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1 林 第 卷 第 期 年 月 业 ( - 科 /- 学 2 / 2-3 (- 丽江云杉体细胞胚胎发生 陈6芳 6陈少瑜 6吴6涛 6王寅冰 6易善军 6宁德鲁 2云南省林业科学院6昆明 2国家林业局云南省珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室 云南省森林植物培育与利用重点实验室6昆明 2西南林学院6昆明 关键词 6丽江云杉 体细胞胚胎发生 胚性愈伤组织 中图分类号 2666文献标识码-666文章编号 C C C 2-6 ( 2 ( (K J 6(K K 3 6=3 6= ^ I 6^ K l K 3 ( 6N3 2 O@ J K K K K 3 ( - M( K3 6 N O@ ( - -J 2M 6 -( J 6N3 K / 6N3-6< 3 [ UI Y 3 S I U S S Y K 3 K U UI K U U S K U UI C C M :2 U j D-:2 U j Y U U S 3U U 3 Y S 3 C C M :2 U j D-:2 U j Y U U S 3U U S M : 3 C C C U -D-Y U U S 3U U 3 U UI M : S K : 3 Y U U S 3U U : ; < 6 U UI UI 3 66体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要 和植株再生已经应 用 于 生 产并 把 控 制 木 质 素 合 成 途径之一可作为基因工程的受体系统同时也是研 的基因转化到黑云 杉 体 胚 中部 分 研 究 成 果 已 进 入 究细胞全能性细胞 分 化 及 其 形 态 建 成 的 理 想 试 验 中试 美 国 火 炬 松 新 西 兰 辐 射 松 K 体系 在应用上体 细 胞 胚 胎 发 生 是 一 种 有 效 的 大 已应用于生产并进行了人工种子生产仅新西兰一 规 模 无 性 繁 殖 方 法 郭 奕 明 等 贾 彩 凤 等 家公司就利 用 体 细 胞 再 生 年 产 万 株 辐 射 松 苗 3 在目前已 施季森 成功诱导体胚形成的植物中草本植物占了大多数 我国木本植物体细胞胚胎发生研究开展虽然较 已有 多种木本植物获得了体细胞胚尤其是用常 晚 但 也 取 得 了 很 大 的 进 展 马 尾 松 规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生研究 3 黄健秋等 杨艳等 云南 取得了令人瞩目的进展 多 种 不 同 的 针 叶 树 的 外 松 黄 健 秋 等I 华 北 落 植体 成 功 诱 导 出 体 细 胞 胚 施 季 森 自 叶松 O <2 2 S 齐 力 旺 \U 等 首 次 报 道 欧 洲 云 日本落 叶 松 O < 32 吕 守 芳 等 白 未成熟合子胚培养的体细胞胚胎发生和植株再生以 皮 李 茜 等 杉 木 来白 云 杉 M \ 黑 云 杉 J 63 席 梦 利 等 长 叶 塞 尔 维 亚 云 杉 松 2 吴 丽 君 红 豆 杉 ;< 3 D3S U 北 美 云 杉 6 和南方红豆杉 ;< ; 火 炬 松 K 邱德有等 等 针 叶 树 种 利 用 成 熟 或 未 成 熟 胚 M3 U 意大利松 诱导体细胞胚 胎 发 生 实 现 了 植 株 再 生 云 杉 属 树 2 ( 等树种的体细胞胚诱导 种 青 李 映 红 等 白 收稿日期 C C 修回日期 C C 基金项目 国家( 项目 C C 云南省重点新产品开发计划DD 宁德鲁为通讯作者

