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1 前 言 细胞工程是生物工程研究的重要组成部分 一切以细胞为材料的工程技术研究均可归入细胞工程研究的范围 细胞工程是一门应用性非常强的前沿学科 涉及的学科知识较多 新的研究技术和研究手段不断出现 植物细胞 动物细胞及微生物细胞等领域的研究成果丰富和发展了细胞工程的知识和应用范围 细胞工程是生命科学研究中非常活跃的前沿领域 该领域目前取得的成就有目共睹 植物细胞与组织培养 细胞转基因工程 动物胚胎工程 干细胞培养 微生物细胞工程等研究给人们带来了可喜的细胞工程应用前景 细胞培养与转基因的安全性及试管动物等工程技术同样引起人们的广泛关注 目前已有部分教材对细胞工程领域的研究成果进行了整理和出版 但有些偏向于某一个研究方向 有些偏向于技术层面 还有些偏向于应用层次 ; 再者 目前高校人才培养的大类招生与通识教育模式 导致学校为增加实践教学环节而压缩专业课课时 针对以上情况 编写一部既适合本科教育教学需要 又兼顾理论研究与实践应用 并能统筹课时需要的教材非常必要 本书的特点是理论与实际相结合 既有较全面的细胞工程基础知识和基本理论分析 又有很典型的细胞工程案例的实用示范 理论性和实用性都较强 本书较适合用作生物工程 生物技术及生物科学等生命科学领域的教材 也可供从事生命科学领域研究工作的相关人员阅读参考 本书参编人员均在各专业学科一线工作 是有着丰富理论与实践经验的生物工程领域专家 全书共 11 章 其中第一章由尤玉如 刘士旺编写 ; 第二章由黄俊 刘士旺编写 ; 第三章由徐晓辉 梁五生编写 ; 第四章由徐涛 梁五生编写 ; 第五章由戴德慧 胡伟莲编写 ; 第六章由梁五生 徐晓辉编写 ; 第七章由陈付学编写 ; 第八章由刘士旺 毛建卫编写 ; 第九章由刘士旺 毛建卫 徐晖编写 ; 第十章由刘士旺 毛建卫 魏培莲编写 ; 第十一章由魏培莲 徐晖 毛建卫编写 刘士旺负责全书的统稿 审稿和定稿 细胞工程研究涉及面广 内容和要求变化快 加之编者水平有限 书中难免会有疏漏和不妥之处 恳请广大读者批评指正 谢谢 编 者 2012 年 8 月

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3 目 录 前言 第一章 绪论 1 第一节 细胞工程的研究内容和任务 1 一 研究内容 1 二 研究任务 5 三 细胞工程相关分支学科 5 第二节 细胞工程发展历史 7 一 探索期 7 二 成熟期 8 三 迅速发展期 10 第三节 细胞工程研究热点领域 13 第四节 细胞工程学习方法 18 一 掌握细胞工程相关基本理论 18 二 掌握细胞工程相关研究方法和实验技术 18 三 掌握必要的文献信息检索途径 18 四 细胞工程应用研究进展 18 思考题 19 第二章 细胞工程实验室及实验基本操作 20 第一节 实验室及仪器设备 20 一 实验室 20 二 仪器设备 22 第二节 细胞工程基本操作 24 一 清洗 24 二 消毒灭菌 25 三 无菌操作 28 第三节 培养基及其配制 29 一 植物细胞培养基及其配制 29 二 动物细胞培养基及其配制 35 思考题 44 第三章 植物组织培养 45 第一节 外植体及其培养 45 一 外植体的选择 45 二 外植体消毒处理 46 三 外植体的接种 47 四 外植体的培养条件 47

