烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生

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1 烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生 21 级生物科学 1 班 黄麟飞 摘要 : 在 MS 培养基上, 接种烟草无菌苗的叶片, 分别放在光照和黑暗条件下诱导愈伤组织, 接种于 MS 分化培养基上, 在光照下分化再生植株 结果表明 : 光照和植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再生产生影响 关键词 : 烟草愈伤组织植株再生 Callus Inducement and Plant Regegeration Of Tobacco Huang Linfei Abstract: culture the leaves of tobacco into MS inducing medium separately under light and darkness. Then culture the induced callus into MSregeneration medium under under light. The result sayed that callus inducement and plant regeneration of tobacco was effected by light and plant grow regulators. Key Word: tobacco callus plant regeneration 二十一世纪是生命科学的时代, 这一上世纪末科学家的语预言现在已经真切地在众多 科技领域强大背景下款款而来了 1998 年 8 月 12 日美国总统克林顿发表了美国生物物质研 究战略, 决定 2 年拨款 2.1 亿美元作为研究经费 日本于 2 年制定了 21 世纪生物技 术发展规划, 并提出了 生物产业利国 的口号 [1] 生物技术在医疗 保健 农业 环保 轻 化工 食品等重要领域对改善人类健康与生存环境, 提高农牧业与工业产量与质量都开始 发挥越来越重要的作用 生物技术涵盖的技术领域范围很广, 包括遗传工程 细胞融合 细胞组织培养 胚胎及细 胞核移植等技术 其中细胞组织培养是诸多技术的基础 它又分为植物和动物的细胞组织培 养 所谓植物细胞组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物细胞组织进行的培养 [2] 它在作物育种 花果蔬菜及中草药的脱毒和快繁方面具有其他技术手段都无可比拟的优势 目前已经广泛应用于工农业生产 濒危植物的营救以及种质资源的保存 低等植物的生态研 究等方面, 为保护生态提供了理论依据 [3] 早在 192 年, 德国科学家哈伯兰特就预言植物细胞具有全能性, 经过几十年的不断探 索, 美国人斯图尔德在 2 世纪 年代初, 用胡萝卜体细胞经胚状体途径培养成完整植株, 首次证明了植物细胞全能性 此后, 植物细胞和组织培养发展迅速, 目前大约有 1 种植 物能进行组织培养, 其中包括烟草, 早期的许多科学家就是把它作为研究对象 烟草 (tobacco), 茄科烟草属 (Nico tianal L.) 含有尼古丁的叶用一年生作物, 是烟草加工业的重要原料, 同时也是医药 食品和饲料工业的原料之一 人类使用烟草大约有 1 年的历史 印地安人于 119 年开始在墨西哥栽培烟草 现在烟草的栽培种植已遍布世界, 成为一种重要的经济作物 [4][] 在本实验中, 通过对烟草叶片愈伤组织诱导及植株再生, 学习植物细胞组织培养责这 一技术以及观察分析外界条件对外植体生长发育的影响 1 材料与方法 1. 1 材料 将烟草种子用消毒液 84# 消毒后, 无菌水反复洗 3 次, 无菌吸水纸吸干水分, 接种在 1

2 MS 培养基上, 获得的无菌苗作为愈伤组织诱导的材料 1. 2 方法 培养基的配制 本实验中获得无菌苗 愈伤组织的诱导和植株再生等各步骤均要使用 MS 培养基 [6] ; 而后二者还应在 MS 培养基的基础上添加一定种类和浓度的植物生长调节剂 ( 各类培养 基的配方见表 1~3) 表 1 MS 培养基母液配制 成分 1L 母液用量 (mg/l) 每升培养基取用量 (ml) 大量元素 (2 ) NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2 2H 2 O MgSO 47H 2O KH 2 PO 铁盐 *(2 ) FeSO 4 7H 2 O Na 2 EDTA7H 2 O 微量元素 (2 ) KI H 3 BO 3 MnSO 4 4H 2 O ZnSO 4 7H 2 O Na 2 MoO 4 2H 2 O CuSO 4 H 2 O CoCl 2 6H 2 O 维生素 (2 ) 烟酸 VB 1 VB 肌醇 (2 ) 肌醇 2 甘氨酸 (2 ) 甘氨酸 4 2