2 6第 期 陈6芳等 丽江云杉体细胞胚胎发生 3 杨 金 玲 等 红 皮 云 杉 2 U C ( D-2 U C : j 刘宝光等 利用其成熟或未成熟胚 2 U C D-2 U C : j 诱导体细胞胚胎发 生这 些 成 果 为 无 性 系 林 业 的 发 2 U C 此 组培养 基 均 加 入 蔗 糖 C 展提供广阔的前景 谷氨酰胺 U C 水 解 酪 蛋 白 U C 琼 丽江云 杉 是我国西南地区 重要的寒温性针叶树种具有生长快材质优良的特 点 是其分布区的主 要 造 林 树 种 也 被 作 为 庭 园 观 赏树种普遍栽培 目前人工造林及庭院绿化用苗主 要是通过实生繁殖 但 丽 江 云 杉 结 实 较 晚 种 子 成 熟率很低致使 丽 江 云 杉 良 种 苗 供 不 应 求 远 远 不 能满足 造 林 需 求 王 军 辉 等 扦 插 组 织 培 脂 _ b下暗培养 26 体 细 胞 胚 成 熟 培 养 基 6 设 计 培 养 基 组 C ( M :-D- U C M :-D- U C 以上培养基均加 入蔗 糖 M :-D- U C M; U C 琼 脂 _ b下暗培养 养等繁殖方法已成为繁育丽江云杉绿化造林苗木的 26体细胞胚 萌 发 培 养 基 6 以 M 为 基 本 培 养 基 重要途径 丽江云杉通过体细胞胚途径再生植株在 不加激素附加 活性 炭 C 蔗 糖 C 琼 脂 国内外目前尚无报道 本文以丽江云杉成熟合子胚 _ b下 暗培 养 天 后移 入 全 培养直接诱导体细 胞 胚 胎 发 生 和 植 株 再 生为 丽 江 光培养室 云杉离体快速繁育及基因遗传转化提供必要的技术 26观察记录6 丽 江 云 杉 体 细 胞 胚 诱 导 的 各 个 阶 支撑为丽江云杉工厂化育苗提供了一条新途径 段分别记载胚性非 胚 性 愈 伤 组 织体 细 胞 胚 发 生 数量在 显微镜 和 解 剖 镜 下 进 行 镜 检观 察 胚 6材料与方法 性愈伤组织体细胞胚的形态 26材料6丽江 云 杉 成 熟 种 子 采 自 云 南 丽 江 的 丽 6结果与分析 江云杉天然林根据植株表型选择生长较好树干通 直的 个单株作为采种林木每株分别采 _ 个 26胚性愈伤组 织 的 诱 导 6 丽 江 云 杉 成 熟 合 子 胚 球果阴晾 _ 天后剥取种子 在诱导培养 基 培 养 天 后 先 后 从 合 子 胚 的 胚 根 26外植体接种培养6在试验室挑选干净饱 满丽 端下胚轴表面和 上 胚 轴 与 子 叶 区 形 成 白 色 半 透 明 江云杉成熟种子用商用消毒液消毒 U 无菌水 的愈伤组织 图 I _ 天 后 继 代 次 后愈 伤 冲洗 次在超 净 工 作 台 上 剥 取 完 整 胚 图 置 组织增殖较快此 时 转 入 增 殖 保 持 培 养 基 中 继 续 培 入诱导培养基进行培养 养并增殖 _ 天继代 次经 _ 次 继 代 后 将 26胚性愈伤组织 诱 导 培 养 基 6 基 本 培 养 基 的 形成 类明显可辨的愈伤组织 第 类为白色或淡 筛选6选用改良 M M3 U f < 及 黄色颗粒状疏松或结构紧密的愈伤组织逐渐变黄 M 为基本培养基设计诱导培养基 而至褐色死亡 第 类为浅 白 色水 浸状 的 粘性 愈 伤 C C 组织这类愈伤组织在继代培养中生长最快但无形 C 态发生在光照条件下易 变 褐 死 亡 图 第 类 组 D-2 U :j 2 U C < :j D-2 U ( f C :j 2 U C 为白色半 透 明晶 莹有 粘 性 的 丝 状 物 图 S 在 每组 瓶每瓶放置剥取的完整胚 粒 显微镜下观察可见其细胞核大细胞质浓清晰可见 D-2 U M :j : j 2 U 表 生长 调 节 剂 的 筛 选 6 在 基 本 培 养 基 筛 选 试 胚头 即胚 细 胞 和 细 丝 状 胚 柄 细 胞 团 图 为 验完成后为筛选较适宜的生长调节剂设计诱导培 发育较好的丽江云杉胚性愈伤组织 