探究不同

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州蹇萧
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1 组织培养报告探究不同激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系姓名 : 郭林学号 : 组员 : 覃治祯日期 :2014 年 11 月 13 日

2 目录摘要... 2 关键词背景材料和方法实验材料组织培养环境试剂和器材实验试剂实验仪器实验方法培养基的配制外植体前处理与接种观察产生愈伤组织愈伤组织的培养结果诱导率形态学讨论与分析外植体的选择内源激素对愈伤组织诱导的关系外源激素对愈伤组织诱导的影响... 9 参考文献附录

3 探究激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系摘要 : 本实验以 MS 培养基为基础培养, 分别在 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 和 MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L 两种培养基上对烟草叶片进行愈伤组织的诱导, 探究相同烟草叶片不同激素 6-BA 和 NAA 浓度配比对烟草叶片愈伤组织诱导的关系结果表明在 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导出的愈伤组织更利于叶的分化, 且诱导出的愈伤组织的体积较大, 在 MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L 培养基上诱导出的愈伤组织更利于根的诱导, 且诱导出的愈伤组织的体积较小关键词 : 烟草, 脱分化, 愈伤组织, 培养基, 激素 0 背景我国大多数师范院校都普遍开设植物生理学或植物生物技术类实验课程, 其中植物组织培养技术作为一项基础技术成为必修实验我校植物组织培养实验属于植物生理学实验课的一部分, 实验内容以诱导叶片脱分化形成愈伤组织为主实验部分仍然按照传统的教学环节进行培养基配制 (3 学时 ) 和无菌操作 (3 学时 ), 着重实验技术的指导与学习根据植物细胞全能性的原理, 特别是在生长素和细胞分裂素的作用下, 植物可以脱分化成愈伤组织烟草 (Nicotiana tabacum), 茄科, 多年生植物, 是重要的模式生物, 因此也被我校选为植物组织培养的材料众所周知, 生长素在植物体内分布是不均匀的, 嫩叶中生长素分布较多, 老叶中分布较少, 在诱导植物形成越伤组织的过程中, 内源激素在一定程度上也起着重要的调节作用除此之外, 选取的外源激素的浓度配比不同都会对愈伤组织有一定影响胡伟陈豫伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现, 在以萝卜直根为实验材料, 不同激素 NAA 2,4-D 6-BA 浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响 [1] 20 世纪 50 年代以来, 烟草愈伤组织的诱导遵循 Skoog-MiUer 分化模式 : 培养基内生长素和细胞分裂素的浓度和比值制约芽 2

4 和根的分化这一原则被广泛地应用于植物组织培养实践细胞分裂素的浓度低, 生长素的浓度高时易形成愈伤组织 ; 反之, 细胞分裂素浓度高, 生长素的浓度低时, 有利于芽的分化本课题实验选用烟草叶片, 进行愈伤组织的诱导, 并观察其在不同激素浓度的培养基上的诱导情况 1 材料和方法 1.1 实验材料烟草 (Nicotiana tabacum) 叶片 1.2 组织培养环境培养条件为 28, 暗处理一周后, 进行 24 小时光照培养如图 1 所示图表 1 烟草愈伤组织培养环境 Fig.1 Tobacco callus culture environment. 1.3 试剂和器材实验试剂等 MS 培养基 ( 配方见附录 ) 琼脂蔗糖 6-BA,NAA,75% 酒精,0.1%HgCl 2 3

5 1.3.2 实验仪器烧杯玻璃棒量筒容量瓶漏斗培养室无菌室超净工作台高压灭菌锅三角烧瓶移液枪棉线培养皿滤纸解剖刀剪刀镊子牛皮纸称量纸天平酒精灯打火机直尺 1.4 实验方法培养基的配制本实验选用 MS 培养基为基础培养基加不同配比的激素及浓度激素配比如表 1 所示表 1 两个实验组激素的浓度配比 6-BA NAA 第一组 1mg/L 0.2mg/L 第二组 0.1mg/L 0.5mg/L 称取 15g 蔗糖溶解于 100mL 水, 定容到 500mL 配制 MS 培养基, 平均分装到两个锥形瓶中并按照表 1 所示加入激素配比调节 PH 至 5.8, 然后分别分装到 5 个装有 0.4g 琼脂的 100mL 锥形瓶中, 用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶口, 棉线扎牢, 然后将培养基和解剖工具装有滤纸的培养皿蒸馏水一起在高压灭菌锅中 121,20 分钟灭菌备用外植体前处理与接种选取健壮的烟草叶片在自来水下将表面的灰尘及杂质冲洗掉, 切成小快 ; 在无菌室用 75% 酒精侵洗 30s, 然后用无菌水洗 3-5 次 ; 叶片放于 0.1% 升汞溶液中浸泡 3-5min, 然后无菌水洗 3-5 次, 滤纸吸干 ; 把叶片切成 1.5cm*1.5cm 小块, 转移植物到培养基中进行培养, 每瓶 3 块 4

