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1 第七讲体细胞杂交

2 内容回顾 1) ) 什么是原生质体? 有什么特点? 如何分离? 原生质体 : 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞 特点 : 无细胞壁, 质膜直接与外界接触, 利于摄取外来遗传物质 便于进行细胞融合, 形成杂交细胞 仍具有全能性 分离方法 : 机械分离法及酶解分离法

3 2) ) 获得的原生质体活性的检测方法有哪几种? 目测法 FDA 法 伊凡蓝法 :

4 3) ) 原生质体培养成为再生植株包括哪几个过程? 细胞壁再生 -- 细胞分裂与生长 -- 愈伤组织形成 -- 植株再生

5 4) ) 原生质体培养的用途及意义? 基础理论研究 体细胞杂交 遗传转化 无性系变异及突变体的筛选 细胞器的分离与导入 种质资源保存

6 本讲主要内容 体细胞杂交 杂种细胞的筛选 杂种细胞培养和杂种植株再生 体细胞杂种的鉴定 体细胞杂交技术的应用

7 一 : 体细胞杂交 体细胞杂交的概念 体细胞杂交的发展历程 原生质体融合的原理 方法 过程及分类 原生质体融合的影响因素

8 1 体细胞杂交的概念 在外界因素作用下, 两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程 但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁, 不能直接融合, 需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体, 在适当条件下来源不同的植物原生质体经融合作用形成一个杂种细胞, 因此, 体细胞杂交又称原生质体融合 (Protoplast( Fusion)

9 2 体细胞杂交的发展历程 1960 年,Cocking, 用酶解法制备高等植物原生质体首次获得成功 1962 年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒 (HVJ)( 能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象 1970 年,Power, 首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合 1974 年,Kao, 将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术 1978 年,Melchers, 获得了第一个属间细胞杂种 ( 番茄 + 马铃薯 ) 1981 年,Zimmerman, 发明了电融合仪, 并首次提出了电融合概念 1987 年,Schweiger, 建立了单对原生质体电融合技术程序

10 3 原生质体融合的原理 方法 过程 1) ) 原生质体融合的原理 及分类

11 主要环节

12 关键 : 细胞核的融合

13 2) ) 原生质体融合的方法 自发融合 (Spontaneous( Fusion) 1909 年,Kuster, 报道了原生质体偶发的融合现象 在酶解原生质体过程中, 有些相邻原生质体可以融合 诱发融合 (Induced( Induced Fusion) 生物法 化学法 物理法

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15 化学法 NaNO 3 融合法 高 ph- 高 Ca 2+ 融合法 PEG 融合法 结合法 ( 如 PEG- 高 ph- 高 Ca 2+ 融合法 ) 细胞膜的电荷平衡被打破

16 NaNO3 诱导融合

17 高 PH 值的高浓度 Ca 2+ 融合

18 PEG 诱导原生质体融合方法 PEG: (Polyethylene glycol, 聚乙二醇 ) 是一种多聚化合物, 分子式为 H(OHCH 2 -CH 2 ) n OH) 常用的 PEG 平均分子量在 ,000 之间, 分子量 1,000 以下者为液体,1,000 以上者为固体 PEG 分子具有轻微的负极性, 故可以与具有正极性基团的水 蛋白质和碳水化合物等形成 H 键, 从而在在原生质体之间形成分子桥, 使原生质体发生粘连 融合

19 PEG- 高 ph- 高 Ca 2+ 融合法

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21 物理法 电融合法 电融合诱导法 (Electrofusion): 利用电场来诱导细胞彼此连接成串, 再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿, 促进细胞融合的技术 原理 : 在直流电脉冲的刺激下, 细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变, 使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂, 进而连接, 直到闭和成完整的膜形成融合体 优点 : 融合率高 重复性与可控制性强 缺点 : 可能会造成不可恢复的细胞损伤

22 BLS 细胞融合仪

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26 3) ) 原生质体融合的过程 异种原生质体 膜融合形成共同的质膜 胞质融合 产生细胞壁 核融合 细胞核的融合是异种原生质体融合的关键 融合体只有成为单核细胞后才能继续生长, 才能合成 DNA RNA, 并进行细胞分裂, 这就要求两个核必须同步分裂