养 基 组 即 以 M 为 基 本 培 养 基 分 别 添 加 26不同基本培养基的胚性愈伤组织诱导结果 6 C j D U 个单株的混合种子的胚接种在 组基本培养基附 加 C j U j D-2 U C :j 2 U C 上 天转接 表 每组 瓶每瓶 粒胚 次 天后进行观察统计其诱导结果 表 组 C 以上 培 养 基 均 加 入 蔗 糖 谷 氨 酰 胺 培养基的诱 导 率 差 异 较 大 f < 没 有 胚 性 愈 伤 U C 水解酪蛋白 U C 琼脂 C 组织分化 M为 o M 比较适宜丽江云杉胚 性 在 _ b下暗培养 伤组织的诱 导 诱 导 率 可 达 o 这 在 针 叶 树 种 上 26胚性愈伤组 织 保 持 与 增 殖 培 养 基 6 设 计 培 养 是较高的诱导率 基 组 M : j D-2 U C : j 26 不 同 激 素 配 比 的 诱 导 结 果 6 个 单 株 的 混 合

3 林 业 科 学 卷6 种子胚接种在 M 基本培养基附加不同浓度 j D-及 丽江云杉不同单株体胚诱导效果的试验 在以上试 j 上 天 转 接 次 天 后 观 察统 计 其 诱 验的 基 础 上 选 用 D-2 U C :j 导结果 表 2 U C 分 别 对 个 单 株 进 行 试 验 表 由 表 可看出参试的 个单株中胚性愈伤组织诱 导 表 =不同基本培养基诱导结果 单株差异较大 号达 o而 号 为 可 见 基 因 B-C= 6 ( - / (</ (( 型对其体细胞胚诱 导 频 率 的 影 响 很 大这 和 其 他 针 < (- < 培养基 < S f U C I 诱导率 S3 ]3 f o 叶树种体胚诱导情况类似 表 不同单株胚性愈伤组织诱导结果 D-2 : j 2 B-C 6 ( - / (</ (( 2 f < :j D-2 :j < ( -( (< </- M:j D-2 : j 2 胚性愈伤组织数 3UI 66 接种数 3UI UI 非 胚 性 愈 伤 组 织 数 3UI j UI I 褐 坏 数 3UI I Y 下 同 K UI Y 单株号 ; I 诱导率 S3 ]3 f o B-C@ 6 ( - / (</ (( < ( -( ( 培养基 < S f U C I 诱导率 S3 ]3 f o D-2 : j 2 D-2 : j 2 D-2 : j 2 下可看到由 个长 形 薄 壁 细 胞 组 成 的 胚 柄胚 柄 上 D-2 : j 2 部是一群团状细胞 形 成 的 胚 性 细 胞 团在 适 宜 的 培 D-2 : j 2 D-2 : j 2 D-2 : j 2 代 _ 天 继 代 次 如 果 不 及 时 继 代 将 会 导 D-2 : j 2 致培养物 胚 性 的 丧 失 且 这 种 丧 失 是 不 可 逆 转 的 26胚性愈伤组 织 的 保 持 与 增 殖 6 胚 性 愈 伤 组 织 增殖培养 _ 次后愈伤组织不断增殖 在显微 镜 养条件下不 断 地 无 序 分 裂 其 细 胞 系 得 以 正 常 继 66培养基中外源激素的配比对胚性愈伤组织的诱 选用生长较 好 的 个 细 胞 系 分 别 放 入 组 培 养 基 导及生长有很大 的 影 响特 别 是 j 的 浓 度 起 着 D-2 U C : j 2 U C 至关重要的作用虽 然 在 各 种 j 浓 度 的 培 养 基 D-2 U C : j 2 U C ( 上都能诱导出胚性 愈 伤 组 织但 诱 导 率 存 在 很 大 差 D-2 U C :j 2 U C 进行增 异 从 表 可 看 出 在 M 基 本 培 养 基 中 j D- 殖试验 C 2 U 下胚性愈伤组 织 诱 导 数 量 在j 2 试验 结 果 表 明 胚 性 细 胞 系 均 能 增 殖但 在 添 加 U 时较 高 随 着 附 加 j 质 