6 1.4.3 观察产生愈伤组织观察愈伤组织的分化情况直至长出根和芽, 比较不同激素条件下诱导的愈伤组织的差别愈伤组织的培养将接种好的烟草愈伤组织放入恒温培养室中, 温度为 28, 暗处理一周后, 进行 24 小时光照培养对培养 20 天后的烟草愈伤组织诱导率进行统计学分析, 并对成形的愈伤组织进行观察, 且从接种的第 1 天到第 45 天对烟草叶片的变化情况进行观察记录 2 结果 2.1 诱导率接种 15 天后对不同培养基上愈伤组织数量进行统计, 从是否出现愈伤组织的情况来看 : MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L 培养基和 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 培养基两种培养基上诱导出的愈伤组织的诱导率相同, 即愈伤组织的诱导率与激素的配比无直接关系如表 2 所示表 2 两种培养基上的诱导率 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2mg/L MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 外植体个数污染个数愈伤组织数污染率诱导率 (%) 注 : 诱导率 =( 产生愈伤组织的叶片数 / 接种的叶片数 ) 100% 2.2 形态学在两种培养基上接种的烟草叶片的变化历程为 : 接种后的第 4 天,MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 和在 MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 两种培养基上的叶片边缘的几个角都与培养基接触, 其他部分脱离培养基呈现拱形 ; 接种后的第 6-9 天,MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上的烟草叶片, 与培养基接触的 5

7 部分长出一小点的愈伤组织, 接种后的第 9-11 天, 接种在 MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 培养基上的烟草叶片, 与培养基接触的几个角出现愈伤组织 ; 愈伤组织逐渐从边缘像中间生长, 最终几乎整个烟草叶片都长成愈伤组织在接种后的第 16 天,MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上的愈伤组织上出现绿色组织,MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 培养基上的愈伤组织长白色的毛状组织 ; 第 20 天后, 在 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上可明显分辨出愈伤组织分化出的叶片,0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 培养基上愈伤组织分化出的根如图 2 所示图 2 愈伤组织的生长历程但在 MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L 培养基上形成愈伤组织的时间快, 约为 6-9 天, 且形成愈伤组织的体积较大, 在 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 形成愈伤组织的时间较慢, 约为 9-11 天, 且愈伤组织的体积较小如图 3 所示 a b 图 3 不同培养基上愈伤组织大小比较注 : 图为接种第 25 天后的照片.a 为 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 培养基上生长的愈伤组织,b 为 MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L 培养基上生长的愈伤组织 6

在 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织以长叶为主, 生长一段时间后, 有少量的根状组织出现, 且组织块较大在 MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 培养基上诱导出的烟草叶片的愈伤组织以长根为主, 生长一段时间后又少量的绿色组织出现如图 4 所示 a b 图 4 接种 30 天后愈伤组织注 : 图 a 为 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.

1 外植体的选择研究表明, 外植体的选择对愈伤组织的诱导有很大影响王晓娟等人在对大花萱草不同外植体诱导愈伤组织的比较研究中发现, 外植体的取材读愈伤组织的诱导有影响内源激素对胚性细胞及体胚的形成有重要影响 [2] 范小峰, 杨颖丽, 郭晓强, 刘秀丽在对乌拉尔甘草不同外植体愈伤组织的诱导及影响因子研究中发现,

