实验一　　实验室基本设备及其用途的识别

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1 植物组织培养 实验指导 江苏大学食品与生物工程学院

2 目录 目录...1 实验一 实验室基本设备及其用途的识别...2 实验二 常用仪器 必要器皿 几种主要设备的使用方法 常用几种药剂的配制...3 实验三 洗涤 灭菌...6 实验四 MS 培养基母液的配制...13 实验五 营养培养基配制和灭菌...16 实验六 幼叶培养...20 实验七 种子培养...22 实验八 茎段培养...23 实验九根的离体培养...24 实验十 烟草愈伤组织, 胚状体继代培养...26 实验十一 番茄离体再生体系的建立...31

3 实验一 实验室基本设备及其用途的识别 一 目的认识植物组织培养实验室的基本结构, 必需的基本设备及其用途与作用方法 二 实验室的基本结构 ( 一 ) 化学实验室 ( 工作室 ) 培养基药品称量 配制 分装 灭菌 ; 材料预处理 ; 培养材料的观察分析 ; 制蒸馏水 设备 药柜 工作台 蒸馏水器 天平 冰箱, 手提高压消毒锅 显微镜 解剖镜 各种玻璃仪器 金属仪器等 安装水 电 排气等装置 ( 二 ) 接种室 1 无菌操作室 2 接种箱 3 超净工作台 ( 三 ) 培养室 ( 四 ) 洗涤 消毒室 ; 卧式高压消毒锅 ( 五 ) 温室 ( 培养大棚 )

4 实验二 常用仪器 必要器皿 几种主要设备 的使用方法 常用几种药剂的配制 一 目的认识植物组织培养必需的仪器 器皿, 几种主要设备的使用方法 常用几种药剂的配制 二 常用仪器 1. 蒸馏水器 ( 学习操作 ) 2. 手提式高压消毒锅 卧式高压消毒锅 ( 学习使用 操作 ) 3. 天平 ⑴ 药物天平 ( 工业天平 ) 粗天平 ( 精密度 1/10) ⑵ 分析天平 ( 精密度 1/10000) 4. 超净工作台 ( 学习 使用 操作 ) 5. 电热干燥箱 ( 烘箱 ) 6. 恒温光照培养箱 ( 学习 操作 ) 7. 电冰箱 8. 显微镜和解剖镜 1 手提式解剖镜 ( 学习 使用 操作 ) 2 立体解剖镜 3 普通显微镜 9. 旋转培养机 10. 离心机 ( 学习 使用 操作 ) 11. 酸度测定仪 :⑴ 精密 PH4-7 试纸 ;⑵ 笔型袖珍酸度计 三 必要的器皿 ( 一 ) 玻璃器皿 1. 培养器皿 1 试管 2 三角烧瓶 ( 锥形瓶 ) 3 圆形高形培养瓶 ( 罐头瓶 ) 4 培养皿 5 扁身培养瓶 6 L 型和 T 型管 7 凹面载玻片

5 2. 盛装器皿 1 试剂瓶 2 烧杯 3. 计量器皿 1 量筒 2 容量瓶 3 吸管 4. 其它器皿滴瓶 称量瓶 漏斗 玻璃管 注射器等实验室常用器皿 ( 二 ) 金属器械 1. 镊子类 cm 长型镊子 ( 接种或转移愈伤组织 ) 2 尖端弯曲 枪型 镊子 ( 镊取较小的植物组织 ) 3 尖头钟表镊子和鸭嘴镊子 ( 剥离表皮用 ) 4 尖端为小铲状镊子 ( 挖取带琼脂培养基的培养物 ) 2. 解剖刀和刀类 1 眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀 ( 切割柔软组织中小细胞团 ) 2 解剖刀 ( 手术刀 ) 3 双面刀片焊接在玻棒上 ( 切取茎尖用 ) 4 锋利小刀 大刀和小铁锹 3. 剪刀类 1 解剖剪 2 眉剪 3 眼科剪 cm 弯头剪 5 俢枝剪 4. 接种针四 几种常用药剂的配制 ( 一 ) 用 95% 尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制 学习配制 70% 和 75% 酒精 ( 二 ) 消毒剂 1. 20% 次氯酸钠溶液称取 20g 次氯酸钠用少许水溶解,100ml 水定容 % 升汞 (HgCl 2 ) 溶液称取 0.1g HgCl 2 少许水溶解,100ml 水定容 ( 三 ) 洗涤剂 1. 2HCl 酒精 95% 酒精 100ml 加入 2mlHCl 2. 硫酸 - 重铬酸钾洗液称取 10g 重铬酸钾加入蒸馏水 90ml, 加热溶解冷却后, 逐渐加入浓硫酸 175ml, 放入棕色玻璃瓶备用,( 注意 : 切记不可将盛过洒精, 甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在, 因为重铬酸钾是一种强的氧化剂, 一旦被还原氧化, 洗液变绿, 失去洗涤作用 ) 这些器皿必须用

6 自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液 ( 四 ) 1 摩尔浓度 (mg/l)naoh 和 1 摩尔浓度 (mg/l)hcl 配制 摩尔浓度是指用 1 升 (1000ml) 溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度 用 M 表示 1. NaOH 摩尔浓度 (M) NaOH 摩尔质量 = 分子克数 =40g 1M NaOH 是指 1000ml 溶液中含有 40 克摩尔质量的 NaOH, 现要配制 100ml =4g 称取 NaOH4g, 用少量溶解, 定容 100ml. 2. HCl 的摩尔浓度具体配制酸的 mol 浓度时, 应考虑原浓酸的比重 mol 浓度 要求配制的 mol 浓度 需配制的体积 原酸分子量 V= 原酸的百分浓度 原酸的比重 1000 配制 1.0M HCl 100ml, 量取 38%, 比重为 1.19 的 HCl8.06ml 加蒸馏水, 定容至 100ml 五 作业 1. 将实验整理成实验报告 2. 因地制宜建一个组织培养实验室, 需要哪些实验室? 各分室的作用是什么? 3. 常规组织培养时, 需要什么设备和器械? 怎样使用?

7 实验三 洗涤 灭菌 植物组织培养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养, 导致污染的来源主要有 : ⑴ 器皿和用具 ;⑵ 培养基 ;⑶ 培养材料 ;⑷ 工作人员本身 ;⑸ 操作时的空气 防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿, 用具 培养基 接种室 培养室等进行灭菌和无菌操作 一 洗涤 ( 一 ) 玻璃器皿的洗涤 1. 新购置的玻璃器皿的洗涤 ( 学习 操作 ) 因有游离碱性物质, 使用前先用 1% 稀盐酸浸泡一夜, 然后用肥皂水洗净, 清水冲洗, 最后用蒸馏水冲洗一次, 干后备用 2. 已用过玻璃器皿先将残渣除去 ; 用清水洗净, 再用热肥皂水或洗衣粉洗净, 清水冲洗干净, 最后用蒸馏水冲洗一次, 干后备用 3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如 : 吸管, 滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗, 自来水冲干净后, 晾干, 再浸入硫酸 - 重铬酸钾洗液中浸泡若干小时, 用夹子取出在自来水冲洗干净, 再用蒸馏水冲洗 1-3 遍, 稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用 4. 对带有凡士林, 石蜡, 或胶布的器皿选用特殊方法处理后, 再用常规方法洗涤 带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去, 再用汽油擦洗干净, 然后用热肥皂水煮沸半小时, 刷洗后, 自来水冲干净 若带有石蜡, 可在玻璃器皿下垫几层废纸, 放入 温箱中 1 加热 -2 小时, 待石蜡融化后, 再用废纸反复擦 2-3 次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗, 蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物, 先用 70% 酒精棉球擦数遍, 溶解粘胶物, 并用少许去污粉刷抺, 再用洗衣粉煮沸半小时, 刷洗干净, 自来水冲洗, 晾干, 再泡入洗液 ( 二 ) 金属器皿新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油, 用蘸有四氯化碳 (CCl 4 ) 布擦去油脂, 再用湿布擦净, 干燥备用 二 灭菌 ( 一 ) 器皿和用具常用灭菌方法 : 1. 热压灭菌法 ( 学习操作 ) 将洗净的培养器皿, 用具, 用牛皮纸包好, 放入高压消毒锅中,1.1 个大气压下灭菌 分钟 2. 干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中, 分钟或 120 两小时, 待冷却后使用 ( 二 ) 无菌室灭菌 ( 接种室 培养室 )

