230 激光生物学报第 19 卷中药材, 别名 : 首乌, 红内消 ( 贵州 ), 铁秤砣 ( 湖南陕西 ), 母猪头 ( 甘肃 ) 何首乌喜温暖湿润环境, 耐寒, 能在田间越冬 ; 对土壤要求不严, 一般土壤都能生长, 但以肥沃土壤生长良好, 田间内涝积水, 易引起何首乌块根及根系腐烂何首乌

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阴钊奚
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1 第 19 卷第 2 期 2010 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.19No.2 Apr.2010 doi: /j.isn 何首乌体细胞胚的诱导及植株再生研究马庆 1, 李耀亭 2, 郑蕾 2, 胡绍德 1 1, 程备久 (1. 安徽农业大学生命科学学院, 安徽合肥 ; (2. 植物细胞工程安徽省工程技术研究中心, 安徽六安 ) 摘要 : 以何首乌茎尖茎段为外植体, 经体细胞胚发生途径, 进行胚性愈伤组织诱导体细胞胚的诱导植株再生的研究, 并采用临时压片法对体细胞胚的发育过程进行观察结果表明愈伤组织诱导最适培养基为 MS+ 6 BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L, 体细胞胚诱导最适培养基为 MS+6 BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L 将产生的体细胞胚首先接种于 MS 基本培养基使其充分发育后转入 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中诱导出芽, 出芽率高于直接采用 MS+6 BA2.0mg/L 培养基诱导体细胞胚的发育过程是首先在愈伤组织表面形成许多瘤状突起即胚性细胞团, 胚性细胞团继续发育成球形胚盾形胚, 球形胚盾形胚成熟后发育成植株关键词 : 何首乌 ; 胚性愈伤组织 ; 体细胞胚中图分类号 :Q942 文献标识码 :A 文章编号 : (2010) SomaticEmbryogenesisandPlantletRegenerationin Polygonum multiflorum Thunb MAQing 1,LIYao ting 2,ZHENGLei 2,HUShao de 1,CEHNGBei jiu 1 (1.SchoolofLifeScience,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,Anhui,China; 2.AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofPlantCel,Luan237012,Anhui,China) Abstract:TakingthesliceofFleeceflowerrootasexplants,theregeneratedwayofplantwasselectedforthestudyof somaticembryogensis.ms+6 BA2.0mg/L+NAA0.5mg/Lwasthebestculturemediumforcalusinduction.MS+ 6 BA1.0mg/L+NAA0.2mg/Lwasthebestculturemediumforsomaticembryoinduction.Afterthattherewerethree stepstocompletetheculture.first,theregeneratedsomaticembryowereculturedinthemsmediumtogrowforenough time.second,thegrowthfulsomaticembryowasculturedinthems+6 BA2.0mg/Ltoinducebuds.Third,theregen eratedplantswereobtainedinthemsmedium.theappearanceandgrowthofsomaticembryowereobservedthrough parafinslicesandpresslices.histologicalobservationsshowedthatparenchymacelsfirstexperienceddediferentiation andfolowedwithcalus forming,ensuedwithembryogeniccelmaseswhicharelikeatubercularstructure.andthese embryogeniccelmasesexperiencedglobular,scutelatestagesanddevelopedintowholeplantlets. Keywords:PolygonummultiflorumThunb;embryogeniccalus;somaticembryo 何首乌 (Polygonum multiflorum Thunb.) 为蓼科多年生缠绕草质藤本植物, 其块根及藤均为名贵的收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家重大转基因专项 (2008ZX ); 安徽省教育厅项目 (KJ2008B062) 作者简介 : 马庆 (1977 ), 男, 博士, 讲师研究方向 : 细胞工程与分子育种 ( 电话 ) 通讯作者 :( 电话 ) ;( 电子邮箱 )cbj1959@126.com