量 浓 度 的 增 加 2 U C j 的培养 基 中其 细 胞 团 生 长 过 快 诱 导率逐渐下降 而在 j 2 U C 下胚性愈 在后期成熟体胚诱导中不能诱导出成熟体胚即使 伤组织诱 导 数 量 随 j D-浓 度 的 增 加 诱 导 率 逐 渐 诱导出也是畸 形 胚 而 在 其 余 组 培 养 基 中 继 代 C 增加至 j D-2 U 时 达 到 临 界 值 其 浓 度 再 培养表现较好2 U C j 在 成 熟 体 胚 诱 导 增加诱导 率 随 之 下 降而 低 于 j D-2 U C 诱 中较 2 U C j 成胚率更高 导率也很低 综合观 察 j D-和 j 的 交 互 作 用 26体细胞胚胎 成 熟 诱 导 结 果 6 待 丽 江 云 杉 胚 性 及后期体胚的成熟 质 量选 择 出 丽 江 云 杉 胚 性 愈 伤 愈伤组织大量增殖后即可接入体胚成熟培养基中 C C 组织较 适 宜 的 诱 导 培 养 基 D-2 U : -D-目前已被 广 泛 用 于 促 进 针 叶 树 的 子 叶 胚 发 育 j 2 U 以该培养基作为诱导培养基能获得 成熟的培养 基 中 一 般 认 为 -D-的 作 用 是 防 止 产 较好胚性愈伤组织后期体胚成熟时畸形胚较少 生裂生多胚因而 促 进 胚 胎 单 个 化 并 进 一 步 发 育 成 26 不 同 单 株 诱 导 结 果 6 大 量 文 献 资 料 黄 健 秋 熟但不同物种所需 -D-浓度不一 本次 试验 分 别 等I N 表明 添加 -D- U C 表 结果表明以 针叶树种体胚诱导 单 株 个 体 差 异 较 大为 此 进 行 了 添加 -D- U C 的 处 理 效 果 较 好 成 胚 数 量 较 C

4 6第 期 陈6芳等 丽江云杉体细胞胚胎发生 多且体细胞胚质量较好偶见畸形胚 图 表 K不同浓度 Y处理体胚成熟效果 26成熟体胚的萌发6待体细胞胚成熟后可 清 晰 见到形成的子叶而发育到子叶胚期时将胚轻轻挑 B-CKZ- / (6 -( - 出转至无激素的体细胞胚发育培养基中放置在光 /(< < (Y ( ( - ( 强 _ 下培养 _ 天 后体细 胞 胚 -D-质量浓度 ( -D-f U C 接种量 3UI f 2 成熟体胚数 3UI U 3 UI 萌发呈绿色下胚轴伸长白色胚根向下延伸根尖 正常分化 图 K _ 天 后形 成 完 整 小 植 株 待苗长到 _ U时移到自然光下练苗 天 用清水洗净即可移到营养 袋 中放 入 温 室 图 l 本试验移栽成活率达到 o 待 小 苗 长 出 新 叶生 长至 _ U时即可移到大田 图 6丽江云杉体细胞胚胎发生 J 6 U UI 刚剥的成熟合子胚 I刚开始形成的胚性愈伤组织 水浸状的愈伤组织 S发育较好的 胚 性 愈 伤 组 织 清 晰 可 见 的 胚 头 和 胚 柄 体胚成熟 体胚开始萌发 K刚分离的成熟体胚 体胚苗伸长 l 再生植株 m UI S I UI S j 3 SUI 3 Y Y UI K S S 3 U < 3 U UI ; U U UI K S U UI ; Y 3 U UI l M S 6结论与讨论 为 o 在白云杉中3 等 以幼胚为材料诱 导率达 o UI 以 成 熟 胚 为 材 料 诱 导 选择合适的外植体是诱导体细胞胚发生的第一 率仅为 o D3S U 等 以 塞 尔 维 亚 云 杉 步也是成 功 的 关 \U 等 首 次 以 欧 _ 天的幼苗为材料诱 导 体 胚通 过 调 节 细 胞 分 洲云杉的幼胚为外 植 体 诱 导 体 细 胞 胚 获 得 成 功愈 裂素 浓 度 最 高 诱 导 率 达 2o 李 映 红 等 伤 组 织 诱 导 率 几 乎 达 到 o 而 - U S 对青 进行体胚诱 导结 果 只 从 幼 胚 中 诱 导 出 体 细 以其成熟胚为材料诱导愈伤组织诱导率仅 胞胚 杨金玲等 在总结前人经验的基础上 以