8 1. 紫外灯照射 40min 后, 用新洁尔灭擦抺工作台,70% 酒精擦拭超净工作台 2. 薰蒸 ( 学习操作 ) 用甲醛 高锰酸钾提前 1-3 天薰蒸密封房间方法 1: 甲醛倒入蒸发皿加热, 用量 10ml/m 2 方法 2: 甲醛 (HCHO) 与高锰酸钾 (KMn 4 ) 以 10:1 比例混合 3. 接种前用 70-75% 酒精喷雾, 使飘在空气中的尘埃沉积下来 4. 用紫外光灯进行照射灭菌 ( 波长 A 最好 ) 接种箱及用具 分钟 ( 三 ) 培养基灭菌 ( 略 ) ( 四 ) 培养材料灭菌 ( 略 ) ( 五 ) 工作人员无菌操作 ( 略 ) 培养基 ( 一 ) 培养基成分一 培养基的成分是影响组织培养的最根本的外部因素 对某种植物培养成功与否是各种条件综合影响的结果 这些综合因素存在于每一个培养步骤 每一个单因子都可能导致培养的失败 影响培养效果的因素分有外因和内因, 外因有培养基成分及物理状态, 培养温度, 光照强度, 光的质及波长等等 这五种最根本的是培养基成分, 因为它是培养材料的生命之地, 它若适宜 培养则易成功, 反之则失败 二 培养基的成分 ( 一 ) 大量元素植物生长必需的 C H O N P K S Ca Mg 九种元素在植物组成中含量较多, 通常占干重或灰分的千分之几, 百分之几, 所以在培养基中用量较大叫大量元素, 大量元素 H O 两种元素主要从水中获得,C 从光合作用 CO 2 来, 但离体植物或组织没有光合作用能力 因此通过加糖提供 C 源, 常用浓度为 1-5%, 常用分析纯 化学纯的蔗糖 N 常用硝态 N( 硝酸钾等 ) 和铵态 N( 硫酸铵等 ) 大多数以硝态 N 为主 MS 培养基和 N6 培养基既含有硝态 N 又含有铵态 N,P 参与植物生命过程中的核酸合成, 蛋白质合成, 光合作用, 呼吸作用及能量贮存, 转化和释放等重要生理生化过程 K 在近代培养基中, 用量有提高的趋势,Ca Mg S 的需要则较少 能提供这些元素的物质主要有磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ), 七个结晶水的硫酸镁 (MgSO 4.7H 2 O ), 二个结晶水的氯化钙 (CaCl 2.2H 2 O) ( 二 ) 微量元素包括 Fe Cu Mo( 钼 ) Zn Na Mn Co( 钴 ) B( 硼 ) 和 I( 碘 ), 它们在植物组织培养基中需要量极微, 体内含量常在 mol/l 之间, 培养基中添加 moi/l( 摩 / 升 ) 就可满足需要, 多了就会引起植物细胞酶失活, 代谢障碍, 蛋白质变性及组织死亡 Fe 是用量较多的

9 一种微量元素, 对植物组织叶绿素的合成和延长生长起重要作用 因使用 Fe (SO 4 ) 3 ( 硫酸铁 ) 和 FeCl 3 ( 氯化铁 ) 在培养基 PH 为 5.2 以上时 Fe (OH) 3 沉淀, 植物材料无法吸收, 故常用 FeSO 4.7H 2 O( 硫酸亚铁 ) 和二乙铵四乙酸二钠 (Na 2 -EDTA) 结合成螯合铁成为有机态被吸收和利用 Cu 有促进离体根生长的作用 ;Mo 是合成活跃的硝酸还原酶的组成部分, 也是固 N 酶的组成部分, 还有防止叶绿素受破坏的作用 ;Mg Zn Na 是酶的组成部分, 也是防止叶绿素被破坏的作用 ; Mn 与植物呼吸作用 光合作用有关 ;B 与糖的运输, 蛋白质合成有关, 总之, 微量元素在生命活动中, 多以酶系中的辅基形成起重要作用 ( 三 ) 有机营养 1. 维生素类 : 大多数植物组织或细胞能够合成必要的维生素, 但是在数量上显然是不够的, 通常在培养基中补加一种或多种维生素但各标准营养培养基所用维生素组合差别较大, 常使用的有 : 维生素 B 1 ( 盐酸硫铵素 ) 用量 mg L -1 维生素 B 6 ( 盐酸吡哆醇 ) 用量 mg L -1 维生素 H( 生物素 ) 用量 mg L -1 烟酸用量 mg L -1 肌醇用量 mg L -1 核黄素用量 mg L -1 抗坏血酸用量 1-100mg L -1 泛酸钙 叶酸用量 mg L 氨基酸 : 是重要的有机 N 源, 有甘氨酸 丝氨酸 谷氨酸 天冬酰铵, 水解酪蛋白 (CH), 水解乳蛋白 (LH), 它们主要作为营养提供, 以利于蛋白质合成,CH 和 LH 是近二十种氨基酸的混合物, 常用量 mg L 有机添加物是一些成分较复杂, 大多数含氨基酸 激素 酶等的复杂化合物, 它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用, 但成分大多不清楚, 含量也不稳定, 所以一般应尽是避免使用, 特别是新的生长调节剂物质不断产生, 更缩小它们的使用范围 ⑴ 椰乳 (CM): 液体胚乳, 一般浓度 10-20% ⑵ 香蕉 : 用量 g L -1 黄熟的小香蕉加入培养基后即变紫色, 对 PH 的缓冲作用影响很大, 主要于兰花组培 ⑶ 马铃薯, 去皮去芽后用量 g L -1, 切碎,30 煮分钟, 过滤液, 加入培养基, 对 PH 有缓冲作用 ⑷ 其他还有酵母提取液 (YE), 用量约 0.5%; 麦芽提取液用量 % 苹果汁 番茄汁 柑桔汁等 ( 四 ) 琼脂是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质, 作固体培养基凝固剂用, 一般用浓度 0.6-1%, 视琼脂质量而异 因天然产物, 牌号, 批号不同, 质量差异大, 用量亦有所差异, 有时还有一些有害物

