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1 第六章目的基因的转化方法

2 内容 一 植物基因转化受体系统二 农杆菌介导法三 基因枪法四 种质系统转化法五 病毒载体转化法

3 植物的基本特征 植物 低等植物无根 茎 叶等分化器官合子不经胚直接发育为个体藻类地衣 高等植物含根 茎 叶 花 果分化器官合子经胚再发育为个体苔藓门蕨类门裸子门被子门

4 一 植物基因转化受体系统 植物基因转化受体系统的条件 植物基因转化受体系统的类型及特性 植物基因转化受体系统的建立 植物基因转化受体系统常见的问题及其解决途径

5 植物基因转化受体系统的概念 植物基因转化受体 ( gene transformation receptor) 系统 : 一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径, 能高效 稳定地再生无性系, 并能接受外源基因 (foreign gene) 的整合 (recombination), 对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统

6 植物基因转化受体系统的条件 高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 抗生素敏感性 农杆菌敏感性

7 高效稳定的再生能力 用于植物基因转化的外植体必须易于再生, 有很高的再生频率, 并且具有良好的实验稳定性和重复性 不同植物的种类 细胞类型 细胞状态 特定的植物培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑

8 较高的遗传稳定性 植物受体系统接受外源 DNA 后不影响其自身的遗传体系, 同时又能稳定地将外源基因遗传给后代, 保持遗传的稳定性 选择适当的培养体系

9 具有稳定的外植体来源 转化的外植体一般采用种子, 无菌实生苗的胚轴 子叶或幼叶, 可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗, 以及可较高频率诱导的营养变态器官等

10 抗生素敏感性 植物基因转化中, 通常使用两类抗生素 : 抑菌抗生素 选择性抗生素 选择性抗生素应满足以下条件 : 植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性 ; 抗生素对受体植物没有剧烈的毒性

11 农杆菌敏感性 对于利用农杆菌 Ti 或 Ri 质粒为载体所介导的植物基 因转化而言, 需要植物受体材料对农杆菌敏感

12 植物基因转化受体系统的类型及特性 经过愈伤组织的受体系统 不经过愈伤组织的受体系统 原生质体再生系统 细胞系及其体细胞胚受体系统 生殖细胞受体系统

13 经过愈伤组织的受体系统 经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织, 并通过分化培养获得再生植株的受体系统 农杆菌直接侵染外植体 培养形成愈伤组织 分化成植株

14 外植体诱导形成愈伤组织 愈伤组织转化外源基因 再生植株

15 特点 : 外植体来源广泛 ; 扩繁量大 ; 适用的植物范围广 ; 嵌合体多 ; 遗传稳定性差

16 注意事项 取材 : 常采用叶片 茎段 子叶 上胚轴等 受体细胞对农杆菌的感受态

17 不经过愈伤组织的受体系统 不经过愈伤组织的受体系统也称直接分化再生系统, 是指外植体细胞越过脱分化阶段, 直接分化出不定芽, 从而获得再生植株的受体系统 取材 : 从组织类型上讲, 叶片 幼茎 子叶 胚轴以及一些营养变态器官较易诱导直接分化 ; 从细胞状态讲, 薄壁细胞较为合适

18 特点 : 获得再生植株的周期短, 操作简单 ; 可较好维持受体植物的遗传特征 ; 转化的外源基因能稳定遗传 ; 嵌合体多 ; 转化频率较低

19 原生质体再生系统 原生质体是 裸露 的植物细胞, 能直接高效地摄取外源基因, 因而转化效率高且合适于现在建立的所有转化方法 原生质体再生系统通常处于相对均匀和稳定的控制环境中, 从理论上说, 有利于准确的转化和鉴定

20 原生质体再生系统 通过原生质体培养, 细胞分裂形成基因型一致的细胞克隆, 因此再生植株的嵌合体少 原生质体培养周期长, 培养技术限制该系统的应用

21 植物原生质体的再生程序

22 细胞系及其体细胞胚受体系统 通过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系, 通常具有较好的遗传和生理状态的一致性, 通过一定的培养基调节, 可使细胞进入胚性状态进而形成体细胞胚 该系统培养技术比原生质体容易, 转化效率又优于其他组织培养系统, 因此被认为是最理想的基因转化受体系统