27 4) ) 原生质体融合的分类 从亲本来源来分 同核体 (Homokaryon): 基因型相同的细胞融合成的融合细胞 异核体 (Heterokaryon): 来自不同基因型的融合细胞 从融合效果来分 对称融合 (Symmetric fusion): 两个完整的细胞间的融合 不对称融合 (Asymmetric fusion): 利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合

28 4 原生质体融合的影响因素 原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用, 高质量的原生质体是细胞融合的首要条件 融合方法 融合参数, 包括各种融合液都应选择适当, 或融合电压, 电击时间等

29 二杂种细胞的筛选 筛选的原因及必要性 : 细胞融合是一个随机的物理过程, 经融合处理的原生质体群体中, 细胞将以多种形式出现, 需要通过培养和筛选, 除去不需要的细胞, 分离出需要的杂种细胞 譬如物种 A 的原生质体与物种 B 的原生质体融合, 则融合后的原生质体群体中的类型包括 : A-B,A-A,B-B A-A-A,B-B-B,A-A-B, B-B-A 等多聚体 未融合的 A,B

30 方法 : 细胞互补方法 : 利用或创造缺陷型或抗性细胞系, 以选择性培养基筛选杂种细胞 物理特性的差异 ( 细胞大小 颜色 细胞核 DAPI 染色等 ) 再生植株的性状筛选

31 三杂种细胞培养和杂种植株再生 与原生质体的培养方法相似 对于无法在融合后进行杂种细胞筛选的, 将所有融合产物培养, 然后对再生植株进行杂种鉴定

32 四体细胞杂种的鉴定 体细胞杂种的鉴定方法 体细胞杂种的遗传特性 细胞质杂种

33 1 体细胞杂种的鉴定方法 形态学鉴定方法 细胞学鉴定方法 生化鉴定方法 分子生物学鉴定方法

34 形态学鉴定方法 是最常用的鉴定方法 根据双亲的形态学性状观察进行鉴定 仅能作为参考, 需结合其他鉴定方法

35 细胞学鉴定方法 经典细胞学鉴定方法 对染色体数目 形态等鉴定方法 分子细胞学鉴定方法 基因组原位杂交 (GISH( GISH,Genomic Genomic in situ hybridization): 根据染色体组 DNA 分子的同源性差异, 对某一染色体或某个物种染色体组 DNA 进行标记, 以探针进行杂交鉴定的方法

36 生化鉴定方法 即同工酶鉴定方法 同工酶是功能相同的酶的多重分子形态, 是特异基因的产物 体细胞杂种的同工酶谱往往具有双亲酶谱的总和, 或带有新的杂种带 常用的是酯酶及过氧化物酶

37 分子生物学鉴定方法 RFLP( ( 限制性片段长度多态,Restriction, Fragment Length Polymorphism) RAPD ( 随机扩增多态,Random, Amplified Polymorphic DNA) AFLP ( 扩增片段长度多态,Amplification, Fragment Length Polymorphism) SSR ( 简单重复序列 :Simple: Sequence Repeat)

38 RFLP( ( 限制性片段长度多态 ) 是指一个物种或品种的 DNA 长度多态性, 反映了 DNA 序列的差异 以限制性内切酶对融合亲本及再生植株的 DNA 酶切, 琼脂糖凝胶电泳分离大小不同片段, 转膜到硝酸纤维素膜, 用标记的探针 Southern 杂交, 放射自显影鉴定

39 RAPD ( 随机扩增多态 ) 是在 PCR 基础上发展起来的分子标记技术 以基因组 DNA 为模板, 以 1 个随机寡聚核苷酸序列 ( 通常 10bp 左右 ) 为引物,PCR, 扩增, 产生不连续的 DNA 产物, 电泳分析 应用最为广泛

40 AFLP ( 扩增片段长度多态 ) 先将植物 DNA 经限制性内切酶双酶切后, 然后将双链接头连接到 DNA 片段的末端, 接头序列和相邻的限制性位点序列, 作为引物结合位点进行 PCR AFLP 扩增在某一品种出现特定的 DNA 谱带