10 质, 用前要浸洗琼脂以色白, 洁净为好 ( 五 ) 糖糖是碳源, 提供营造新细胞, 新的化合物的碳骨架, 也为组织呼吸代谢提供底物及能源, 还能维持培养物所需渗透压 植物组织培养中提供碳源的糖类有蔗糖 葡萄糖 果糖是最好的碳源, 多数植物在芽分化时糖用量为 30g L -1, 根分化时用 15-20g L -1, 但也有高达 g L -1, 培养基筛选等项研究工作时, 为避免出现误差而影响实验效果, 最好用纯度较高的蔗糖, 实际生产中, 完全可以用市集的白糖代替化学纯的蔗糖 ( 六 ) 活性炭加入活性炭目的是除去琼脂中的毒物或培养物产生的芳香族的代谢废物, 活性炭可防止组织变褐并利于胚胎发生与生根培养, 活性在制造方法和来源不同, 差异较大, 一般用量 % ( 七 ) 植物生长调节物质植物生长调节物质是培养基中关键物质, 对植物组织培养起着生根而又明显的调节作用, 没有哪一种比植物调节剂所生产的影响更大, 它用量的多少, 配比的适当程度, 将影响培养的成败, 即影响到愈伤组织的生长, 形态建造, 根和芽的分化等等 目前已知的生长素, 赤霉素, 细胞分裂素, 脱落酸和乙烯五大类植物激素, 几乎都与分化有关 在植物组织培养中, 生长调节剂, 尤其是生长素和细胞分裂素非常重要可以说没有生长调节就不可能进行植物组织培养 生长素常用 2.4-D, 萘乙酸 (IAA), 吲哚乙酸 (NAA), 吲哚丁酸 (IBA) 等, 其生理作用主要是促进细胞生长, 刺激生根, 对愈伤组织的形成起关键作用 细胞分裂常用激动素 (KT),6- 苄基氨基嘌呤 (BA), 玉米素 (ZT),2- 异戊烯腺嘌呤 (Zip), 它们经高温高压灭菌后性能仍稳定 SLKT 受光易分解, 故应在 4-5 低温黑暗下保存, 细胞分裂素有促进细胞分裂和分化, 延长组织衰老, 增强蛋白质合成, 抑制顶端优势, 促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点 通常认为, 生长素和细胞分裂素的比值大时, 有利于根的形成 ; 比值小时, 则促进芽的形成 低浓度 2.4-D 有利于胚状体的分化, 但妨碍胚状体进一步发育,NAA 有利于单子叶植物分化, IBA 诱导生根效果最好 赤霉素 (GA) 的生理作用是促进植物伸长, 节间伸长, 分生组织芽生长, 诱导淀粉的合成, 打破休眠和促进开花等, 与生殖器官发生有关, 一般不常用 脱落酸是植物体天然存在的生长抑制物, 有促进叶部脱落, 诱导休眠作用, 与生殖器官发生有关 乙烯是植物内唯一呈气体状态的激素, 与植物衰老和成熟有关

11 植物营养培养基中常用的植物生长调节剂 类别名称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明 2,4- 二氯苯氧乙酸 2,4-D mg/L 生长素通常 IAA 易被植 生长 α- 萘乙酸 NAA mg/L 用 NaOH 溶液滴至溶解 物细胞所氧化 故培养基 素 吲哚 -3- 乙酸 IAA mg/L 成溶液 中很少单独 吲哚 -3- 丁酸 IBA mg/L 能溶于乙醇 使用 6- 苄基氨基嘌呤 BA 分裂素通常 玉米素不耐 细能溶于稀热, 不能高压 6- 糠基氨基嘌呤 KT 胞 NaOH, 含水灭菌 分乙醇或稀盐 N- 异戊烯氨基嘌呤 ZT 裂酸 ( 玉米素 ) 赤霉素 GA 能溶于乙醇 不耐热不能 赤霉素 高压灭菌在愈伤组织和悬浮培养物 的启动和保 持生长时才 需要有时小 植株再生时 也需要 三 ph 的调整培养基的 ph 值 ( 酸碱度 ) 直接影响对离子的吸收, 所以过酸或过碱都对植物材料有很大影响 此外, 琼脂培养基的 PH 值还影响到凝固情况最好用酸度计, 若无也可用精密 PH- 试纸 ( 干燥保存 ) 过酸用 1NNaOH 调节, 过碱用 1NHCl 调节, 经高压灭菌后, 由于某些成分的分解 ( 如蔗糖分解 ) 或氧化, 酸度会增加,pH 一般可降低 (0.2), 培养基 ph 一般调至 的范围 四 培养基中采用浓度单位计量有 : 1. 毫克 升 (mg/l 或 mg L -1 ) 每升溶液中所含某化合物的毫克重 2. 微克 升 (ug/l 或 ug L -1 ) 每升溶液中所含某化合物的微克重 3. 重量百分率 : 每 100ml 溶液中含某化合物的克重如 :2% 表示 1000ml 溶液中含化合物 20g, 采用琼脂和蔗糖时常用此单位 4. 克分子重量 (mol L -1 即 mol/l)mol 每升溶液中所含某化合物的克分子重 (mol), 此种单位常用于生长调节剂, 按用量不同, 又分毫克分子重 (mmol L -1 ) 和微克分子 (umol L -1 )

12 5. 容积百分率 :100ml 溶液中含有某化合物的毫升量, 常用于表示椰子乳汁, 番茄汁 马铃薯汁等 ( 二 ) 培养基种类一. 培养基的种类培养基的种类 成分直接影响到培养材料的生长, 故应根据培养植物的种类 部位选择适宜的培养基 ( 一 ) 高盐成分培养基 : 包括 MS LS BL BM ER 等培养基, 它应用最广泛, 其钾盐, 铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 目前植物组织快繁中, 应用 MS 培养基最多 ( 二 ) 硝酸钾含量较高的培养基 1. B 5 培养基 BB5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫铵素, 较适应南洋杉, 葡萄和大豆科, 十字花科植物的培养 2. N 6 培养基 N 6 培养基 ( 朱至清等 )1975 年我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑桔花药培养也适合, 楸树 针叶树等的组织培养使用效果也好 3. SH 培养基此培养基是矿盐浓度较高的培养基, 其中铵与磷酸是由 NH 4 H 2 PO 4 提供的 ( 三 ) 中等无机盐含量的培养基 1. H 培养基 (Bourgin 与 lnitsch) 大量元素为 MS 培养基的一半, 仅 KH 2 PO 4 及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较 MS 为高, 维生素种类比 MS 多, 适于花药培养 2. 尼奇培养基 (Nitsch) 与 H 培养基的成分基本相同, 仅生物素较 H 培养基高 10 倍, 也适于花药培养 3. 米勒培养基 (Miller),Blaydes 培养基适合于大豆愈伤组织培养和花药培养用 ( 四 ) 低无机盐培养基, 大多数情况下用于生根培养基 1. 改良怀特培养基 (White) 2. WS 培养基 (Wolter and skoog) 3. 克诺普液 (sknop) 花卉培养上用得多 4. 贝尔什劳特液 (Berthelot) 5. HB(Holley and Baker) 花卉培养, 木本植物的茎尖培养效果良好, 其成分是大量元素比 1/2 克诺普液稍多, 微量元素用贝尔劳什特液, 每升培养基中加 0.5ml 二. 培养基的选择所培养的植物已有前人作过研究的, 可以从文献中找到可供采用的合适培养条件 ; 若前人从未培养过, 就要选择和建立一个最适于该植物的营养培养基 可采用一种已知培养基如 MS B 5 或 SH, 对少数成分进行改变 ; 进行一系列试验, 在修改一种培养基时, 对无机成分和有机成分分别处理 在植物组织培养基中最可变的因素是生长调节剂, 尤其是生长素和细胞分裂素, 具体方法 : 首先选择好一种基本培养基 (MS) 对生长素 (NAA) 和细胞分裂素 (BAP) 均分别制定大约五种浓度 0, 0.5, 2.5, 5, 10 μmol( 微克量 ) 将这两种调节剂的五种浓度进行排列组合便可以得到 25 个组合的