4 iv 细胞工程 第二节 愈伤组织 49 一 愈伤组织的形成和增殖 50 二 影响愈伤组织培养的因素 52 第三节 愈伤组织的再分化与器官建成 54 一 植物细胞的全能性 54 二 细胞分化 脱分化与再分化 55 三 愈伤组织的分化与器官建成 56 第四节 植物试管苗的生根 58 一 试管内生根 59 二 试管外生根 60 第五节 植物试管苗的移栽 61 一 试管苗的驯化 61 二 试管苗的移植 62 三 影响试管苗移植成活率的因素 63 第六节 植物细胞扩大培养 63 一 悬浮培养 64 二 单细胞培养 66 第七节 植物细胞的大规模培养 67 一 概述 67 二 植物细胞规模化培养体系的建立 68 三 影响植物细胞规模化培养的因素 70 第八节 植物细胞反应器 72 一 植物细胞反应器类型及其特点 72 二 用于植物细胞培养的反应器 72 三 反应器的设计与放大 75 四 植物细胞培养动力学 79 五 植物细胞反应器控制技术 82 第九节 植物细胞培养与次生代谢产物生产 84 一 植物细胞次生代谢产物的主要类型 84 二 植物细胞次生代谢产物积累的特性 86 三 提高植物细胞次生代谢产物产量的方法 86 四 利用植物细胞大规模培养生产次生代谢产物实例 89 思考题 90 第四章 植物脱毒快速繁殖 91 第一节 植物组织脱毒 91 一 植物组织脱毒的概念与意义 91 二 植物组织脱毒方法及基本原理 92 三 植物组织脱毒基本技术规程 97 四 影响植物组织脱毒的因素 99 第二节 植物病毒检测方法 99

5 目 录 v 一 植物形态学检测法 99 二 指示植物检测法 100 三 抗血清检测法 100 四 组织细胞检测法 100 五 酶联免疫吸附测定法 100 六 直接组织斑免疫测定法 102 七 胶体金免疫层析法 102 八 以核酸为基础的检测方法 103 附 : 植物组织脱毒实例分析 105 一 马铃薯茎尖培养脱毒方法 105 二 三叶半夏脱毒组培 105 思考题 107 第五章 植物体细胞杂交 108 第一节 植物细胞原生质体制备 108 一 植物细胞原生质体分离 109 二 植物细胞原生质体纯化 112 三 植物细胞原生质体活力测定 113 四 影响植物细胞原生质体制备的因素 114 第二节 植物原生质体培养与保存 118 一 植物原生质体培养基选择 118 二 原生质体的培养方式 119 三 植物原生质体保存方法 121 四 影响植物原生质体培养的因素 122 第三节 植物体细胞杂交控制技术 123 一 植物体细胞杂交概述 123 二 植物体细胞杂交一般规程 125 三 影响植物体细胞杂交的因素 131 附 : 植物愈伤组织原生质体与体细胞杂交操作实例 132 芝麻原生质体培养 132 思考题 134 第六章 植物转基因技术 135 第一节 植物基因转化受体体系 135 一 叶盘受体体系 135 二 原生质体受体体系 136 三 悬浮细胞受体体系 136 四 愈伤组织受体体系 136 五 胚状体受体体系 137 六 活体受体体系 137 第二节 植物基因转化方法 137 一 农杆菌介导法 137

6 vi 细胞工程 二 基因枪转化法 138 三 PEG 介导法 140 四 花粉管通道法 140 五 其他转化方法 140 第三节转基因检测技术 142 一 形态特征检测 142 二 报告基因检测 143 三 分子生物学方法检测 144 第四节转基因植物的研究成果及安全性 146 一 转基因植物的研究成果 146 二 转基因植物的安全性 147 思考题 148 第七章动物细胞培养 149 第一节动物细胞体外培养 149 一 动物细胞与组织培养类型 149 二 动物细胞培养特性 150 三 动物细胞取材与分离 151 四 动物细胞同步化获得方法 154 五 动物细胞保存 156 第二节动物细胞传代培养 157 一 动物细胞悬浮培养 158 二 动物细胞贴壁培养 158 第三节动物细胞固定化培养 159 一 固定化培养材料 159 二 固定化培养条件 161 第四节动物细胞大规模培养 162 一 微载体培养 163 二 中空纤维培养 164 三 微囊化培养 166 第五节干细胞培养工程 166 一 干细胞定义 166 二 干细胞研究意义 168 三 动物干细胞工程技术 169 四 干细胞技术的应用前景和研究中存在的问题 176 第六节动物细胞反应器 179 一 动物细胞反应器基本原理 179 二 动物细胞反应器类型与特点 180 三 动物细胞反应器设计 184 四 动物细胞反应器应用前景 185 思考题 185