2 230 激光生物学报第 19 卷中药材, 别名 : 首乌, 红内消 ( 贵州 ), 铁秤砣 ( 湖南陕西 ), 母猪头 ( 甘肃 ) 何首乌喜温暖湿润环境, 耐寒, 能在田间越冬 ; 对土壤要求不严, 一般土壤都能生长, 但以肥沃土壤生长良好, 田间内涝积水, 易引起何首乌块根及根系腐烂何首乌在全国广泛分布, 南起于广东广西云南贵州四川陕西甘肃湖南湖北浙江福建台湾江苏江西安徽, 北至 : 山东河南河北主产于广西 ( 南丹靖西 ) 广东 ( 德庆 ) 贵州 ( 铜仁黔南黔西南 ) 四川 ( 乐山宜宾 ) 湖北 ( 建始恩施 ) 江苏 ( 南京江宁江浦 ) 河南 ( 嵩县 ); 日本俄罗斯也有本省主产于萧县滁州合肥金寨芜湖贵池青阳黄山休宁等地, 常生长在山坡石缝林下和灌木丛中 [1] 何首乌药用量及出口需求量日趋增大, 市场价格逐渐上涨, 发展何首乌中药材具有较好的市场前景但何首乌常规繁殖系数低, 用种量大, 难以满足规模化生产对种源的要求, 而且长年以块根繁殖使病毒在植物体内代代相传, 致使品种退化表现为产量下降质量变差, 从而直接影响了相关经济效益目前国内关于何首乌组织培养的报道较多, 因为组织培养可在快繁的基础上进行更新复壮而且是培育何首乌新品种的有利手段, 研究报导多数是以茎尖茎段尖为外植体, 建立直接分化或愈伤组织器官发生途径的再生体系, 而经体细胞胚途径再生的研究国内尚无报道 [2 7] 1 材料与方法 1.1 材料和基本培养基何首乌 (Polygonum multiflorum Thunb) 材料由淮南隗店生态农业协会提供, 取何首乌带侧芽茎段为外植体基本培养基为 MS 固体培养基, 添加 30g/L 蔗糖,5g/L 琼脂粉,pH 外植体的灭菌和胚性愈伤组织诱导取何首乌带侧芽茎段, 用洗衣粉溶液浸泡并用柔软毛刷轻轻涮洗表面约 5min, 然后用自来水冲洗干净, 再在超净工作台内进行无菌操作, 用 0.1% 氯化汞浸泡 8min, 无菌水冲洗 5 次, 最后将其切成 0.5cm 长的茎段, 分别接种在含不同激素处理浓度的 MS 培养基上, 愈伤组织诱导培养基共四种, 其配方分别为 MS+6 BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/l;ms+6 BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L;MS+6 BA2.0mg/L+ IAA0.5mg/L;MS+6 BA2.0mg/L +IAA1.0mg/L 每处理接种 30 块外植体, 接种后 28 暗培养 [8],30d 后统计胚性性愈伤组织诱导率 1.3 体细胞胚的诱导与植株再生选择生长较好质地疏松灰白色的胚性愈伤组织切成 0.5cm 的方块, 接种在含不同激素浓度的体细胞胚诱导培养基中, 培养基配方共 6 种, 分别为 MS+6 BA1+2,4 D0.2;MS+6 BA1+NAA0.2; MS+6 BA1+IAA0.2;MS+6 BA2+2,4 D0.2;MS +6 BA2+NAA0.2;MS+6 BA2+IAA0.2 每处理接种 30 块胚性愈伤组织, 统计不同处理组合下体细胞胚的诱导率并采用临时压片法对体细胞胚的发育过程进行观察记录将诱导出的体细胞胚经 MS 基本培养基处理一周后转入 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中诱导芽苗再生, 或不经 MS 基本培养基处理直接转入 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中诱导芽苗再生, 培养温度为 26, 光照时间 12h [8] 观察比较 2 种不同处理方式下的芽苗诱导率 1.4 生根与移栽取出芽苗诱导培养基中的芽苗, 接种在 MS + NAA1.5mg/L 的生根培养基中, 观察其生根情况, 生根培养 20d 后, 打开封口膜炼苗 7d, 人工气候箱温度 28 光照 200μmol/Ls, 相对湿度 75% 炼苗后移栽到高温灭菌后的草炭基质中, 浇足水分, 每两周浇一次 MS 营养液, 自然条件培养, 观察记录移栽后的成活率 [9] 2 结果与分析 2.1 胚性愈伤组织的结果分析各处理愈伤组织诱导率及愈伤组织状态见表 1 由表 1 可知,6 BA 与 NAA 或 IAA 组合均能诱导茎段产生愈伤组织, 但 NAA 的效果优于 IAA, 并且 NAA 以低浓度为优,IAA 以高浓度为优 ; 当处理浓度均为 0.5mg/L 时, 添加 NAA 培养基的出愈率比添加 IAA 培养基的出愈率高 51.0%, 当处理浓度均为 1.0 mg/l 时, 添加 NAA 培养基的出愈率比添加 IAA 培养基的出愈率高 20.0%; 当愈伤组织诱导培养基 NAA 浓度为 0.5mg/L 时, 其胚性性愈伤组织诱导率比 NAA 浓度为 1.0mg/L 的愈伤组织诱导培养基高 34%;6 BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L 是诱导愈伤组织的最佳的激素组合, 其愈伤组织诱导率为 94%, 且形成的愈伤组织大部分是灰白色质地疏松生长较快的胚性愈伤, 非胚性愈伤所占比例少不同培养基所诱导愈伤组织状态见图 1