13 试验性培养基, 从 25 个培养基中挑选出最好的培养条件 (2) 进一步选择最合适的生长素和细胞分裂素 ( 浓度均与最适条件浓度相同 ) 方法是先保持其中的生长素不变 只改变细胞分裂素的类型, 反之亦然 虽然高盐培养基 (MS 等 ) 从许多植物系统中已证明是良好的, 但是有些培养物在低盐培养基上生长得更好, 因此值得花精力去检验一下在最适生长调节剂组合下改变 MS 的无机盐浓度为 1/2 和 1/4 水平, 从而可以找到最好的无机盐尝试和最适生长调节剂组合的营养培养基 三. 培养基母液配制为了减少工作量, 减少多次称量所造成的误差, 一般将常用药品配成比所需浓度高 倍的母液, 现以 MS 培养基为例, 预先配制, 四组不同母液, 说明母液的配制方法

14 实验四 MS 培养基母液的配制 一 目的要求通过 MS 培养基母液的配制与保存, 掌握配制与保存 MS 培养基母液的基本技能 二 实验安排分组进行, 每组完成一种母液的配制工作, 共同完成一批母液的配制 三 材料与用具配制 MS 培养基母液所需要的药品 生长调节物质 各类天平 烧杯 定容瓶 量筒 药勺 小玻璃棒 蒸馏水 95% 的酒精或 0.1mol/L 的 NaOH 0.1mol/LHCL 母液瓶 标签 冰箱 四 方法步骤

15 ( 一 )MS 培养基母液配制 ( 单位 : 毫克 mg) 母液 浓缩 母液 配制 1 升培 编 种 成分 规定量 倍数 称取量 体积 养基吸取量 号 类 定容 大 KNO 量 NH 4 NO I 元 MgSO 4 7H 2 O 素 KH 2 PO CaCl 2 2H O MnSO 4 4H 2 O ZnSO 4 7H 2 O II 微 H 3 BO 量 KI 元 Na 2 MoO 4 7H 2 O 素 CuSO 4.5H 2 O CoCL.6H O 铁 Na 2 -EDTA 盐 FeSO 4.4H 2 O 甘氨酸 III 有 盐酸吡哆醇 机 物 盐酸硫铵素 烟酸 肌酸 注意 :1. 大量元素按照使用时浓缩 10 倍的数值称取, 分别将各种化合物称量后, 除 CaCl 2 2H 2 O 单独配制外, 其余化合物混合在 500ml 烧杯中加适量蒸馏水溶解, 用玻璃棒搅拌促溶, 倒入 1000ml 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度, 置小口瓶中保存, 贴上标签注明化合物名称 ( 或编号 ), 浓缩倍数, 配制日期和配制者姓名,CaCl 2 2H 2 O 配制同上置于另一小口瓶中 2. 微量元素母液的配制按要求浓缩 100 倍的数值称取, 分别将各种化合物称量除铁盐 (FeSO 4 7H 2 O 和 Na 2 -EDTA.2H 2 O)

16 作为一组单独配制外, 其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后, 定容在 1000ml 容量瓶中, 置小口瓶中保存, 贴上标签 3. 铁盐配制将 FeSO 4 7H 2 O 和 Na 2 -EDTA.2H 2 O 分别溶于 450ml 蒸馏水中, 加热, 不断搅拌, 溶解后, 两液混合, 调 ph 至 5.5 加水定容至 1000ml, 置于小口瓶中, 贴上标签 4. 有机物母液配制, 按母液要求浓缩 100 倍, 除蔗糖按 3% 单独临时称量外, 其余分别称量后, 溶解, 定容在 500ml 容量瓶中, 置于小口瓶中保存, 贴上标签 5. 母液最好在 2~4 的冰箱中贮存, 特别是有机类物质, 贮存时间不宜过长, 无机盐母液最好在一个月内用完, 如发现有霉菌和沉淀产生, 就不能再使用 6. 制备母液和营养培养基时, 所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求, 化学药品必须是高纯度的 ( 分析纯 ) 7. 称量药物采用高灵敏度的天平, 每种药品专用一药匙 五. 作业 (1) 将本次实验内容整理成实验报告 (2) 能不能把所有的母液置于一个瓶里, 当作一种母液用于配制? 为什么? (3) 在配制大量元素母液时,CaCl 2 为什么要单独配制? (4) 已知大量元素的母液浓度是原配方浓度的 10 倍, 在配制 1000mlMS 培养基时应取多少毫升母液? (5)MS 培养基中需加入 0.5mg/L 的 6-BA, 当母液浓度为 0.1mg/ml 时, 配制 1000ml 培养基需要取多少 ml6-ba 母液?

17 实验五 营养培养基配制和灭菌 一. 营养培养基配制程序 ( 一 ) 母液吸取量的计算 配制培养基的升数公式 1: 母液吸取量 = 母液体积 (CC) 母液浓缩倍数培养基要求的含量公式 2: 母液吸取量 = ( 各种生长调节剂 ) 母液每 CC 的含量 ( 二 ) 各种母液按顺序编号排列 A. 大量元素 ;B.CaCl2 2H2O ; C. 微量元素 ;D. 铁盐 ; E. 有机物 ; F. 生长素萘乙酸 (NAA): 配制 0.5mg/ml 的 NAA 称取 50mg, NAA 用少量 95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至 1000ml;G.. 细胞分裂素 激动素 (KT) 配制 0.5mg/ml 的 KT 称 50mgKT 用少量 1N HCL 溶解后, 加蒸馏水定容至 100ml ( 三 ) 配制培养基 1. 琼脂 : 称取 8g 琼脂, 加入 300ml 蒸馏水, 加热溶解直至完全溶解为止 2. 蔗糖 3%: 称取 30g 蔗糖, 溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中 3. 各种母液的吸取 (1) 用 50ml 量筒量取大量元素母液 (A) 和 CaCl 2 2H 2 O 母液 (B) 各 100ml (2) 分别用 10ml 移液管或吸管吸取微量元素 (C), 铁盐 (D) 母液各 10ml (3) 用 10ml 移液管或吸管吸取有机物 (H)10ml (4) 用 2ml 移液管吸取生长素 NAA1.5ml; 用 0.5ml 移液管吸取 KT0.5ml 将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中, 混合均匀后, 加热至 80 左右, 用酸度计或精密 ph 试纸测定培养基的 ph 一般要求 5.8~6.0, 过酸过碱则用 1N NaoH 和 1N HCl 调整 二. 分装 : 用一个接有胶管的分装器趁热装培养基,1000ml 培养基分装 70 支试管, 即每支试管 15ml 左右 ( 一般占试管 三角瓶容量 1/4~1/3 左右 ) 注 : 培养基勿碰试管壁 三. 包装 : 分装好的试管用棉塞塞上, 包上包装纸, 每 5~7 支试管捆成一扎, 标明培养基代号即可进行灭菌 用具清理和洗涤 : 各种母液按原位置摆整齐, 用过的量筒, 移液管 烧杯 铝锅等用水洗涤干净, 然后按次序放回原处 四. 灭菌 : 固体营养培养基灭菌通常都用热压法, 液体培养基可用热法, 也可用过滤法, 现操作热压法灭菌