7 目 录 vi 第八章 动物细胞染色体工程 186 第一节 动物多倍体诱导 186 一 天然多倍体 186 二 人工诱导多倍体 186 第二节 雌雄核发育和性别控制 190 一 雌核发育 190 二 雄核发育 192 三 性别控制 192 第三节 染色体片段转移和特定位点重组技术 193 一 染色体片段转移技术 193 二 染色体特定位点重组技术 194 思考题 194 第九章 转基因动物 195 第一节 转基因动物的制备 195 一 目的基因导入 195 二 转基因胚胎培养与移植 200 三 转基因动物鉴定 200 第二节 转基因动物应用前景 200 一 转基因动物在基础生物学研究中的应用 200 二 转基因动物在医药领域的应用 201 三 转基因动物在畜牧业和渔业生产中的应用 205 第三节 转基因动物研究存在的问题 205 一 技术性问题 205 二 社会性问题 206 思考题 207 第十章 胚胎工程 208 第一节 概述 208 一 发展历史 208 二 研究意义 209 第二节 胚胎工程的技术方法 210 一 胚胎移植相关技术体系 211 二 胚胎分割技术体系 219 三 胚胎干细胞技术 224 第三节 试管动物 226 一 概述 226 二 试管婴儿 226 三 试管婴儿主要技术环节 228 四 胚胎工程技术的现状分析 229 思考题 232

8 vi 细胞工程 第十一章 微生物细胞工程原理 233 第一节 微生物细胞工程概述 233 一 微生物细胞工程定义 234 二 微生物细胞工程意义 234 三 微生物细胞工程应用 234 第二节 微生物细胞工程菌种 235 一 微生物细胞工程菌种来源 236 二 微生物细胞工程菌种分离 236 三 微生物细胞工程菌种选育 237 四 微生物细胞工程菌种保存 244 第三节 微生物细胞工程代谢调控 246 一 代谢类型 246 二 代谢调控 247 第四节 微生物细胞发酵工艺控制技术 248 一 微生物细胞发酵参数检测 248 二 微生物细胞的发酵类型 250 三 微生物发酵动力学 251 第五节 微生物细胞发酵下游加工技术 257 一 微生物细胞发酵下游加工的特点和重要性 258 二 微生物细胞发酵下游加工基本原理 259 三 微生物细胞发酵下游加工的一般程序和操作单元 259 第六节 微生物细胞工程的应用 264 一 微生物细胞工程在食品工业中的应用 264 二 微生物细胞工程在农业中的应用 264 三 微生物工程在轻工业中的应用 265 四 微生物细胞工程在化工能源产品中的应用 265 五 微生物细胞工程在环境保护中的应用 266 六 微生物细胞工程在医药卫生中的应用 266 附 : 微生物细胞工程应用实例分析 268 一 抗生素发酵生产 268 二 氨基酸发酵生产 269 思考题 271 主要参考文献 272