23 特点 : 胚性细胞繁殖量大, 同步性好, 是理想的基因转化感受态细胞, 转化效率高 ; 转化获得的转基因植株嵌合体少 ; 体细胞胚具有两极性, 减少了不定芽发育途径中的生根培养过程 ; 获得的后代个体间遗传背景一致, 无性系变异小

24 生殖细胞受体系统 生殖细胞受体系统指的是以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统 两条途径 : 利用小孢子和卵细胞的单倍体培养, 诱导出胚性细胞或愈伤组织, 建立单倍体的基因转化受体系统 ; 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化

25 植物基因转化受体系统的建立 外植体具有诱导 callus 和再生植株的能力 ; 芽的分化率高 ; 易培养 ; 体细胞无性系变异小 外植体的选择制备 高频再生系统的建立 抗生素的敏感性试验 对农杆菌介导的基因转化系统而言 农杆菌敏感性试验

26 外植体的选择 外植体生理年龄 外植体细胞生理状态 外植体的遗传背景 外植体的选择与受体系统相匹配

27 培养基选择 植物的营养特性 激素的选择

28 受体系统常见的问题及其解决途径 再生能力及其遗传稳定性 愈伤组织的褐化 再生植株玻璃化

29 再生能力及其遗传稳定性 再生能力下降的解决途径 : 减少筛选继代次数 ; 选用合适的外植体, 采用最适培养基 减少变异性的措施 : 减少组织培养时间, 甚至完全取消组织培养过程 比如用基因伧轰击胚轴或芽的分生组织, 收获种子, 在后代中筛选转化植株

30 愈伤组织的褐化 愈伤组织褐化是由于植物体内含有较多的酚类化合物, 其在多酚氧化酶的作用下, 氧化成为褐色的酚类物质和水, 酚类物质又会在酪氨酸酶的作用下, 使蛋白质聚合, 生长停顿, 最终导致死亡

31 防止褐变的措施 : 选择适宜的外植体 缩短转瓶时间 在培养基中添加抗氧化剂, 如 :Vc 聚乙烯吡咯烷酮 柠檬酸 硫代硫酸钠 二硫苏糖醇 谷光甘肽等 在培养基中添加吸附剂, 如 0.01~0.1% 活性炭

32 再生植株玻璃化 玻璃化再生植株指的是半透明状 畸形的植物, 不能移栽成活 原因可能与培养物渗透势不适当有关, 是植物对培养基水分状态不适应的一种生理表现

33 防治措施 : 适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂, 降低培养基中的渗透势, 降低培养瓶内部环境的相对湿度 ; 适当降低培养基中的细胞分裂素和 GA 的浓度, 适当增加培养基中的一些矿质元素, 如 :Fe Cu Mn Ca K P 等 ; 增加自然光照, 改善培养器皿的气体交换状况等

34 二 农杆菌介导法 System of Agrobacterium-mediated transformation of plant

35 Ti 质粒的结构与功能 T-DNA 的染色体整合机制

36 Ti 质粒的改造除去 T-DNA 上的生长素 (tms) 和分裂素 (tmr) 生物合成基因, 因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物 ; 除去 T-DNA 上的有机碱生物合成基因 (tmt); 因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸, 影响植物细胞的生长 ; 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列, 最大限度地缩短载体的长度 ; 安装大肠杆菌复制子, 使其能在大肠杆菌中复制, 以利于克隆操作 ; 安装植物细胞的筛选标记, 如 neo r 基因, 使用植物基因的启动子和 polya 化信号序列 ; 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆

37 多克隆位点 共整合转化程序 大肠杆菌质粒 农杆菌筛选标记 重组质粒 大肠杆菌筛选标记 转化 农杆菌 大肠杆菌 细菌接合 T-DNA 区同源整合 农杆菌 感染植物根部细胞 T-DNA 区整合在植物细胞基因组上

38 二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌 - 农杆菌穿梭质粒的 T-DNA 区内 ; LB 外源基因 T-DNA 植物细胞筛选标记 Km r RB 重组质粒直接转化农杆菌株, 该菌株携带只含 vir 区不含 T-DNA 区的 Ti 辅助质粒 ; 大肠杆菌 - 农杆菌穿梭质粒 农杆菌 ori 大肠杆菌筛选标记 以上述重组农杆菌感染 植物细胞 大肠杆菌 ori 农杆菌筛选标记