3 第 2 期马庆等 : 何首乌体细胞胚的诱导及植株再生研究体细胞胚的诱导结果分析将挑选的胚性愈伤组织转入体细胞胚诱导培养基, 各处理体细胞胚诱导率见表 2 由表 2 可知, 当 6 BA 浓度为 1mg/L 时, 添加 2,4 D NAA IAA 的培养基上体细胞胚诱导率分别为 40.0% 53.3% 26.7%, 当 6 BA 浓度为 2mg/L 时, 添加 2,4 D NAA IAA 的培养基上体细胞胚诱导率为 0, 由此可知细胞分裂素 (6 BA) 的用量与生长素素 (2,4 D NAA IAA) 用量的比是决定体细胞胚产生的重要因素, 当细胞分裂素 / 生长素值为 5 1 时有体细胞胚的形成, 但当培养基所添加生长素种类不同时, 其体细胞胚诱导率不同, 添加 NAA 的培养基其体细胞胚的诱导率高于添加 2.4 D 的培养基, 其次高于添加 IAA 的培养基当细胞分裂素 / 生长素值为 10 1 时无体细胞胚的形成采用临时压片法对体细胞胚的发育过程进行观察, 结果如图 2 从图 2 可以看出, 体细胞胚的发育过程是首先在愈伤组织表面形成许多瘤状突起即胚性细胞团, 胚性细胞团继续发育成球形胚盾形胚, 球形胚盾形胚成熟后既可用于诱导发育植株表 1 不同激素处理对愈伤组织诱导率愈伤组织状态的影响 Tab.1 Influenceofdiferenthormonetreatmenttocalusesinducingrateandcalusesstate 处理外植体数产生愈伤数愈伤诱导率 (%) 愈伤组织状态 Treatment No.ofplant No.ofcaloses Rateofinducing caloses Stateofcaloses MS+6 BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L 灰白色质地疏松颗粒状 MS+6 BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L 灰白色质地疏松部分褐化 MS+6 BA2.0mg/L+ IAA0.5mg/L 黄白色褐化 MS+6 BA2.0mg/L+IAA1.0mg/L 灰白色颗粒状疏松部分褐化表 2 不同激素处理对体细胞胚形成的影响 Tab.2 Influenceofdiferenthormonetreatmenttoformationofsomaticembryo 处理产生体胚数接种愈伤数体细胞胚诱导率 (%) Treatment No.ofsomaticembryos No.ofcaloses Rateofsomaticembryos MS+6 BA1+2,4 D MS+6 BA1+NAA MS+6 BA1+IAA MS+6 BA2+2,4 D MS+6 BA2+NAA MS+6 BA2+IAA 体细胞胚的植株再生结果分析将体细胞胚按不同处理方式进行芽苗诱导, 各处理中体细胞胚生长情况及芽苗诱导率明显不同 : 直接在 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中诱导出苗的体胚表现为单个体胚逐渐膨大, 形状由圆形长至椭圆形, 颜色由灰白色转成浅绿色, 单个体胚生长缓慢, 培养至 20d 时个别体胚有萌发长芽现象, 但褐化和根发生的现象很严重 ; 而先在 M 基本培养基中培养一周后再转入 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中的体胚表现为, 在 MS 基本培养基中单个体胚先逐渐膨大, 颜色由灰白色转成浅绿色, 转入 MS+6 BA2.0mg/L 培养基中之后, 体胚继续增大, 颜色由浅绿色变成深绿色, 当培养 20d 时即可看到叶的形态建成, 随后即有幼叶伸展出来, 经统计有 48% 的体细胞胚可以正常萌发形成植株, 将完整植株进行驯化移栽, 成活率达 100, 经体细胞胚发生途径产生的再生植株, 其炼苗成活率显著高于经愈伤组织直接诱导出芽的植株体细胞胚的萌发过程及炼苗移栽结果如图 3

somaticembroyosinmaturation stage 图 2 体细胞胚的发生过程 Fig.