9 第一章 绪 论 细胞工程 是以生物的细胞 组织或器官为研究对象 运用工程学原理 通过类似于工程学的研究方法设计研究目标 按照人们的意愿在细胞器水平上改变细胞内的遗传物质 以获得新的生物物种 生物品种或特种生物细胞产品的一门综合性工程学科 细胞工程与基因工程 酶工程 发酵工程和蛋白质工程一起构成了生物学学科中新兴的生物工程研究领域 细胞工程不但丰富和拓展了生物工程研究的内容 促进了生物工程应用研究的发展 而且使传统生物学认为不可能发生的生物事件成为可能 在后基因组时代 细胞工程可以大显身手 众所周知 生物界总是亲子相像 世代相传 这是由于子代和亲代之间具有相同或相似的遗传信息 要想创造出新品种 传统方法是进行不同生物间的有性杂交 此法必须考虑不同物种间的亲缘关系 但是 由于物种间的生殖隔离 不同物种间的远缘杂交是无法实现的 例如 猪和牛 霉菌和大肠杆菌 马铃薯和番茄等 应用传统方法很难实现杂交育种 而采用细胞工程 可以使不同物种间的杂交成为可能 例如 在植物细胞工程方面 马铃薯和番茄细胞融合培育出了马铃薯番茄 植株 在动物细胞工程方面 通过人和小鼠细胞杂交实验搞清了人的许多基因在染色体上的位置 人的某些基因在猪的胚胎发育中得到表达 为胚胎工程提供了广阔的前景 另外 利用细胞工程技术进行胚胎干细胞的研究 使基因治疗 细胞治疗和器官移植成为可能 试管动物和胚胎移植的研究 使优良畜种快繁和品种改良得以迅速发展 第一节 细胞工程的研究内容和任务 一 研究内容 一 按照细胞工程研究种类 细胞工程可以分为三类 植物细胞工程以植物细胞为实验材料 进行实验目标设计和操作 创造新的植物品种或者培育新的植物性状的工程创造技术 动物细胞工程以动物细胞为实验材料 进行实验目标设计和操作 创造新的动物品种或者培育新的动物性状的工程创造技术 微生物细胞工程以微生物细胞为实验材料 进行实验目标设计和操作 创造新的微生物品种或者培育新的微生物性状的工程创造技术 二 按照细胞工程操作对象 细胞工程可以分为四类 细胞培养工程组织 器官或细胞培养 指利用生物体各部分组织 器官或细

10 1 细胞工程 胞进行离体培养 或者扩大培养使之形成愈伤组织 -或细胞群体的技 术和方法从而创造新的物种获得扩大细胞或者获得新的性状图/ 0/ 图/ 0/胡萝卜单细胞发育成植株王蒂1223 细胞染色体工程 染色体工程 4 指借助于物理化学等方法对染色体进行操作 使生物染色体数目结构和功能发生改变从而创造新的物种和获得新的性状的技术方法与手 段图/ 01 图/ 01冬小麦染色体工程育种技术路线图李森等1225 细胞原生质体培养工程 原生质体培养 指将微生物细胞或植物细胞破壁后形成原生质体对 原生质体进行生物与化学技术操作改变原生质体的遗传性状然后在适宜的培养条件下依

11 第一章绪论 8 据细胞全能性使其再生细胞壁并进行细胞分裂与分化形成完整个体从而创造新的物种和 获得新的性状原生质体培养主要技术控制过程为 植物细胞微生物细胞原生质体制备原生质体再生植株微生物细胞 胚胎培养工程 动物或植物胚胎培养 6 指使胚或具胚器官的生物体细胞在离体无菌条件 7 下发育成正常生物体的技术方法从而实现快速繁殖与复壮细胞或胚胎细胞恢复等 三按照细胞工程研究目的细胞工程可以分为六类 细胞转基因 指用细胞工程结合基因工程的方法将人们需要的目的基因导入受体基因组中使外源基 因与其基因整合在一起随细胞分裂而增殖并稳定地遗传给后代创造基因工程细胞实现创 造新物种的工程技术方法和手段图/ 08 图/ 08基因工程流程图张惠展1229

12 细胞工程? 胚胎移植 动物胚胎移植 6 : 指将动物体内发育的早期胚胎分离出来将其移植到同 7 期发情的其他未受孕母体生殖道内代孕产生个体的技术 试管动物 6 指利用精 子和卵子的体外受精 : ; <=>显微受精 : ; 胚胎体外培养 和移植技术所获得的各种动物图/ 0? 图/ 0?胚胎移植李青旺1229 细胞克隆 是细胞的无性繁殖指不经两性细胞的结合个体不断增殖复制出 性状特征和基因型相一致的个体 细胞产物改性 通过生物或者化学的方法将生产代谢产物活性低的细胞转化为活性高的细胞从而实现 细胞改性达到产生高活性的次生代谢产物细胞的方法与技术 细胞发酵培养 利用液体发酵或者固体发酵培养的方法实现功能细胞量的积累达到生物工程获得高产 生物高产制品或高含量生物细胞次生代谢产物的方法与技术 细胞融合与细胞杂交 利用不同细胞优良性状的互补特性开展细胞之间的融合技术与杂交实验是提供新的生 物性状或获得新的生物制品的一种重要的方法与技术图/ 09 随着研究工作的不断深入和生命科学的持续发展新的研究内容研究技术研究手段层 出不穷例如植物组织脱毒培养技术人工种子制造技术性别鉴定与控制技术动植物种质 资源离体保存技术等