18 热压灭菌的锅具有温度范围 115~135, 良好的灭菌取决于时间 压力 温度和被灭菌的容积, 此法优点是 : 迅速 简便 全部微生物和病毒均能被破坏并无吸附现象 缺点 :(1) 会引起 PH 改变 : 降低 0.3~0.5 个单位值 ;(2) 某些化合物会分解或发生化学反应, 在太高温度下热压处理会使糖焦化 这种产物可能有毒 ;(3) 热压灭菌时间太长会使盐沉淀下来 ;(4) 会使琼脂解聚 ;(5) 导致某些有机的生理活性物质的活力下降 因此, 为达到良好的灭菌效果, 而又尽量减少对营养成分的不利影响要求 (1) 盛有 20~50ml 营养培养基的容器就在 121 中保持 20 分钟 ; (2) 盛有 50~500ml 营养培养基的容器就在 121 中保持 25 分钟 ; (3) 盛有 500~5000ml 营养培养基的容器就在 121 中保持 35 分钟 ; 具体操作步骤 : 1. 高压锅放水至平把架 ; 2. 把包扎好的培养基装入高压锅 ; 3. 盖上热压锅盖, 上紧螺帽 ( 注意对角拧紧螺帽 ) 关上气阀和安全阀. 4. 把热压锅放在 3000W 电炉座上, 然后接通电源. 5. 压力计升至 0.5Kg 时, 打开放气阀, 排除冷空气 ( 此步很重要 ) 反复两次至完全把冷空气排除 6. 排除冷空气后, 关闭放气阀, 待压力升到 1Kg 位置时, 开始计算灭菌时间, 一般在 1Kg 压力 (121 ) 下灭菌 20~25 分钟即可, 但要注意保持稳定压力 7. 灭菌时间达到 20 分钟后, 除去电源, 打开放气阀 ( 注意要逐渐放气 ) 待高压锅内的空气完全排除后, 打开热压灭菌锅盖 ( 注意对角扭松螺帽 ) 稍待冷后再把培养基取出 8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长, 应尽早使用, 但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染, 可将培养基置于 25 下保存 4 天, 如果培养基需要贮存较长时间, 可在 4 低温下保存 灭菌高压锅有大型卧式 中型立式 小型手提式等多种型号和规格, 无论哪种型号, 操作的步骤都很相近 进水 放进培养基 盖紧锅盖 关上放汽阀 检查安全阀 接上加热源 待压力升至 0.5Kg 时排锅内冷空气, 重复两次, 直至冷空气排除, 关上放气阀 1Kg 压力 (121 ) 下灭菌 20~25 分钟, 保持稳定压力 除热源 逐渐打开放气阀 锅内空气排除完后 开放锅盖 稍冷后取出培养基 五. 作业 1. 配制培养基 : 1MS+2mg/L 2,4-D +0.8% 琼脂 (PH5.8); 2MS+0.5mg/L 2,4-D +0.5mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8); 3MS+0.5mg/L 2,4-D +1.0mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8); 4MS+2 mg/l 2,4-D+0.5mg/L6-BA +0.8% 琼脂 (PH5.8); 5MS+2mg/L 2,4-D +1.0mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8)

19 外植体的分离 接种和培养 ( 初代培养 ) 植物组织培养的成功首先在于初代培养, 即能否建全起于无菌外植体, 注意几个重要环节 一. 保证无菌主要保证培养材料和培养基的无菌状态培养室的良好的清洁环境, 以及工作人员的无菌操作技术, 材料灭菌, 不同作物, 一株不同部位都有不同的要求, 常用的消毒剂有漂白粉 (1%~10% 的溶液 ), 次氯酸钠液 (0.5~10%) 乌斯普龙溶液 (800~1500 倍 ), 升汞 (HgCl 0.1~1%) 酒精 70%, 双氧水 (3~10%) 等 材料灭菌的方法视不同作物, 不同部位而异 (1) 茎尖 茎段及叶片等的消毒, 因暴露于空气中, 有较多的茸毛 油脂 蜡质和刺等, 首先用自来水较长时间冲洗, 特别多年生木本材料更注意, 有的可用肥皂 洗衣粉或吐温等进行洗涤 酒精浸泡数秒钟 无菌水冲洗 2~3 次 按材料老 嫩用枝条的坚实程度, 分别用 2%~10% 次氯酸钠溶液浸泡 10~15 分钟 无菌水冲洗 3 次 接种 (2) 果实及种子消毒, 果实 : 自来水冲洗 10~20 分钟 纯酒精迅速漂洗一下 2% 次氯酸钠溶液浸泡 10 分钟 无菌水冲洗 2~3 次 取出果内种子或组织进行培养 种子 : 自来水冲洗 10~20 分钟 10% 次氯酸钙浸泡 20~30 分钟甚至几个小时, 依种皮硬而定, 对难于消毒的还可用 0.1% 升汞或 1%~2% 溴水消毒 5 分钟, 进行胚或胚乳培养, 对种皮太硬的种子, 也可预先去掉种皮再用 4~8% 次氯酸钠溶液浸泡 8~10 分钟 无菌水冲洗后 接种 (3) 花药消毒用于培养的花药, 实际上多未成熟, 外有花萼, 花瓣或颖片保护, 处于无菌状态, 所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可, 一般用 70% 酒精浸泡数秒钟 无菌水冲洗 2~3 次 漂白粉清液浸泡 10 分钟 无菌水冲洗 2~3 次 接种 (4) 根及地下部分器官的消毒, 这类材料生长于土中, 消毒较为困难, 先用自来水洗涤, 用软毛刷刷洗 用刀切去损伤及污染严重部位 吸干后 纯酒精漂洗 0.1%~0.2% 升汞浸泡 5~10 分钟或 2% 次氯酸钠溶液浸泡 10~15 分钟 无菌水冲洗 3~4 次 无菌滤纸吸干后 接种 若上述方法仍不见效时, 可将材料浸入消毒液中进行抽气减压帮助消毒液的渗入达到彻底灭菌的目的 二. 条件合适要成功地建立初代培养, 首先一定要选择好合适的作物种类, 品种及培养部位, 目前组织培养已经获得成功的植物, 几乎包括植物的各个部位, 在生产实际中, 必须选取最易表达全能性的部位, 增加成功机会, 降低生产成本, 大多数植物茎尖是较好的部位, 由于其形态已基本建成, 成长迅速 遗传性稳定, 也是获得无病毒的主要途径, 但茎尖往往受到材料来源的限制, 为此茎段也得到了广泛的应用, 而叶片的培养利用更为普遍, 材料来源最为丰富, 一些培养较困难的植物则往往可以通过子叶, 下胚轴培养奏效 花药和花粉培养成为育种和得到无病毒苗的主要途径之一, 其他可根据需要采用根, 花瓣鳞茎等部位培养, 总之, 在确定取材部位时, 一方面要考虑培养材料的来源有保证 容易成苗, 另一方面要考虑到特别是通过脱分化产生愈伤组织培养途径是否会引起不良变异, 丧失原品种的优良性状, 取材亦受季节影响, 器官的生理状态和生育年龄, 材料大小的影响, 茎尖培养存活临界大小应为一个茎尖分生组织带有 1~2 叶原其, 大小为 0.2~0.3mm, 叶片 花瓣等约为 5mm 2, 茎段则长约 0.5mm, 甘蔗心叶愈伤组织中,5mm 左右 ; 第二, 选择好合适的培养基激素及其