5 林 业 科 学 卷6 白 成 熟 胚 为 材 料 得 到 了 较 好 的 结 果 诱 导 率 达 且 这 种 丧 失 是 不 可 逆 转 的 继 代 培 养 时 最 好 把 o 刘宝光等 以红皮云杉未成熟胚为 材料 j 浓度降低这有利于保持其胚性 进行诱导研究了 基 本 培 养 基光 照 条 件胚 采 集 时 间最后得到较高诱导率 2o 本试验成功建立了丽江云杉体细胞胚胎发生体 系扩大规模与生 产 结 合 进 行 规 模 化 种 苗 生 产利 基因 型 是 影 响 体 细 胞 胚 胎 发 生 的 内 在 因 素其 用生物反应器大规模生产丽江云杉体细胞胚还有待 个体遗传基 础 决 定 了 离 体 培 养 的 反 应 能 力 即 再 进一步完善和研究 由于体细胞胚发生体系较为稳 生能 力 不 同 种 的 植 物 甚 至 同 种 植 物 的 不 同 品 定可以在分子 水 平 上 研 究 其 胚 胎 发 生 的 机 制 利 种不同地理来源不 同 家 系 个 体 之 间其 个 体 基 因 用农杆菌介导等转 化 方 法在 胚 性 愈 伤 组 织 阶 段 进 型都存在差异这就 决 定 了 不 同 的 体 细 胞 胚 胎 发 生 行侵染导入目的 基 因进 行 遗 传 改 良可 以 缩 短 丽 能力 明 显 不 同 < 3 3j = - 江云杉育种周期 黄健秋 等 I 以 云 南 松 云 南 广 西 参 个种源成熟胚为材料同时 放 入 种 培 养 基 中诱 导率为 2o _2o 唐 巍 等 以 火 炬 松 成 熟胚 个基因型为 材 料放 入 种 培 养 基 中 分 别 培 养结 果 发 现 各 基 因 型 差 异 较 大 诱 导 率 为 _ 等 以 个 基 因 型 火 炬 松 为 材 2o 料诱 导 胚 性 愈 伤 组 织 诱 导 率 最 高 达 2o 最 低 仅 为 2o 塞尔维亚云杉的 个品种在外植体大 小和培养条件完全 相 同 的 情 况 下 诱 导 体 胚体 细 胞 诱导频 率 最 高 达 2o 最 低 只 有 2o N 为 了 使 取 材 时 间 不 受 胚 发 育 时 间 的 限 制本试验以丽江云杉成熟胚为材料分别从 个单 株上采集进 行 培 养 诱 导 率 为 _o 这 一 结 果 表明丽江 云 杉 基 因 型 对 体 细 胞 胚 胎 发 生 有 较 大 影 响这方面的机制还有待深入研究为提高体胚诱导 率下一步可以尝试以不同发育期的胚作为外植体进 考 文 献 郭奕明杨映根郭6毅等 2落 叶 松 体 细 胞 的 胚 胎 发 生植 物 生理学通讯 C 黄健秋卫志明许智宏 马 尾 松 成 熟 合 子 胚 的 体 细 胞 胚 胎 发 生和植株再生科学通报 C 黄健秋卫志明 I云南松成 熟 胚 的 体 细 胞 胚 胎 的 发 生 研 究实 验生物学报 C 贾彩凤李6悦2华山松胚性 愈 伤 组 织 诱 导 与 幼 胚 离 体 培 养 植物学通报 C 李6茜张存旭郑瑞杰2白皮松 胚 性 愈 伤 组 织 诱 导 因 素 的 研 究西北林学院学报 C 李映红郭仲琛2青 在不同条件下的体细胞胚胎发生及苗的 形成植物学报 C 刘宝光李成浩王伟达等2红皮云杉胚性愈伤组织诱导技术 研究植物研究 C 吕守芳张守攻齐力旺等2日本落叶松体细胞胚胎发生的研 究林业科学 C 齐力旺 韩一凡 韩素英等2麦芽糖--及 -D-对 华 北 落 行培养 叶松体细胞胚成熟及生根的影响林业科学 C 丽江 云 杉 体 细 胞 胚 胎 发 生 过 程 可 分 为 个 阶 段每个阶段所用培 养 基 中 激 素 类 型 和 浓 度 配 比 的 组合 比 较 复 杂 从 本 试 验 看诱 导 阶 段 j 起 主 导作用而在成熟培 养 阶 段-D-是 关 键 因 子这 与 