8 在 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织以长叶为主, 生长一段时间后, 有少量的根状组织出现, 且组织块较大在 MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5mg/L 培养基上诱导出的烟草叶片的愈伤组织以长根为主, 生长一段时间后又少量的绿色组织出现如图 4 所示 a b 图 4 接种 30 天后愈伤组织注 : 图 a 为 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织, 以长叶为主, 有少量的根, 图 b 为 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织, 根发到, 可见少量绿色组织 3 讨论与分析 3.1 外植体的选择研究表明, 外植体的选择对愈伤组织的诱导有很大影响王晓娟等人在对大花萱草不同外植体诱导愈伤组织的比较研究中发现, 外植体的取材读愈伤组织的诱导有影响内源激素对胚性细胞及体胚的形成有重要影响 [2] 范小峰, 杨颖丽, 郭晓强, 刘秀丽在对乌拉尔甘草不同外植体愈伤组织的诱导及影响因子研究中发现, 不同外植体对乌拉干草愈伤组织的诱导有一定影响 [3] 总的来说, 含有大量分生组织的植物器官是理想的材料烟草幼嫩叶片含有大量活跃分裂的细胞, 很适合愈伤组织的诱导实验中, 虽然取材于同一批烟草, 但由于烟草叶片的取材位置不一样, 所以不同实验组在相同培养基上愈伤组织的诱导不尽相同如图 5 所示 7

图 5 不同实验组在相同培养基上诱导情况注 : 图为接种 44 后拍摄的不同实验组在同一时间的 MS+6-BA 1

2 内源激素对愈伤组织诱导的关系植物在生长发育的过程中, 内源激素对愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响, 其种类

刘清等人在研究内源激素对水稻的研究中发现,IAA 含量过高不利用愈伤组织的诱导和生长,Z

过高的 ABA 对愈伤组织的诱导不利 [8] 内源激素一样对其有很大影响顶芽和侧芽之间有着密切的关系, 顶芽生长旺盛时,

9 图 5 不同实验组在相同培养基上诱导情况注 : 图为接种 44 后拍摄的不同实验组在同一时间的 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上接种的烟草叶片的愈伤组织的诱导剂分化情况 3.2 内源激素对愈伤组织诱导的关系植物在生长发育的过程中, 内源激素对愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响, 其种类含量极其协调平衡是关键内源激素对胚性细胞及体胚的形成有重要影响 [4,5,6,7] 刘清等人在研究内源激素对水稻的研究中发现,IAA 含量过高不利用愈伤组织的诱导和生长,Z 对愈伤组织诱导的启动有决定性作用, 如果外植体中的 Z 含量太低, 即使有较高的 IAA 含量也诱导不出愈伤组织 ; 过高的 ABA 对愈伤组织的诱导不利 [8] 内源激素一样对其有很大影响顶芽和侧芽之间有着密切的关系, 顶芽生长旺盛时, 侧芽会受到抑制如果由于某种原因顶芽生长受到抑制, 则侧芽迅速生长这种顶芽优先生长, 侧芽受到抑制的现象叫做顶端优势在 Wertheim S.J 的研究中发现苹果的冠果产生的可扩散性生长素明显高于侧位果的生长素的量 [9] Gruber J 把番茄作为实验材料, 证明先期发育的器官可以通过其向外运输的生长素抑制后发育的器官中生长素的向外运输, 从而抑制它的生长 [10] 朱庆生在文献提出, 生长素在植物体内由上到下有一个浓度梯度, 顶芽可以较快得到生长而侧芽生长受抑制 [11] 8

3.3 外源激素对愈伤组织诱导的影响外源激素对植物组织培养有着重要的影响胡伟陈豫伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现, 在以萝卜直根为实验材料, 不同激素 NAA 2,4-D 6-BA 浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响 [1] 高瑛用不同的外源激素对黄芩无菌短枝组织培养, 发现不同的外源激素对黄芩愈伤诱导有很大影响 [12]

这一原则被广泛地应用于植物组织培养实践细胞分裂素的浓度低, 生长素的浓度高时易形成愈伤组织 ; 反之, 细胞分裂素浓度高, 生长素的浓度低时, 有利于芽的分化本实验目的是探究烟草叶片在以 MS 培养基, 都含有 NAA 6-BA 两种激素, 但激素浓度配比不一样, 分别为 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 和 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.

