, 再将增殖的芽切成小段, 接种在新鲜的增殖培养基上, 进一步验证芽的增殖效果. 芽的常规增殖在含 0. 3 mg / L BA 和 0. 5 mg / L GA 3 培养基上进行芽的生根与组培苗移栽将在增殖培养基上形成的芽切成 2 3 cm 长 ( 带顶芽 ) 接种在含 0 1 mg / L IBA( 吲哚丁酸, 生长素 ) 培养基上进行生根试验. 生根培养持续 5 周. 将在 0. 7 和 1. 0 mg / L IBA 培养基上再生的组培苗移至温室, 打开瓶盖,3 d 后取出组培苗, 并用自来水清洗, 移栽到盛有基质的塑料盆中, 基质由的田园土泥炭土和河沙组成. 温室内温度为 23 27, 湿度为 60% 80%. 组培苗移栽时浇足水, 以后等基质表面稍干时再浇, 但对出现萎蔫的组培苗及时补水. 一个月后, 将苗移至室外, 适时浇水培养基与培养条件本实验中所用的基本培养基为大量元素减半的 MS 培养基 [10], 含 20 g / L 蔗糖和 8 g / L 琼脂. BA TDZ NAA 和 IBA 等植物激素购自美国 Sigma 公司, 其他试剂均为国产分析纯. 叶片不定芽诱导培养基含 0. 2 mg / L NAA 和 1 5 mg / L BA 或 1 2 mg / L TDZ, 增殖培养基含 mg / L BA 和 0. 5 或 1. 0 mg / L GA 3 ( 赤霉素 ), 生根培养基含 0 1 mg / L IBA. 所有培养基 ph 值为 5. 8, 在 121 下消毒 15 min. 培养室温度为 (25 ± 1), 光照强度为 μmol m - 2 s - 1, 光周期为 16 h 数据分析各试验均重复 3 次, 利用 IBM SPSS 软件对数据进行方差分析和邓肯检验 ( Duncan s test,α = 0. 05), 百分数先转换成反正弦后再进行统计分析. 2 结果与分析 2. 1 愈伤组织和不定芽的诱导接种 3 4 d 后, 不同培养基上的叶块都有所增大, 随后边缘处形成愈伤组织, 进而分化不定芽. 细胞分裂素的种类 (BA 和 TDZ) 和浓度对愈伤组织和不定芽的诱导有很大的影响 ( 表 1). 在含 1 2 mg / L BA 的培养基上, 叶块大约在培养 2 周后形成愈伤组织 6 周后出现不定

第３期３０３陈永勤等一种美味猕猴桃金魁快速无性繁殖方法芽５０ｄ后不定芽形成率分别为５６和２９０在含３和５ｍｇＬＢＡ的培养基上叶块大约８１０ｄ后出现愈伤组织５周后形成了不定芽图１ａ最终愈伤组织和不定芽形成率分别达为１００和４５５０在含１或２ｍｇＬＴＤＺ培养基上所有叶块在７ｄ内形成愈伤组织３

3 第３期３０３陈永勤等一种美味猕猴桃金魁快速无性繁殖方法芽５０ｄ后不定芽形成率分别为５６和２９０在含３和５ｍｇＬＢＡ的培养基上叶块大约８１０ｄ后出现愈伤组织５周后形成了不定芽图１ａ最终愈伤组织和不定芽形成率分别达为１００和４５５０在含１或２ｍｇＬＴＤＺ培养基上所有叶块在７ｄ内形成愈伤组织３周后开始出现不定芽最终不定芽诱导率达到９０以上甚至１００但两种浓度ＴＤＺ所诱导的芽在形态上有很大的差异在１ｍｇＬＴＤＺ培养基上形成的芽比较正常图１ｂ而在２ｍｇＬＴＤＺ培养基上愈伤组织生长旺盛所形成的芽大都出现玻璃化症状图１ｃ表１ＢＡ和ＴＤＺ浓度对金魁猕猴桃成熟叶外植体形成不定芽的影响细胞分裂素ｍｇＬＢＡ１ＴＤＺ２３５愈伤组织形成率不定芽形成率５６６ ± １１ａ５６ ± １１ａ９３３ ± １９ｂ２８９ ± ２９ｂ５００ ± １９ｃ１２同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不具有统计学意义 α ００５图１４５５ ± ２２ｃ９２２ ± １１ｄ１０００ ± ００ｅ金魁猕猴桃成熟叶不定芽诱导增殖与植株再生Ａ在含３ｍｇＬＢＡ培养基上形成不定芽的叶块Ｂ在含１ｍｇＬＴＤＺ培养基上形成不定芽的叶块Ｃ在含２ｍｇＬＴＤＺ培养基上形成不定芽的叶块Ｄ在含ｍｇＬＧＡ３与０ｍｇＬＢＡ左１０１ｍｇＬＢＡ左２０３ｍｇＬＢＡ右２和ｍｇＬＢＡ右１培养基上的茎段所形成的新幼茎Ｅ在含０７ｍｇＬＩＢＡ培养基上生根的植株Ｆ在含１ｍｇＬＩＢＡ培养基上生根的植株基部愈伤组织生长旺盛２２芽的增殖培养叶片形成的不定芽转到无激素的培养基上后生长并不理想一个月内只有少许伸长将芽长的芽切成小段转到含ｍｇＬＧＡ３的培养基上后芽的生长得到显著改善培养４周后大部分茎段可以长成３４ｃｍ长的幼茎但有部分茎段没有长出新芽为了研究ＢＡ和ＧＡ３浓度对芽增殖的影

３０４第４０卷湖北大学学报自然科学版响我们将芽切成小段接种到含不同浓度ＢＡ和ＧＡ３的培养基上结果表明或ｍｇＬＧＡ３促进芽伸长生长的效果都比较好两者没有明显差异但芽的生长与ＢＡ浓度有关在无ＢＡ时带顶芽的茎段都能伸长而不带顶芽的茎段只有部分大约５０６０可以长出１个幼茎在含０１ｍｇＬＢＡ的培养基上大约９０

4 ３０４第４０卷湖北大学学报自然科学版响我们将芽切成小段接种到含不同浓度ＢＡ和ＧＡ３的培养基上结果表明或ｍｇＬＧＡ３促进芽伸长生长的效果都比较好两者没有明显差异但芽的生长与ＢＡ浓度有关在无ＢＡ时带顶芽的茎段都能伸长而不带顶芽的茎段只有部分大约５０６０可以长出１个幼茎在含０１ｍｇＬＢＡ的培养基上大约９０的芽段可以长出１个幼茎在含０３和ｍｇＬＢＡ的培养基上每个芽段可以长出２幼茎图１ｄ因而增殖系数４６２３植株再生与移栽生长４９显著高于无ＢＡ和０１ｍｇＬＢＡ的处理表２ＩＢＡ对金魁芽生根有显著的促进作用在无ＩＢＡ的基本培养基上金魁芽生根晚生根率低根数少而在含周后生根率达到７０３个１ｍｇＬＩＢＡ培养基上芽在接种７１００每株平均根数达到３３９ｄ后开始生根５８５条均显著高于对照表３虽然１ｍｇＬＩＢＡ可以促进芽多生根但同时也显著促进了愈伤组织的形成和生长而且许多根是由愈伤组织形成的图２ｆ而在含０７ｍｇＬＩＢＡ培养基上芽基部只形成很少的愈伤组织根几乎都是由芽直接形成的生根质量好图２ｅ表２ＧＡ３和ＢＡ浓度对金魁猕猴桃芽增殖的影响激素ｍｇＬＧＡ３ＢＡ０００３０１０１０３表３ＩＢＡ浓度对金魁猕猴桃芽生根的影响芽生长率增殖系数ＩＢＡｍｇＬ最早出现根时间生根率平均根数株５８９ ± ２２ａ２６ ± ０１ａ０１５４６７ ± ３６ａ１６ ± ０１５ａ０７７９２２ ± １１ｂ３３ ± ０２ｂ４７ ± ０１ｃ４９ ± ０２ｃ９６６ ± １９ｂ３２ ± ０１ｂ１０００ ± ００ｃ４６ ± ０１ｃ１０００ ± ００ｃ４８ ± ０１ｃ９７７２５ ± ２９ｂ３３ ± ０２７ｂ８５ ± ０７５ｄ５２ ± ０３８ｃ同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不显著 α ００５同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不具有统计学意义 α ００５将在含０７和ｍｇＬＩＢＡ培养基上再生的植株移栽到温室７１０ｄ后植株有所伸长幼叶明显增大但这两种组培苗的后来生长出现明显差异在０７ｍｇＬＩＢＡ培养基上形成的组培苗一直生长良好一个月后成活率达到１００移至室外自然条件后也生长正常图２两个月后的成活率达到９６在１ｍｇＬＩＢＡ培养基上再生的部分组培苗在温室栽培２周后开始出现萎蔫补浇水并不能使其恢复最终死亡移栽一个月后的成活率只有４４图２移栽３个月后的金魁猕猴桃组培苗拔起死亡植株后发现这些植株基部原有的愈伤组织及根已变黑腐烂３讨论建立高效的不定芽诱导方法对于猕猴桃快速繁殖及转基因植株的培育都具有重要意义还可以用于培育多倍体猕猴桃１１美味猕猴桃是栽培猕猴桃的重要类型之一有关其叶片不定芽诱导方法已有一些报道但都是以组培苗的幼嫩叶片为外植体不定芽诱导的最佳激素组合因品种不同而有所不同如秦美为６０ｍｇＬＢＡ０１ｍｇＬＮＡＡ１２海沃德为３ｍｇＬＢＡ０１ｍｇＬＮＡＡ３０ｍｇＬＢＡ０２ｍｇＬＮＡＡ９诱导率可以达到８０以上Ｗｕ等１１用０９１１３金魁为６８４ μｍｏｌＬ玉米素ｚｅａｔｉｎＺＴ诱导中华猕猴桃品种Ｈｏｒｔ１６Ａ幼叶外植体形成不定芽时发现不同叶块间形成不定芽的差异很大有的叶块可以形成多个芽有的则不能形成芽具体的不定芽诱导率未说明在本研究中金魁猕猴桃成熟叶在含１５ｍｇＬＢＡ与０２ｍｇＬＮＡＡ培养基上分化不定芽的效率比较低最高为５０但在含ｍｇＬＴＤＺ与０２ｍｇＬＮＡＡ的培养基上不定芽诱导率可以达到９０以上表１说明当使用ＴＤＺ作为细胞分裂素时金魁成熟叶同样可以高效率分化不定芽王顺才等１４和Ｚｈａｎｇ等１５也分别发现ＴＤＺ诱导海沃德猕猴桃叶片和葡萄Ｗｉｎｋ品种叶片形成不定芽的效果显著

5 第 3 期陈永勤, 等 : 一种美味猕猴桃金魁快速无性繁殖方法 305 好于 BA 和 ZT. 在无激素培养基上金魁茎段侧芽的生长率低, 且伸长少. 但在含 mg / L BA 和 0. 5 mg / L GA 3 的培养基上, 芽的增殖得到显著改善, 一个月内所有茎段可以形成了 2 3 个 2 4 cm 高的幼茎, 增殖系数达到倍. 这是由于细胞分裂素 (BA) 能刺激茎段侧芽萌动生长赤霉素 (GA 3 ) 能促进芽伸长生长的缘故. 本研究中金魁芽的增殖效率与报道的中华猕猴桃红阳 [16] 和美味猕猴桃海沃德 [13] 芽的增殖效率相当, 但这些猕猴桃的芽增殖培养基中 BA 浓度比较高 (2 4 mg / L). 组培苗的生根质量对其移栽成活率影响很大. IBA 和 NAA 是诱导猕猴桃生根最常用的激素, 其效果因猕猴桃种类品种而异. 黄胜男等报道金魁芽在和 0. 8 mg / L IBA 培养基上的生根率分别为 78% 100% 和 55. 6% [9]. 我们的金魁芽生根试验结果 ( 表 3) 与黄胜男等的结果基本一致, 但我们发现在 1. 0 mg / L IBA 培养基上金魁芽也可以 100% 生根, 只是芽基部的愈伤组织生长比较旺盛, 根多由愈伤组织形成. 移栽后, 这种组培苗由于基部的愈伤组织容易受到微生物感染而腐烂, 造成死苗移栽成活率低. 因此, 诱导金魁芽生根的 IBA 浓度还是以 0. 7 mg / L 为佳. 总之, 金魁猕猴桃成熟叶外植体在含 1. 0 mg / L TDZ 和 0. 2 mg / L NAA 培养基上可以高效分化不定芽 ; 不定芽形成之后, 可以通过茎段培养在含 0. 3 mg / L BA 和 0. 5 mg / L GA 3 的培养基上反复增殖, 一个月增殖倍 ; 所增殖的芽在含 0. 7 mg / L IBA 培养基上可以 100% 生根, 形成完整的植株. 根据本试验所建立的方法, 以一个金魁猕猴桃成熟叶片为起始材料, 一年内可以生产出数百万小苗. 