3 表 2 愈伤组织诱导培养基 成分 每升培养基用量 MS 培养基 BA 2mg NAA 2mg 蔗糖 2g 琼脂 7g 表 3 分化培养基 成分 每升培养基用量 MS 培养基 BA 2mg NAA.mg 蔗糖 2g 琼脂 7g 按照培养基的配方和实验中所要用到培养基的量计算各种药品的用量, 并向烧杯中顺 序加入培养基母液, 加入实际用量体积约 2/3~3/4 的蒸馏水, 按 2g/ L 加入蔗糖调节渗透 压, 用.N 的 NaOH 和.N HCl 调整 PH 至.8~6. 按 7g/L 假加入琼脂, 加热, 搅拌 待 琼脂完全熔化后定容至 ml, 继续加热几分钟后均匀分装入三角瓶中 ( 按每瓶 3mL) 作上记号 分装好后放置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌 2min 左右, 温度 121 C, 压力 1.1Kg/cm 灭菌后 的培养基放置于无菌室保存备用 愈伤组织的诱导 进入超净工作台前, 对接种室用紫外灯灭菌 1~2 小时 进入超净工作台时, 用 7% 的 酒精对设备 工具 三角瓶及手消毒 点燃酒精灯, 将镊子 解剖刀在酒精灯上烘烤干 取一 3

4 个无菌培养皿, 加入几滴无菌水, 然后用解剖刀切 1~2 片无菌叶片成 2mm 2 左右的小片, 并迅速夹取小叶片接种于培养基上, 一般每瓶接种 片 迅速封好瓶口, 作上记号 3 瓶放 置于光下培养,3 瓶放置于黑暗中培养 接种后的三角瓶放在 24 C 下黑暗中先培养 7 天, 然后在同样温度下有光和黑暗下培养 至愈伤组织形成 全部过程持续 28 天 器官分化及植株再生 将诱导好的愈伤组织分别转入分化培养基上, 每瓶放五块愈伤组织, 并作上标记, 放 在连续光照或 16h/d 光照, 温度 2~22 C 培养 21 天 若没有芽形成, 或愈伤组织状态没有 明显变化, 应及时调整培养基的激素浓度, 更换新鲜培养基 2. 结果与分析 2.1 愈伤组织诱导的结果与分析 实验结果表明,MS 诱导培养基对烟草无菌苗叶片有很高的诱导率, 二者均为 1% 说明较高浓度的生长素和细胞分裂素能很好地诱导愈伤组织 [7] 诱导率的高低与光照无关, 但是光照对愈伤组织的状态有明显的影响 这首先表现在光照条件下诱导出的愈伤组织呈 现绿色, 愈伤组织细胞在光下形成叶绿体 ; 而黑暗条件下诱导出的愈伤组织呈现乳白色或 淡黄色, 愈伤组织的细胞不形成叶绿体 其次, 黑暗下诱导的愈伤组织相对光照下诱导的 愈伤组织生长的更大, 结构更疏松, 生长更良好 说明暗培养比光培养更有利于愈伤组织 的诱导 表 4 烟草叶片愈伤组织引诱情况统计表 编号 每瓶 接种数 培养条件愈伤组织污染率 ( 光 暗 ) 诱导率 (%) (%) 愈伤组织状态 大中小疏松致密 1 光 1 3/ 2/ 1/ 4/ 2 光 1 1/ 3/ 1/ 2/ 3/ 3 光 1 2/ 2/ 1/ 2/ 3/ 合计 1 光 1 3/1 8/1 4/1 /1 1/1 4 暗 1 2/ 2/ 1/ 4/ 1/ 暗 1 4/ 1/ 2/ 3/ 4