13 第一章绪论 9 图/ 09植物细胞融合过程吴殿星122? 二研究任务 当前生命科学发展十分迅速研究领域前沿热点不断更新生命医学人口环境资源 和农业等领域面临许多需要依靠细胞工程才能解决的问题 细胞工程学的研究任务十分艰 巨承担着研究解决生命科学关键问题的重要任务这些研究任务包括基础研究和应用研究 既涉及基本理论和方法技术如细胞全能性的分子机制细胞信号传导控制等又涉及技术应 用与技术开发如细胞快速繁殖脱毒技术细胞生产单克隆抗体技术等细胞工程研究任务主 要表现在以下几个方面 /离体培养条件下细胞组织或器官所需营养条件 1离体培养条件下细胞组织或器官所需环境条件 8细胞组织或器官的形态发生规律?细胞的快速脱毒及大量繁殖方法与技术 9亲缘关系不同的细胞融合方法和细胞杂交机制 A细胞原生质体形成再生和原生质体诱变新物种的机制与应用规律 3细胞的遗传和变异规律新物种的生产与应用研究 5细胞种质资源的离体保存机制和方法 B胚胎移植胚胎体外生产及细胞克隆技术等 /2改良生物细胞品种创造新的生物种类的方法与技术 三细胞工程相关分支学科 细胞工程研究内容十分丰富涉及许多其他相关学科的理论和基本知识细胞工程研究对

14 细胞工程 象就是细胞 凡是与细胞有关的研究内容和技术方法手段 都是细胞工程的研究需要和必备技术 当前生命科学研究范围很广 研究领域很多 特别是一些交叉学科 为细胞工程研究提供了新的方法和技术手段 细胞工程学在与各相关学科的相互依赖 相互促进 相互渗透中发展和壮大 是一门综合了多学科知识发展起来的理论应用性学科 细胞工程相关分支学科如下 细胞生物学以细胞为研究内容 从细胞的整体水平 亚显微水平 分子水平等层次对细胞形态 生长发育以动态的观点进行研究 是研究细胞和细胞器的结构和功能 细胞的生活史和各种生命活动规律的学科 为细胞工程学的基础学科之一 植物细胞学植物细胞学是研究植物和植物体的细胞结构和生长规律的学科 研究目的在于了解和掌握植物细胞的生长和发育规律 从而更好地控制 利用和改造植物细胞 为人类服务 植物细胞学的研究内容主要包括植物细胞的形态构造 生理机能 生长发育规律等 动物细胞学动物细胞学是研究动物和动物细胞的结构和生长规律的学科 研究目的在于了解和掌握动物细胞的生长和发育规律 从而更好地控制 利用和改造动物细胞 为人类服务 动物细胞学的研究内容主要包括动物细胞的形态构造 生理机能 生长发育规律等 细胞生理学细胞生理学研究内容主要包括细胞从周围环境中摄取营养的能力 代谢功能 能量的获取 生长 发育与繁殖机制 以及细胞受环境的影响而产生适应性和运动性的活动 细胞的离体培养技术对细胞生理学的研究有巨大贡献 微生物学微生物学 是研究微生物细胞及其生命活动规律的学科 主要研究微生物细胞在一定条件下的形态结构 生理生化 遗传变异 以及微生物细胞的进化 分类 生态等生命活动规律及其与其他微生物细胞 动植物细胞 外界环境理化因素之间的相互关系 同时也研究微生物细胞在自然界各种元素的生物地球化学循环中的作用 微生物细胞在工业 农业 医疗卫生 环境保护 食品生产等各个领域中的应用等 细胞生物化学细胞生物化学的研究内容十分广泛 主要包括细胞生物大分子 蛋白质 糖类 脂类 核酸 的结构与功能 细胞物质代谢及其调节 糖类 脂类 氨基酸 核苷酸代谢 物质代谢的联系与调节 细胞基因信息的传递及表达 - 复制 - 转录 蛋白质生物合成 基因表达调控 重组 - 与基因工程 等内容 细胞分子生物学细胞分子生物学属于生命科学领域内的重要学科 主要研究细胞的遗传信息和基因表达 包括细胞核酸 蛋白质的组成及结构 基因的转录翻译和蛋白质的修饰加工 基因表达调控及基因工程的相关知识 重点研究细胞生物膜 细胞信号转导 细胞增殖调控 细胞分化 衰老与凋亡 肿瘤生物学等热点问题 胚胎细胞学胚胎细胞学是研究动植物个体发生过程及其机制的重要学科 主要包括动植物生殖细胞的发生和受精 胚胎的发生和早期发育 动植物器官发生及其所受环境影响等 随着学科的发展和技术的进步 与细胞工程相关的学科越来越多 领域越来越广 交叉学