20 他添加物 ; 第三, 注意掌握适宜的培养条件, 如光照 温度 湿度 1. 光光因素包括日照长度, 辐射强度, 光源 ( 波长 ) (1) 光照长度 ( 光周期 ) 对此问题了解得很少, 常用的日长即选用 14~16 小时, 虽然也有连续光照的, 不同培养物对日长要求有时很严格, 如需暗萌发的种子要求在连续黑暗中才能萌发, 需光萌发种子必须有光照 有的植物进行休眠或开花, 必须选择特定的日长范围 (2) 辐射强度 培养瓶内的培养物不能采用像田间或人工气候室那么强的光照 (30~70Wm -2 ) 通常用 8~15Wm 的光照 (3) 光源 ( 波长 ) 红光能促进生长和分化 2. 温度培养室内常用温度 24~26,25±2 一般低于 15 培养的组织生长出现停滞, 高于 35 的生长也不利, 促进芽的温度略低于增殖苗的温度一般恒温 3. 湿度 : 培养容器内的相对湿度几乎达到 100%, 而环境中的温度会影响培养基湿度一般要求 70%~80% 的相对湿度 4. 气体的影响 : 试管苗生长和繁殖需氧气, 液体培养需进行振荡或浅层培养以解决供氧问题 三. 技术过关要建立初代培养, 操作技术亦十分重要, 无菌操作快, 动作熟练, 缩短可能污染的时间

21 实验六 幼叶培养 一. 目的要求很多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤组织, 然后通过愈伤组织再分化出胚状体 茎 叶和根 叶的培养比胚 茎尖和茎段培养难度大 选择易培养成功的叶组织, 比如幼叶 通过本次实验, 要求学生学习幼叶培养的基本方法和步骤, 掌握幼叶的剪切和排放放方法, 进一步掌握无菌操作技术 二 实验安排分组提前准备好培养基, 接种单独完成 三 材料 仪器与试剂 1. 光照培养箱 超净工作台 培养皿 镊子 剪刀 解剖刀等 2. 愈伤诱导培养基 : 1MS+2mg/L 2,4-D +0.8% 琼脂 (PH5.8); 2MS+0.5mg/L 2,4-D +0.5mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8); 3MS+0.5mg/L 2,4-D +1.0mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8); 4MS+2 mg/l 2,4-D+0.5mg/L6-BA +0.8% 琼脂 (PH5.8); 5MS+2mg/L 2,4-D +1.0mg/L6-BA+0.8% 琼脂 (PH5.8) 分五组进行实验, 每组选用不同组分的愈伤诱导培养基进行实验, 观察哪组培养基诱导愈伤的效果最好 四 方法步骤 1. 接种前半小时, 可用 75% 酒精或新洁尔灭喷洒, 地板用湿拖把拖刷 超净工作台在接种前用 95% 酒精揩抹工作台面和有关用具, 并先开机鼓风 15 分钟后才能使用 2. 外植体的选择 分离 : 1. 选择无病害的植物叶片 ( 可选择不同种植物叶片 ) 2. 用单面刀片或剪刀, 解剖刀把叶片从植株上剥离下来, 剪成小段置于烧杯中 3. 外植体的灭菌在超净工作台上将 70% 酒精倒入装有叶片的烧杯内消毒 30s, 然后将 10% 次氯酸钠溶液倒入烧杯内灭菌 10 分钟, 用无菌水将叶片冲洗三至四次 4. 外植体的接种与培养用经过灭菌的剪刀将叶片剪成 0.5-1cm 2 大小的小块置于经过灭菌的培养皿中, 打开培养瓶盖子 ( 或试管塞子 ) 用经过灭菌的镊子将外植体置于培养容器内, 让外植体与培养基紧密接触, 然后盖上盖子并拧紧 ( 或塞上塞子 ) 写上接种日期和外植体名称即转入培养室内培养, 室内温度 25~30, 光

22 强为 1000~2000LUX, 每天光照约 14 小时 约一周后观察愈伤诱导情况 无菌操作 : 1. 在准备室内改穿经过灭菌的白色工作服及拖鞋, 戴上白布帽和口罩, 才能进入无菌室 2. 进入无菌室前工作人员双手须用肥皂洗净, 进行操作前用 75%C2H5OH 擦抹双手 3. 操作时, 注意 : (1) 若是试管, 应在酒精灯火焰上封口, 接种迅速避免烧伤材料, 若是培养瓶, 拧开盖子, 迅速将材料放入 (2) 每接一瓶, 用具都应用 95% 或无水酒精棉球擦并在火焰上烧灼, 避免交叉污染 (3) 操作结束, 整理, 清洁干净用具 五 作业 1 将本次实验写成实验报告 2 实验中, 选用不同的愈伤诱导培养基, 形成的愈伤组织有什么不同? 哪种诱导培养基对诱导烟草愈伤组织最为有效? 3 植物激素对诱导植物愈伤组织有何种影响?

23 实验七 种子培养 一. 目的要求种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的为成熟种子的无菌培养 利用种子培养可以打破种子休眠, 特别对一些休眠期长的植物, 可以作为大量生产试管苗的好材料 ; 可使远缘杂交产生的杂种败育种子, 正常萌发产生第二代植株 通过本次实验, 要求学生学习种子培养的基本方法和步骤, 掌握种子的消毒灭菌和培养方法 二 实验安排分组提前准备好培养基, 接种单独完成 三 材料 仪器与试剂 1 光照培养箱 超净工作台 2. 三角瓶 培养瓶 镊子 封口塑料 皮筋等 3. 1/2MS 或 MS 固体培养基 70% 酒精 15% 的 84 消毒液 0.1% 的 Tween 无菌水等四 方法步骤 1. 选取饱满完好的植物种子 ; 以下步骤均在超净工作台上进行 2. 将选好的植物种子放入 100mL 的三角瓶中, 加入 70% 的酒精浸泡不超过 1min ; 3. 沥去酒精后, 加入 15% 的 84 消毒液 +0.1%Tween 消毒 10 分钟 ( 因品种而异, 一般在 8-15min); 4. 沥去消毒液后, 用无菌水冲洗 3~4 次 5. 沥干水份, 将种子均匀植入 1/2MS 固体培养基中,24, 光强 1500lx, 光照 16h/d 五 作业 1. 将本次实验整理成实验报告 2. 取种子进行组织培养有什么好处? 3. 在种子培养的无菌操作过程中需要注意哪些?

24 实验八 茎段培养 一 目的要求无性繁殖植物常采用扦插法, 由于枝条有限, 短期内难以繁殖出大量苗木, 而用组织培养快速繁殖是一个理想的方法 在植物快速繁殖过程中, 常采用带节间的茎段作为外植体, 通过腋芽萌发获得小植株 通过本次实验, 要求学生学习茎段培养的基本方法和步骤, 掌握茎段的剪切和插放方法, 进一步掌握无菌操作技术 二 实验安排分组提前准备好培养基, 接种单独完成 三 材料 仪器与试剂 1. 材料 : 菊花嫩枝或月季嫩枝 2. 仪器 : 超净工作台 灭菌锅 显微镜 剪刀 长镊子 烧杯 (500ml) 培养皿 移液管等 3. 试剂 : 配制好的 MS 培养基各种母液 1mol/L 的 NaOH 1mol/LHCL 0.1% 的升汞 1 MS+0.2mg/LNAA + 0.8% 琼脂 (PH5.8); 2 MS+0.2mg/LNAA mg/l6-ba+ 0.8% 琼脂 (PH5.8); 3 MS+0.2mg/LNAA +0.5 mg/l6-ba+ 0.8% 琼脂 (PH5.8); 4 MS+0.2mg/LNAA +1 mg/l6-ba+ 0.8% 琼脂 (PH5.8); 5 MS+0.2mg/LNAA +1.5 mg/l6-ba+ 0.8% 琼脂 (PH5.8) 四 方法步骤 1. 材料的选择 ; 选用的枝条要求表面光滑 无病虫害 2. 培养步骤 : (1) 材料的灭菌 : 选取长约 10 厘米的菊花嫩枝或月季嫩枝于 0.1% 的升汞溶液中表面消毒 15 分钟, 然后用无菌水冲洗 3 次 (2) 用剪刀将灭菌后的枝条剪成 厘米长 带一个芽的小段 打开培养容器盖子, 将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基, 盖好培养容器盖子, 置于超净台上适当位置 对接种用具 超净台面 操作者手等进行适当灭菌处理, 继续接种 如此操作, 直至完成 (3) 培养条件 : 培养物置于 25 C 左右的培养室中, 每天光照 12 小时, 光照度为 lx 五 作业 1 将本次实验整理成实验报告, 2 进行试验结果的观测 比较 记录和分析