5 6 暗 1 4/ 1/ 3/ 2/ 合计 1 暗 1 1/1 4/1 1/1 9/1 6/1 注释 :1. 直径 1cm, 大 ; 直径.~1cm, 中 ; 直径.cm, 小 2. 愈伤组织诱导率 (%)= 实际形成愈伤组织数 / 接种外植体数 *1 2.2 器官分化及植株再生的结果与分析实验结果表明, 光照下或黑暗中诱导的愈伤组织都有较高的分化率, 但是光照比黑暗下诱导的愈伤组织分化的芽个数多, 生长得更好, 说明光照有利于愈伤组织分化 同时, 较低的生长素 / 细胞分裂素有利于芽的分化, 而较高的生长素 / 细胞分裂素有利于根的分化 [7] 表 烟草叶片愈伤组织再生植株引诱情况统计表 编号 愈伤组织来源 ( 光 暗 ) 分化率 % 平均每个愈伤 组织分化芽数 分化芽状态污染率 % 1 光 1 芽较大, 绿 色 2 光 光 4 暗 8 芽较小, 黄 绿色 暗 暗 8 注释 : 分化率 %= 能够分化芽的愈伤组织 / 接种愈伤组织数 *1 2.3 褐变在实验中发现, 一些外植体接种后发生了褐边 研究人员认为, 轻者会使培养基变成棕褐色, 重者则根芽分化受阻, 导致材料死亡 这一现象在许多木本植物组织及起花药组织培养中尤为常见, 已成为组织培养中的一大障碍 [8] 一般认为, 褐变与组织中的多酚氧化酶有关 植物细胞中含有酚类物质, 也存在多酚氧化酶 在细胞未受到伤害时, 他们两者在细胞是分隔开的, 当植物组织被切割时候, 切口处细胞受到破坏,, 相接触, 发生反应, 最终形成深色物质 这些物质逐渐扩散到培养基中 抑制哦其他酶的活性, 并对外植体产生毒害 [9] 外植体材料的基因型不同, 褐变程度也不同 褐变较少的外植体愈伤组织分化容易 同时, 材料本身的生理状态不同, 接种后褐变程度也不同 可能的原因是不同生理状态的材料多酚氧化酶与酶类物质的含量及活性不同 一般, 分生组织作为外植体后形成的酶类物质

6 少, 褐变程度轻 [1] 此外, 培养基的成分也对褐变有影响 在培养基中加适量的活性炭, 吸附有毒物质, 会有效缓解褐变 [8] 总之, 在进行植物组织培养时, 应该根据培养的目的, 合理选择外植体的种类 生长部位及给予最佳的外部条件, 这样才能达到实验的预期目的 参考文献 [1] 王友同 吴文俊 吴梧桐 世界生物技术产业与生物经济 药物生物技术,23,1 (4):199~28 [2] 陈健妙 我国植物组织培养的现状与前景 海南大学学报自然科学版,22,2(4): 332~33 [3] 何池全, 赵魁义, 余国营 湿地克隆植物的繁殖对策与生态适应性 生态学杂志,1999, 18(6):38~46 [4] 中国植物志, 第六十七卷底一分册 科学出版社 ( 北京 ),1978 年版,12 [] 中国农业百科全书, 农作物卷 ( 下 ) 农业出版社 ( 北京 ),1991 年版,667 [6]Murashige T and Shoog F.A Revised media for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.physiol plant,1962,1:473~479 [7] 王小箐 李玲 植物生长调节剂在植物组织培养中的应用 化学工业出版社,22 年版, 4~48 [8] 鲁旭东 植物组织培养中和褐变的发生与防治 农业与技术,1999,19(4):9 [9] 乔旭光, 夏向东, 张步东, 等 牛蒡多酚氧化酶酶学性质的研究 山东农业大学学报, 1997,28(3):327~33 [1] 陈正华 木本植物组织培养及其应用 高等教育出版社,1986 年版,46~466 * 论文层次清楚, 对结果的分析较好, 但前言部分不够紧凑 6

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