10 3.3 外源激素对愈伤组织诱导的影响外源激素对植物组织培养有着重要的影响胡伟陈豫伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现, 在以萝卜直根为实验材料, 不同激素 NAA 2,4-D 6-BA 浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响 [1] 高瑛用不同的外源激素对黄芩无菌短枝组织培养, 发现不同的外源激素对黄芩愈伤诱导有很大影响 [12] 阮氏钏等人研究发现不同外源激素及其浓度对青钱柳愈伤组织不定芽的发生有着重大影响 [13] 葛淑芳章艺等人在研究外源水杨酸对烟草叶片代谢的影响的研究中发现, 喷施适宜浓度的 SA 能够显著提高植株叶绿素 a,b 含量 [14] 20 世纪 50 年代以来, 烟草愈伤组织的诱导遵循 Skoog-MiUer 分化模式 : 培养基内生长素和细胞分裂素的浓度和比值制约芽和根的分化这一原则被广泛地应用于植物组织培养实践细胞分裂素的浓度低, 生长素的浓度高时易形成愈伤组织 ; 反之, 细胞分裂素浓度高, 生长素的浓度低时, 有利于芽的分化本实验目的是探究烟草叶片在以 MS 培养基, 都含有 NAA 6-BA 两种激素, 但激素浓度配比不一样, 分别为 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 和 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 培养基本实验中也发现 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导出的愈伤组织更有利于叶的分, 在 MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L 培养基上诱导出的愈伤组织更有利于根的分化如图 6 所示 a b 图 6. 两种培养基上诱导的愈伤组织的分化情况注 : 图 a 为 MS+6-BA 1 mg/l +NAA 0.2 mg/l 培养基上诱导出的愈伤组织的再分化情况, 图 b 为 MS+6-BA 0.1 mg/l +NAA 0.5 mg/l 培养基上诱导出的愈伤组织的再分化情况 9

11 参考文献 [1] 胡伟, 陈豫, 伍洋. 不同激素浓度配比对胡萝卜愈伤组织形成的影响 [J]. 江苏农业科学,2014,42(7): [2] 王晓娟, 金樑, 陈家宽. 大花萱草不同外植体诱导愈伤组织的比较研究 [J]. 生命科学研究,2005,9(3) [3] 范小峰, 杨颖丽, 郭晓强, 刘秀丽. 乌拉尔甘草不同外植体愈伤组织的诱导剂影响因子研究 [J] 中药材,2009,32(2): [4]HIRISHI KAM ADA,HIROSHI HSRADA.Changes in the Rndogenous Leves and Rffect of Acid during Simatic Embryoy enesis of Daucus carota L[J].Plant and Cell Physoil.1981,22(8): [5] 郭子彪. 内源激素 IAA,ABA 对大豆猛打子页胚性愈伤组织诱导及其分化的调控 [J]. 大豆科学,1997,16(13): [6]KANNIAH RAJASEKARAN,MICH B HEIN,INBRA k.vail Endogenous Abscisic Acid and Indole-3-Acetic Acid and Somatic Embryogenesis in Cultured Leaf Explants of Pennisetum Purpureum Schum[J].Plant Physoil,1978,84:47-51 [7] 邢登辉, 赵云云, 黄乘芳. 皇冠草体细胞胚胎发生及其体胚发生过程中内源激素的变化 [J]. 生物工程学报,1999,15(1): [8] 刘清, 朱允华, 吴顺, 沈革志, 萧浪涛. 遗传转化过程中水稻愈伤组织的内源激素变化动态研究 [J]. 河南农业科学,1996(10) [9]Wertheim SJ. Manual and chemical induction of side-shoot formation in apple trees in the nursery [J].Sci. Hormone, 1978, 9:337. [10]Gruber J, Bangerth F. diffusible IAA and dominance phenomena in fruits of apple and tomato [J]. Plant Physical, 1990, 79:354. [11] 朱庆生, 侯凌锋, 吕中华. 生长素对植物生长发育调节作用的模拟 [J]. 中国农业科技导报,2008,10(4): [12] 高瑛, 不同外源激素对黄芩无菌短枝组织培养的影响 [J]. 甘肃中医学院, 10

12 2014,31(3):46-50 [13] 阮氏钏, 方升佐, 尚旭岚, 杨万霞. 青钱柳愈伤组织不定芽诱导技术 [J]. 南京林业大学学报,2014,,38(2):52-56 [14] 葛淑芳, 章艺, 梅笑漫, 肖有铁, 徐根娣, 刘鹏. 外源水杨酸对铜胁迫下烟草叶片碳代谢的影响 [J]. 水土保持学报,2014(04) 11

13 附录大量元素微量元素 Fe 盐有机物质 NH 4 NO 3 KNO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4.7H 2 O CaCl 2.2H 2 O MnSO 4.4H 2 O ZnSO 4.7H 2 O KI NaMoO 4.2H 2 O CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O FeSO 4.7H 2 O Na-RDTA 盐酸硫胺素 VBI 烟酸 VB5 盐酸吡哆醇肌醇蔗糖琼脂 g 8g/L PH

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(