25 实验九根的离体培养 一 目的要求胡萝卜是细胞和组织培养中常用的经典材料, 是教学实验的良好材料 通过本实训, 要求学生熟悉胡萝卜离体根培养的基本方法和步骤, 掌握愈伤组织诱导的基本技能 二 实验安排分组提前做好培养基, 接种单独完成 三 材料 仪器与试剂 1. 材料 : 大而新鲜的胡萝卜 2. 仪器 : 超净工作台 灭菌锅 显微镜 解剖刀 刮皮刀 不锈钢打孔器 长镊子 烧杯 (500ml) 培养皿 移液管等 3. 试剂 : 培养基 (MS+10mg/L2,4-D+2mg/L6-BA) 70% 乙醇 2% 的次氯酸钠溶液四 方法步骤 1. 将胡萝卜用自来水冲洗干净, 用刮皮刀除去表皮 1-2mm, 横切成大约 10mm 厚的切片 以下步骤均在无菌条件下进行 2. 胡萝卜片经 70% 乙醇处理 30 秒钟后, 用无菌水冲洗一遍, 再用 2% 的次氯酸钠溶液浸泡 10 分钟, 无菌水冲洗 3~4 次 3. 将胡萝卜片放入培养皿中, 一手用镊子固定胡萝卜片, 一手用打孔器垂直打孔, 每个小孔打在靠近维管形成层的区域, 务必打穿组织 然后从组织片中抽出打孔器, 将胡萝卜组织片收集在装有无菌水的培养皿 重复打孔步骤, 直至收集到足够数量的组织圆片 4. 用镊子取出组织圆片, 放入培养皿中, 用刀片将组织圆片切成 2mm 长的小块, 放入装有无菌水的培养皿中 在整个操作过程中镊子和解剖刀要多次火焰消毒, 冷却后再使用 5 将胡萝卜组织小块放到灭过菌的滤纸上, 吸干水分后接种到培养基表面 注意接种时培养瓶要有一定倾斜度, 接种过程中镊子不要直接在培养基上方完成, 以减少污染机会 6 将培养物一部分置于 25 C 温箱中暗培养, 另一部分到光照培养室中进行培养, 以比较光照和暗培养对愈伤组织诱导的反映 五 作业 1 结果及观察: 培养约一周后, 外植体表面开始变得粗糙, 有许多光亮点出现, 这是愈伤组织开始形成的症状 2 将本次实验内容写成实验报告

26 继代培养 通过外植体进行初代培养, 能否不断增殖并进行继代, 既是植物组织培养能否成功实际应用的关键, 又是植物离体快速繁殖中第二个阶段的目的, 也是最为重要的一个问题 外植体的细胞经过启动, 分裂和分化等一系列深刻变化过程, 形成了无序结构的愈伤组织块, 它们若在原培养基上继续培养, 由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累会导致愈伤组织块停止生长, 直至老化变黑死亡, 因此, 若是要求愈伤组织继续生长增殖, 必须定期地 ( 如 2~4 周 ) 将它们分成小块接种到新鲜的培养基上 ( 培养基配方同原培养基 ) 继代培养, 愈伤组织仍可保持旺盛生长, 若每 8~10 天继代一次, 还可获得胚性愈伤组织细胞团, 在切口处产生黄色或乳黄色的愈伤组织, 表面呈颗粒状突起,30 天左右颗粒状突起出现大量球形 棒状的胚状体细胞团, 同样, 可以用分割方法进行反复继代培养 愈伤组织的质地有明显差异, 有的很松脆, 有的很坚实, 两种愈伤组织可以互相转变 ; 加入高浓度生长素可使坚实的愈伤组织变松脆, 反之, 降低或除去生长素, 松脆愈伤组织可以转变为坚实型 松脆的愈伤组织有大量的分生组织中心能进行活跃的细胞分裂 ; 坚实的愈伤组织很少分化, 大都是高度液泡化的细胞, 松脆的愈伤组织是进行悬浮培养的最适材料, 稍经机械振荡, 便可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团 愈伤组织长期继代培养往往容易引起其细胞的染色体变化, 如出现多倍体, 非整倍体 染色体丢失 染色体断裂或重组, 随继代培养次数和时间的增加, 愈伤组织的此种变化频率也随之增加, 这对保持供体植物的遗传性很不利, 继代增殖的代数视不同作物不一样, 一般能达到继代增殖 2~10 倍, 即可用于大量繁殖, 不要盲目追求过高增殖倍数, 甘蔗不超过 10 代, 香蕉芽不能超过 12 代 一个芽繁殖不能超过 2.5 倍 一. 继代培养方法继代培养可以固体和液体培养两种方法 : 1. 固体培养 : 多数继代方法都用固体培养, 将愈伤组织分割成小块或进行分株 分割 剪截 ( 剪成单芽茎段 ) 并转接于新鲜培养基上 2. 液体培养 : 以原球茎或胚状体方式增殖, 可用液体培养进行继代培养, 进行振荡培养 ( 用旋转 振荡培养 ), 保持 22 恒温, 连续光照 二. 继代培养基大多数继代培养基与原诱导培养基相同 ( 如 : 甘蔗 香蕉 ) 但也有认为改变培养基的培养条件来保持继代培养, 有的加活性炭, 有的从 MS 培养基转入降低氨态 N 和钙, 增加硝态 N Mg P 的培养基中, 有的认为在继代培养基中用 KT 优于 ZIP, 认为可使用较弱的细胞分裂素