目前已成功进行体胚再生的其他针叶树种相似 通 过试验筛 选 出 胚 性 愈 伤 组 织 诱 导 培 养 基 M : j D-2 U C :j 2 U C 胚 性 愈 伤 C 组织保 持 与 增 殖 培 养 基 D-2 U : C j 2 U 成 熟 体 胚 诱 导 培 养 基 M : -D- U C 体胚萌发培养基 M : C 活 性炭 :蔗糖 C 胚性愈伤组织增殖培养 _ 次后愈伤组织不 断增殖在显微镜下 可 看 到 由 个 长 形 薄 壁 细 胞 组 成的胚柄胚柄上部 是 一 群 团 状 细 胞 形 成 的 胚 性 细 胞团在适宜的培养条件下分散的多胚就会不断地 无序分 裂细 胞 系 得 以 正 常 继 代 _ 天 继 代 次如果不及时将胚 性 愈 伤 组 织 从 非 胚 性 愈 伤 组 织 中挑选出来进行培养将会导致培养物胚性丧失而 邱德有李如玉李6玲2红豆杉 及 南 方 红 豆 杉 体 细 胞 胚 胎 发 生研究林业科学 C 施季森2迎接 世纪现代林木生物技术育种的挑 战南 京 林 业大学学报 C 唐6巍欧阳潘2火 炬 松 胚 性 愈 伤 组 织 诱 导 和 植 株 再 生 的 研 究林业科学 C 王军辉张建国张守攻 等2丽 江 云 杉 硬 枝 扦 插 技 术 与 生 根 特性研究西北农林科技大学学报 C 吴丽君2长叶松优良家系的 体 胚 发 生 研 究福 建 林 学 院 学 报 C 席梦利施季森2杉木合子胚 愈 伤 组 织 的 诱 导 及 植 株 再 生南 京林业大学学报 C 杨6艳李志辉丁贵杰等2马尾松幼胚培养愈伤组织诱导的 初步研究湖南环境生物职业技术学院学报 C 杨金玲桂耀林杨映根等2白 体细胞胚胎发生及其植株再 生植物学报 C D3S U /3l >2 D [ S S3 I3S S 3 M3 \M ( 3 U UI S d (3 3 C ( ( (Z U [ Y \Z 2M 2 I U UI M

6 6第 期 陈6芳等 丽江云杉体细胞胚胎发生 ( 3 S d (3 3 C ; N K S Z 2 6 \ 3 U UI U ( C - S 2 M K 3 K \U Y 3 N 3 M C MK N < ;3 M Z Y >N 2 U UI Y S / 3U ; U U S KZ 3Y - S U M3I K j ( S 3 < Z U [ Y \Z2( 3j = < - D S3 U j S j S S U K 3 K U UI M ( 3 S d (3 3 C J@ ;I3N 2 I U S 3U Y K 3 S MK UI M3 U ; ;3 MZ 2< K S S3 3 I U UI 3 S I U K S U k M N 3 M3 U ; N K 2 U UI I K U J C 3 ( 2 > S U ( ^ UI U U UI ]3 M ( 3 S d (3 3 C 3 D2( UU S U U 3 U UI - J C > =K > S 2; K Kj = ]3 S 3 K U I M C < J Y\ ( - 2 U 3 3 U UU 3 [ UI I M ( S UI U UU 3 S U 3 [ UI > C UI U D \ 3 3 ( ^ K - 2 U UI S 3 3 S UU 3 UI M C MK 2 U UI < 3 ( ; U j S U M U U M ( 3 S d (3 3 C 3 M C UI J <2 U UI S ( ND U UI S U S C - U S 2 U S U UI U 3 M MK C M \ ^ M S D N < 2 U UI YK U S U I S K -; C 责任编辑6徐6红

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