39 常用的农杆菌菌株 菌株类型 菌株 致瘤性 染色体背景 所含质粒 胭脂碱型 C58 致瘤 C58 ptic58 ABI 非致瘤 C58 ptimp90rk A208SE 致瘤 C58 PTiT37-SE MOG301 非致瘤 C58 PTiC58/pBR322 LBA958 非致瘤 C58 PTiC58 GV3850 非致瘤 C58 ptigv3850 T37 致瘤 T37 pti37 章鱼碱型 Ach5 致瘤 Ach5 ptiach5 LBA4404 非致瘤 Ach5 ptial4404 MOG101 非致瘤 C58 MOG101/pMOG410 农杆碱型或琥珀碱型 A281 超致瘤 C58 ptib0542 EHA101 超致瘤 C58 ptib0542 非致瘤 C58 ptib0542 EHA105 超致瘤 C58 ptib0542 非致瘤 C58 ptib0542

40 影响农杆菌转化的因素 农杆菌菌株 农杆菌菌株的浓度 外植体的类型和生理状态 基因活化的诱导物 外植体的预培养 外植体的接种及共培养 转化细胞的选择培养和植株再生

41 马铃薯转基因程序

42 三 基因枪法 基因枪法 ( particle gun ) 又称粒子轰击法 ( particle bombardment ) 和微射轰击法 (microinjectile bombardment,biolistics), 是由 Cornell 大学的 Sanford 等于 1987 年建立的 特点 : 农杆菌介导的植物基因转化一般一次只能转移单个基因或二至三个基因 因此, 在进行转化多个基因时, 需再转化 (re-transformation) 或单个转基因植株间进行杂交, 从而比较费时 费力, 而用基因枪法一次可以转移多个基因

43 1. 基本原理 将外源 DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面, 然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织 微粒上的外源 DNA 进入细胞后, 整合到植物染色体上, 得到表达, 从而实现基因的转化

44 2. 分类 根据基因枪的动力系统, 可分为三类 : (1) 以火药爆炸力为加速动力 (2) 以高压气体 ( 氦气 氢气 氮气等 ) 作为动力 (3) 以高压放电为驱动力

45 3. 步骤 (1)DNA 微弹的制备 (2) 靶外植体材料的准备 (3)DNA 微弹轰击 (4) 轰击后外植体的培养

46

47 GJ-1000 高压气体基因枪 PDS-1000/he 台式基因枪

48 四 种质系统转化法 种质系统转化法方法借助生物自身的种质细胞为媒体, 特别是植物的生殖系统的细胞 ( 花粉 卵细胞 子房 幼胚等 ) 以及细胞的结构来实现转化目的 花粉管通道法 (pollen tube pathway) 胚囊 子房注射法 生殖细胞浸泡法 (germ cell imbibitions transformation)

49 五 病毒载体转化法 随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入, 用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视, 因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中, 而且不受单子叶或双子叶的限制 在大约 300 种特征清楚的植物病毒中, 单链 RNA 病毒约占 91%, 双链 RNA 病毒 双链 DNA 病毒 单链 DNA 病毒各占 3% 利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略 :

50 马铃薯 PVX 病毒载体接种方法 直接在植株叶片上用石英砂摩擦造成伤口, 然后将纯化的载体溶液涂在叶片上 ; 用注射器直接将纯化的载体溶液注入植株体内 ; 真空抽滤法, 将植株叶片浸入载体溶液, 通过真空抽气使其渗入植物体内 ; 牙签沾取载体溶液, 然后将牙签刺入植物幼叶中

51 PVX 病毒载体接种方法

52 烟草脆裂病毒 RTV 载体接种方法 TRV 是二分子线型正链 RNA 呈直杆状, 由 RNA1 和 RNA2 两种粒体组成, 启动子均为 CaMV 35S 这两个载体分别被导入不同的农杆菌中, 在侵染时将两种菌等量混合, 通过注射 喷雾或真空抽滤法等手段侵染叶片, 当病毒基因组 cdna 导入植物并表达后, 病毒即被激活, 则可诱发目的基因沉默

53 TRV 病毒载体接种方法

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