41 SSR ( 简单重复序列 ) 高等生物中普遍存在 1-6 个碱基组成的简单重复序列, 两侧是相对保守的单一序列, 根据两侧序列设计引物进行 PCR 扩增, 获得特定位点 SSR 的长度 反映了不同基因型个体在 SSR 位点的多态性

42 2 体细胞杂种的遗传特性 体细胞杂种的核型 细胞分裂与染色体丢失 基因转移与性状表达 体细胞杂种遗传上的不稳定性

43 体细胞杂种的核型 极少数品种出现是真正的双二倍体 ( 染色体数恰为双亲染色体数之和 ) 即便是有性杂交亲和的亲本之间的体细胞杂种, 也出现染色体数不正常现象 与多个细胞融合有关 与融合方法及选择体系有关

44 细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合, 在以后的发育过程中就会有两种结果 一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡 ; 二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失 如果这样就会产生几种情况 : A 细胞 +B + 细胞质 ; A 细胞 +B + 细胞质和部分染色体或基因

45 基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失, 常常使某个亲本的染色体部分片段或个别基因与另一亲本的染色体发生整合, 其结果是实现了亲本间的基因转移 基因转移通常是在后代中某些性状得以表达, 有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状

46 体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定 这涉及到多方面的因素, 如亲缘关系的远近 培养过程中的染色体变异 细胞核 细胞质遗传物质的重组等

47 3 细胞质杂种 (Cybrid( Cybrid) 应用细胞杂交技术, 获得的具有特定核基因组与两种不同的细胞质遗传物质 ( 细胞器 ) 的杂种细胞及个体 有性杂交中细胞质主要来源于母本, 体细胞杂交来源于双亲 细胞质遗传 : 由胞质遗传物质引起的遗传现象, 又称非染色体遗传

48 遗传物质的分类

49 细胞质杂种的特点 细胞质的遗传物质的选择, 是独立于核基因组的 植物烟草的杂种细胞中, 核及线粒体都出现有杂种, 但叶绿体仅出现一个亲本的来源 可以用来转移胞质遗传控制的雄性不育性状 胞质杂种的来源 : 一个正常来源的原生质体与一个胞质体融合 一个正常来源的原生质体与一个核失活的原生质体融合 异核体形成后,1, 个物种的核消失 较晚时期的染色体的选择性消除

50 五体细胞杂交技术的应用 创造植物新类型 为杂交育种提供新材料 通过原生质体摄入细胞器 微生物及外源 DNA

51 1 创造植物新类型 Melchers 等 1978 年的 Pomato/Topato 甘蓝 X 白菜杂种, 已获可育植株 水稻 X 胡萝卜杂种 ( 单子叶与双子叶 )

52 作物改良 2 为杂交育种提供新材料 山融三号小麦 抗病烟草 油菜 马铃薯抗病性 抗旱甘薯 培育植物雄性不育系和恢复系 胞质遗传控制的雄性不育 烟草 水稻

53 3 通过原生质体摄入细胞器 微生物及 叶绿体转移 外源 DNA 胡萝卜原生质体可以摄入藻类叶绿体 核移植 矮牵牛 烟草及玉米的原生质体可以摄入矮牵牛的离体核 微生物转移 将固氮菌及蓝绿藻类微生物导入植物 外源 DNA 的摄入 实现遗传转化

54 属间体细胞杂交实 例

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62 体细胞杂交的问题及发展趋势 体细胞杂交面临的困难 融合特性的高效性 杂种细胞的培养和选择 杂种的遗传稳定性控制 体细胞杂交研究的发展趋势 诱导融合的程序化控制研究 杂种细胞的各种生理 生化 遗传机理的研究 各种类型原生质体 ( 胞质体 核质体 细胞器 ) 的制备技术研究 杂种细胞培养技术的程序化研究

63 本讲内容总结 体细胞杂交 杂种细胞的筛选 杂种细胞培养和杂种植株再生 体细胞杂种的鉴定 体细胞杂交技术的应用

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程汉良 夏德全 吴婷婷 孟学平 吉红九 董志国 陈淑吟 对文蛤 青蛤 硬壳蛤 江户布目蛤 薄片镜蛤 和菲律宾蛤仔 种帘蛤科贝类和 个地理种 群文蛤 大连 连云港 湛江 防城港 的细胞色素 氧化酶亚基 基因片段的核苷酸序列进行了分析 以探讨这一序列在种质鉴定 种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值 测序结果 表明 所有物种扩增片段长度均为 序列 含量 明显高于 含量 物种间共有变异位点 个 其中简约信息位点

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