15 第一章 绪 论 科研究的成果进一步丰富了细胞工程研究内容和技术手段 如基因工程 酶工程 蛋白质工程和发酵工程等生物工程相关研究领域的最新进展 为细胞工程研究提供了直接的实验条件和技术支持 细胞工程学科的发展 也为其他相关学科的进步提供了一定的技术保障 第二节 细胞工程发展历史 细胞 是英国科学家 /0 于 年发现的 他当时见到的仅仅是植物细胞壁 同时期 荷兰科学家 1 0 于 年观察了人和哺乳动物的精子 细胞 以及纤毛虫等 世纪中叶 德国科学家 与 两人共同提出 一切植物 动物都是由细胞组成的 这就是著名的细胞学说 这个学说的建立对现代生物学的发展具有重要意义 恩格斯把细胞学说 能量守恒定律与达尔文的进化论并称为 世纪自然科学的 三大发现 由于一切生物 除病毒外 都由细胞所组成 人们从无限多样的生物世界中看到了它的统一性 细胞工程学是一门历史较为悠久 发展比较迅速的新兴学科 发展源头可以追溯到 世纪末和 世纪初 该学科的兴起和发展的理论基础是生物细胞的全能性 即个体或组织 器官已经分化的细胞在适宜的培养条件下具有再生成完整个体的遗传潜能 的特性 细胞工程学的发展历史 总体可分为探索期 成熟期 和迅速发展期 至今 一 探索期 年 和 提出细胞学说时指出 假如具有的条件正如它存在于有机体内一样 每一个细胞应该可以独立成活和发展 年 法国解剖学家 最早尝试将蛙胚尾部组织切下 放到普通水中 培养 结果观察到了组织的生长和分化现象 年 德国学者 - 首次发现白细胞在淋巴液和血清中能够分裂 年 发现鸡 神经板细胞在生理盐水中培养能存活数月 并创造了 外植体培养 和 组织培养 两个词 年 1 将人 的皮肤保存在腹水中几天至几周后再做移植手术获得成功 年 最早用实验方法获得了克隆动物 他把海胆 细胞期胚胎通过剧烈振荡分离成 个细胞 或叫分裂球 进行单独培养 年 德国植物生理学家 / 根据细胞理论提出 高等植物的体细胞可以不断分割 直至单个细胞 年 用盖片悬滴法将蝾螈 白细胞培养了将近一个月 年 和 2 用动物血清做培养基 将狗 淋巴肉瘤细胞培养 并观察到细胞生长现象 年 / 在无菌条件下采用盖玻片覆盖凹玻片悬滴法 利用淋巴液培养蛙胚髓管部的小片组织 将其在淋巴液中培养了数周之后 观察到有神经细胞凸起并从种植的神经组织块长出 / 建立了动物细胞培养的基本模式系统 并逐渐发展成今天的动物细胞培