该方法对于金魁猕猴桃的种苗生产及转基因植株的培育有很好的参考价值. 4 参考文献 [1] 胡一民. 极品猕猴桃金魁 [J]. 中国土特产, 1997, 2: 25. [2] 陈启亮. 金魁猕猴桃优质丰产栽培技术 [J]. 南方园艺, 2003(1) : 20. [3] 韩飞, 刘小莉, 钟彩虹. 不同类型果袋对金魁猕猴桃果实品质的影响 [J]. 中国果树,2017( 3) : [4] 敖礼林, 岳峰, 冷建华, 等. 金魁等晚熟美味猕猴桃大面积优质高产栽培技术 [ J]. 中国南方果树, 2002, 31(2): [5] 姜景魁, 乐训权, 陈细慧. 美味猕猴桃金魁的整形修剪试验 [J]. 现代园艺, 2011, 10: [6] 鄢帮有, 陈葵, 严玉平, 等. 三定三控技术对金魁猕猴桃产量与品质的影响 [J]. 江西农业大学学报, 2012, 34 (6) : [7] 黄春辉, 曲雪艳, 刘科鹏, 等. 金魁猕猴桃园土壤理化性状叶片营养与果实品质状况分析 [J]. 果树学报, 2014, 31(6): [8] 高本旺, 周鸿彬, 张双英, 等. 金魁猕猴桃温床硬枝扦插育苗 [J]. 林业实用技术, 2003, 8: 6 7. [9] 黄胜男, 张计育, 毛妮妮, 等. 美味猕猴桃品种金魁离体叶片不定芽诱导及生根培养基筛选 [J]. 植物资源与环境学报, 2016,25( 1) : [10] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture [ J]. Physiologia Plantarum, 1962,15: [11] Wu J H, Ferguson A R, Murray B G. Manipulation of ploidy for kiwifruit breeding: in vitro chromosome doubling in diploid Actinidia chinensis Planch [ J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2011, 106 (3): [12] 樊军锋, 李玲, 韩一凡, 等. 秦美猕猴桃叶片最佳再生系统的建立 [J]. 西北植物学报, 2002,22 (4): [13] 吴秀华, 张艳玲, 周月, 等. 海沃德猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立 [ J]. 植物生理学报, 2013, 49 (8): [14] 王顺才, 马锋旺, 徐凌飞. 细胞分裂素和生长素对美味猕猴桃离体叶片再生的影响 [ J]. 园艺学进展 ( 第六辑 ), 2004(6): [15] Zhang P, Yu Z Y, Cheng Z M, et al. In vitro explants regeneration of the grape Wink (Vitis vinifera L. Wink ) [J]. Journal of Plant Breeding and Crop Science, 2011, 3(11): [16] 隆前进, 吴延军, 谢鸣. 红阳猕猴桃叶片和带芽茎段的组织培养快繁技术 [ J]. 浙江农业学报,2010, 22 (4): ( 责任编辑 : 游俊 )

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