4 232 激光生物学报第 19 卷 a. 处理 1;b. 处理 2;c. 处理 3;d. 处理 4 a.treatmentno.1;b.treatmentno.2;c.treatmentno.3;d.treatmentno.4 图 1 不同激素处理下愈伤组织状态 Fig.1 Calusesinducingfrommediaswithdiferenthormone a. 体细胞胚初发期 ;b. 体细胞胚生长期 ;c. 体细胞胚成熟期 a.somaticembroyosinearlystage;b.somaticembroyosingrowingstage;c.somaticembroyosinmaturation stage 图 2 体细胞胚的发生过程 Fig.2 Procesofsomaticembryosinformation 3 讨论本研究在诱导何首乌体细胞胚时发现 : 当细胞分裂素 (6 BA) 与生长素 (NAA) 的比为 5 1 时, 何首乌愈伤组织表面有体细胞胚的分化, 随着二者比值的增大体胚细胞分化率降低, 当二者比达到 10 1 时体细胞胚的分化率为 0, 愈伤组织表现为继续增殖, 并且仍然保持胚性愈伤的状态由此可知, 生长素与细胞分裂素的比是调节何首乌愈伤组织进一步发育的关键因子, 即当二者的比例较低时有利于愈伤组织向体细胞胚发生途径分化 ; 当二者比例较高时有利于愈伤组织向器官发生途径分化一般认为生

5 第 2 期马庆等 : 何首乌体细胞胚的诱导及植株再生研究 233 a. 体细胞胚成熟 ;b. 体细胞胚萌发 ;c. 体细胞胚形成完整植株 ;d. 定植植株图 3 体细胞胚的萌发过程及再生植株 Fig.3 Procesofsomaticembryosgenminationandregenrationingplant 长素是促进愈伤组织生长的因子, 细胞分裂素是抑制愈伤组织生长的因子因此当二者以适当的比例配合使用, 可使愈伤组织生长速度适中, 使愈伤组织既不能由于生长过快而丧失胚性, 又不能停止生长而适度增殖, 因此可使胚性细胞得到充分发育, 进而有产生体细胞胚的可能在本研究中所选用的生长素 NAA 可以有效的促进愈伤组织的产生与增殖 ; 所选用的细胞分裂素 6 BA 具有很强的细胞分裂活性, 它可以抑制植物体内生长素的合成, 促进细胞分裂素的合成, 二者配合使用可以有效的诱导出何首乌体细胞胚 [10 12] 植物离体培养的体细胞向胚性细胞转变及胚性细胞增殖过程中, 添加外源生长素如 2,4 D NAA 是必要的因此胚性细胞的内源生长素的含量会很高, 然而胚性细胞的进一步发育则需要较低的内源生长素水平, 如果此时内源生长素含量过高会抑制体细胞胚的发育成熟, 所以只有将经初期培养的体细胞胚转入完全没有生长素的培养基上培养一段时间, 使胚性细胞内源生长素含量下降才会促进体细胞胚的成熟因此本研究认为, 在含 6 BA 的培养基上诱导出何首乌体细胞胚后, 将体细胞胚转入无激素的 MS 培养基中继代培养一段时间对何首乌体细胞胚的成熟是必须的 [13 15] References [1] 安志斌, 陈吉炎, 童玉玺, 等. 何首乌混伪品历史渊源与宕芋考证 [J]. 时珍国医国药,1999,10(3): ANZhi bin,chenji yan,tongyu xi,etal.historicorigin oftheadulterautofpolygouum multiflorum ThunbandTextual ResearchOilDangyu[J].LishizhenMedicineandMaterialMedi caresearch,1999,10(3): [2] 崔凯荣, 戴若兰. 植物体细胞胚胎发生的分子生物学 [M]. 北京 : 科学出版社,2000: CUIKai rong,dairuo lan.somaticembryogenesisofmolecu larbiology[m].beijing:sciencepres,2000:59 62

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