16 5 细胞工程 养系统 /B11年 Q 和 F66 -进行的根尖和茎尖培养同时获得成功他们在含有无机盐葡 萄糖或果糖各种氨基酸琼脂的培养基上使 / 0? 的豌豆 : - - 玉米 ; -4 棉花 -< - 的茎尖根尖离体培养结果形成了一些缺绿的叶和 41 根并发现培养中的分生组织 只能进行有限的生长 /B18年 R 设计了卡氏培养瓶使人们有可能进一步研究细胞的营养问题 /B19年 SL J 将 G 的悬滴培养法改良为双盖片法 /B1A年 K J J 4-4@为研究动物器 7设计了表玻璃培养法 官在体外的发育与功能做出了贡献 /B19年和/B1B年 I 6 4将亚麻 = - -- 种间杂交形成的不能成活的种 子中的胚解剖出来在人工培养基上培养至成熟证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可 能性 二成熟期 组织或细胞所需营养十分复杂既有无机成分和有机成分又有各种生长调节物质而离 体培养组织或细胞所需的营养只能从培养液中获取 这一时期离体培养研究的进展与适宜 生长发育培养基的建立密切相关 一植物培养技术 植物培养技术的快速发展主要是因为美国植物生理学家 T4 和法国学者 U 4 在 实验中发现了植物组织培养领域里的两类重要物质一类是 O 族维生素对植物生长有重要 意义另一类是生长激素 J 44 UG一种天然的生长调节剂 J 4 /B8?年T4 用番茄 =4/ 1 / / - 根建立了第一个活跃生长的无性繁殖 系也称克隆 并能不断地进行继代增殖这标志着离体条件下组织培养真正获得了成 功同年 L U 4 在 Q溶液葡萄糖酵母提取液 VP和水解酪蛋白 W 7 上使黑杨 :1 形成层 W 组织培养物连续增殖了几个月 /B83年T4 发现了 O W 8 <EE对植物 根离体生长的促进作用并用三种 O 族维生素即吡哆醇 =OA硫胺素 =O/及烟酸 =O9取 代 VP 获得成功建立了第一个由已知化合物组成的综合培养基 /B83年和/B85年 U 4 在山毛柳 2 >1 - 形成层的培养中发现虽然在 含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的 Q溶液中这些组织可以不断增殖几个月但只有在培养基 中加入 O 族维生素和<EE 后形成层组织的生长才能显著增加 /B83年和/B85年 D6 利用类似的方法培养了胡萝卜? / / 根和马铃薯 块茎的薄壁组织建立了类似的连续生长培养物 /B8B年T4 和 U 4 / 7 / - 种间杂种和胡萝卜形成层 组织建立了连续生长的培养物 因此T4 U 4 和 D6 一起被誉为植物组织 培养的奠基人现在所用的培养方法和培养基配方都是这三位学者之前所创立方法和技术的 演变但这三位学者所用的组织都包含着分生细胞而诱导成熟和已高度分化细胞发生分裂

17 第一章绪论 B 的研究直到后来发现了细胞分裂素 H 后才成为可能 7 /B?/年XY 6 H 等 将 椰 乳 H RS加 入 到 培 养 基 中使 曼 陀 罗? 的心形期胚离体培养成熟 - /B?A年罗士伟将菟丝子 8 / >茎尖培养成功并使其在试管内开花给人们 9 以离体培养技术可以控制花芽形成的启迪 /B?5年 KH和崔蟩在烟草茎切段和髓培养及器官发生 -的研究中发现 腺嘌呤可以解除培养基中<EE 对芽形成的抑制作用而诱导芽形成认为腺嘌呤和生长素的比 例是控制芽形成的重要因素 /B9/年 D 4将果实子房未受精胚珠以及花器官的各个部分培养成功 /B98年 S 将万寿菊 A3 / 和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中在往复 式摇床上振荡获得单细胞或密集细胞的体细胞悬浮液并且可以继代增殖这一研究成果既 带来了培养方法的突破也使 培养单细胞这一设想成为可能 /B9A年 S 首次由鱼精子中分离出细胞分裂素类的激动素 H QZ其活性比 腺嘌呤高8万倍 4 控制器官形成的概念指出通 /B93年 KH和 S 提出了植物激素 47 过改变培养基中生长素 L 和细胞分裂素的比例可以控制器官的分化生长素和细胞分 裂素比例高时促进根的分化低时促进茎和芽的分化相等时倾向于无结构方式生长 但是 不同组织中激素的内生水平不同某一种组织或细胞形态发生 -所要求的外源 4 激素的水平也不会相同 /B95年T H 和 Z4 W 解除侧芽的休眠状态后来 S 4 发展了这一方法制订了一系列标准程序广 植物到花卉和果树的快速繁殖上 /B95年 K F 几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养 ; 6 中发现体细胞在形态上可转变为与合子胚 7 7相似的结 构其发育过程也与合子胚类似 由于它是从体细胞分化而来因而称为体细胞胚 6 7或胚状体 7 次人工体细胞胚培养得以实现是植物组织培养的重大突破对植物组织和细胞培养产生了深 远的影响为细胞离体培养中研究其形态发生机制开拓了新的领域 二动物培养技术 /B18年 R 设计的卡氏瓶培养方法是后来使用培养瓶进行体外培养的技术基础12 世纪?2年代前后大多数的体外培养工作都过渡到用培养瓶进行培养这种方法使培养对象 处于一种与菌隔离的环境扩大了培养细胞的生存空间增加了体外培养的细胞数量早期 的培养瓶主要是玻璃培养瓶现在主要是一次性使用的塑料培养瓶 /B88年 U 7创立了旋转管培养法 /B88年 RH 以振荡方法研究 细胞期和 细胞期文昌鱼胚胎分裂球的发育能力 他发现沿第一次分裂面分开的左右两部分能形成1个完整幼虫 /B8?年 IJ -改良了旋转管培养法避免了传统静置培养 导致的培养细 胞周围物质环境不均匀现象 /B85年 K 率先进行脊椎动物胚胎克隆的实验 他用发丝结扎蝾螈 细胞期胚

18 /2 细胞工程 胎把它分成相连的两部分结果得到发育正常的孪生幼体 12世纪四五十年代童第周等在鱼类上进行了相似研究也获得了孪生小鱼 /B85年 K提出核移植方法生产克隆动物这一设想他认为通过核移植可以验证 不同发育阶段和不同分化程度的细胞核是否具有全能性限于当时的实验条件未能对其设想 进行实验验证 >6 通过核移植方法获得了核质杂交变形虫 该变形虫可以分裂产生子代 /B8B年 >H4 和 U : : 4-在两栖类上进行最早的动物多倍体诱导研究他们成功 地诱导出三倍体 /B?9年 采用低温处理白鲑 8 3 受精卵获得三倍体囊胚 /B?5年 K 使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能 /B91年 Q 和 O -将核移植技术应用于两栖类成功地把豹蛙 B1 的囊 1 胚细胞核移入同种蛙的成熟去核卵子中获得了正常发育的胚胎 /B98年 U 7等在以人的肿瘤组织为材料的基础上成功地建立了 GI细胞系 /B9?年 P@ -和 [ 6 -研究了细胞培养中麻疹病毒 -Y -的效应发现麻疹 7 7 /B9?年 G -Y -诱导离体培养的宿主细 胞产生多核合胞体 /B95年XH@ Y -可引起艾氏腹水 瘤 细 胞 融合 /B95年 Z改进了分离分裂球的方法用玻璃针把细胞期和 细胞期文昌鱼胚胎分 别沿第一次和第二次分裂面分开证明了沿第一次分裂面分开的两部分能发育为正常幼虫 /B95/B9B年 C 在不同种变形虫之间进行核移植证明细胞核和细胞质对遗传起 着同等重要的作用 /B9A/B9B年 KJ 用低温处理三棘刺鱼 / 获得了三倍体并 饲养至性成熟 /B31年 济水生动物育种的主要技术之一并在实践中取得了显著效益 三迅速发展期 12世纪A2年代以后随着离体培养技术的建立和培养基的完善生物离体培养技术与生 命科学的其他技术相互渗透相互结合而得到了迅速的发展不同生物的研究成果层出不穷 并广泛地应用于生物学和农业科学在生产中发挥了巨大的作用 一植物培养技术的迅速发展 /BA2年英国学者 R H 用真菌 : 纤维素酶 酶解分离番茄根和烟草叶 片原生质体获得成功开创了植物原生质体培养和体细胞杂交工作这是植物组织培养的重大 突破

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