27 实验十 烟草愈伤组织, 胚状体继代培养 烟草嫩叶接种在诱导培养基上一周后便逐渐形成愈伤组织, 为保持愈伤组织的旺盛生长, 一般约 3~4 周将愈伤组织进行继代培养, 继代培养控制在 10 代左右方法 : 1. 在无菌条件下, 用无菌的镊子 ( 或接种针 ) 从培养瓶中取出愈伤组织, 将它们放在无菌的培养皿中 2. 用无菌解剖刀把每块愈伤组织分割成若干小块 ( 一般不小于 5mm 5mm) 并把已坏死的区域弃去 3. 用无菌镊子将小块愈伤组织放入新鲜的培养基上, 每瓶 ( 或管培养基可以放 3~5 块, 盖上盖子 )( 或塞上塞子 ) 后置于培养室中继代培养烟草细胞胚状体的发生, 有 2 种途径 : 一是直接由烟草嫩叶 ( 或芽 ) 的愈伤组织产生, 烟草嫩叶离体培养 10~15 天, 可看到蔗叶边缘愈伤组织上长出松散的 黄白的颗粒的胚性细胞团, 并可在原培养基上下经转移直接发育成小植株 ; 二是通过愈伤组织挑选胚状体细胞团从中筛选胚性细胞无性系, 在继代繁殖培养中产生大量的胚状体, 前者产生胚状体频率低, 后者产生胚状体的频率高 采用固体培养或液体培养培养基 :MS+NAA 1-4mg/L +KT 1. 3mg/L + 蔗糖 3%+ 琼脂 0.8%( 液体不加 )PH5.8~6.0 都可育出胚性细胞无性系 经验证明 : 新 分离的愈伤组织往往具有较强的再生能力 但经过多次继代后, 形成器官的能力会逐渐降低, 以至最后消失, 烟草愈伤组织继代培养中和愈伤组织转到分化培养基中, 都可获得生活力强的胚性细胞团, 而以愈伤组织的继代增殖的数量大, 因愈伤组织转化培养的过程中一面在分化绿苗, 一面在增殖胚性细胞团, 影响增殖数量, 但两者都可用于继代培养, 即一种是连续继代培养, 不转到分化培养基中, 等胚性细胞团增殖到一定数量, 然后一齐转到分化培养基中培养, 可以一定时间内获得大量的绿苗, 另一种是边分化边继代, 当转到培养基后, 先分化的先出苗, 后分化的后出苗, 每隔 27~56 天继代一次, 每次扩大 15~20 倍, 在每次继代培养或边继代边分化的培养过程中都要选择松散的 颗粒的 鲜明黄白 生活力强的优质胚性细胞团培养, 对那些半透明 半颗状或老化变黑的愈伤组织转去分化培养, 不予继代培养, 一般继代 3~5 次便可, 如发现有衰退现象自然不应继代培养下去 分化成苗培养 从外植体形成器官或细胞无性系的形态发生, 有两种方法, 一种是不定芽方式, 指细胞或愈伤组织培养物, 通过形成不定芽再生成植株这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式, 有三个不同生长阶段 第一阶段, 细胞和离休外植体脱分化形成愈伤组织 ; 第二阶段, 愈伤组织中形成一些

28 分生细胞, 继而形成植株结构 ; 第三阶段是器官原基的形成 器官原基是由一个或一小团分生细胞分裂而形成的, 这些分生组织块只有在一定条件下, 逐渐能见到构成器官的纵轴上表现出单向极性, 从而分化出芽和根, 另一种是胚状体方式, 指由培养细胞或组织诱导分化出具胚芽和胚根的胚状体结构 ( 胚状体 ) 进而发育成完整植株 影响愈伤组织分化成器官要在一定合适的条件下才能实现, 这些条件中, 培养的生长调节剂种类及浓度和营养成分等具有重要作用, 其他如光照 温度 PH 等也有一定关系 试验证明形成器官的类型受培养中两种激素的相对浓度的控制, 较高浓度的 KT( 细胞分裂素 ) 则促进芽的形成而抵制根的形成, 反之, 较高浓度的生长素有利于根的形成而抵制芽的形成,6-BA ZT( 玉米素 ) 和 Zip(N- 异戊烯氨基嘌呤 ) 等具有与 KT 相同的作用, 而且效力更大, 并被广泛应用, 试验发现激动素 (KT) 促进芽的发生, 并非浓度越高越好, 而是有一合适的范围, 在有较高浓度的 IAA 和 IBA 好, 但用 IAA 和 IBA 处理, 产生的根比较健壮, 而用 NAA 的产生的根较纤细,2,4-D 往往对生根不利, 特别是在较高的浓度下,KT 玉米素 (ZT) 和 BA 均能促进芽的形成, 其中 BA 的效果最好, 玉米素的作用范围较窄, 通常都采用 BA 和 KT 来诱导芽的发生 诱导愈伤组织形成的生长素水平往往对愈伤组织的器官发生也有影响, 如高浓度 2,4-D 或其他生长素诱导的愈伤组织, 通常结构疏松, 器官发生能力较差, 如果在诱导愈伤组织形成时, 加入适量细胞分裂素, 对其器官发生的状况, 便会有所改善, 近来, 在愈伤组织器官发生中, 已开始较多的使用 ABA( 脱落酸 ) GA 3 ( 亦霉素 ),ABA 对芽分化有促进作用已得到广泛的实验证明,GA 3 对芽的发生并未见有直接促进作用的报道, 但对芽的生长有良好作用 诱导生根对培养基中无机离子浓度的要求低一些, 故常用 White 二分之一 MS 培养基, 同时有的情况下对某些离子的形式也有不同要求, 如对氮的要求, 有的植物要求硝态氮, 而有的植物则提供氨态氮为佳 此外, 某些微量元素对器官分化有明显影响, 如 Fe 对烟草花药培养对其胚状体的形成, 有良好作用, 其它元素如 Zn Mn 等均不能代替 Fe 的作用 培养基中通常有机物有足够的糖 硫胺素 吡哆醇 烟酸 肌醇 甘氨酸等, 可以满足愈伤组织的生长和分化的要求 ; 此外, 还可以加入适量的其他成分, 如某些氨基酸, 嘌呤和嘧啶等类物质, 对器官分化有促进作用 糖的种类和浓度对培养组织的增殖及以后的器官分化均有明显的影响, 它不仅是碳源和能源, 而且也是培养基的渗透势调节剂, 通常在培养基中加 2~3% 的蔗糖可满足需要 在培养基中添加一些天然的植物提取液, 如椰子汁 麦芽汁 酵母提取物, 番茄果汁 荸荠汁 马铃薯块茎提取液, 幼嫩玉米汁等对器官分化常有良好效果 其中最常用的是椰子乳汁 (CM), 这些汁液最主要作用是提供了一些生理活性物质, 其次是补充了一些未知的微量成分 通常对于组织培养中器官发生并不需要很强的光照, 花药培养中大量实践证明了这一点, 各种植物的组织培养的器官发生不需要光, 但在组织培养过程中进行分化培养时, 通常都是在一定光照下进行的, 因为它至少对绿苗的形成 根的发生 枝的分化和胚状体的形成有促进作用, 特别是芽发生后, 应给予适当光照, 但光 ( 尤其是较强的光 ) 对根的发生以后生长, 往往有一定的抵制作用,

29 故通常在生根培养基中添加适量的活性炭, 对培养容器的基部盖以黑纸 光照长度对具有敏感的光周期反应的植物的组织培养物的器官发生有明显的影响 温度一般均用 恒温条件, 培养室的温度最好能保持一定的昼夜温差, 白天高, 夜晚低, 这对器官发生和生长均有利 在组织培养中, 必须及时转移已形成的较幼嫩的生长旺盛的愈伤组织至分化培养基上, 可大大提高苗的分化频率 愈伤组织的继代次数对器官分化影响很大, 特别是一些禾谷类作物, 苗的分化频率随愈伤组织的继代次数而逐渐下降 培养物的生根培养 植物离休培养物 ( 无菌试管苗 ) 根的发生都来自不定根, 根的形成从形态上分两个阶段即根原基形成和根原基的伸长和生长, 影响植物离体培养生根的因素很多 有离体材料自身的生理生化状态, 也有外部的条件因素 一般木本植物比草本植物难, 成年树比幼年树难, 乔木比灌木难, 外部因素 :(1) 基本培养基 : 大多数使用低浓度的 MS 培养基, 其中使用 1/2MS 或 1/3MS 培养基, 降低无机盐浓度有利于生根, 加铁盐则更好, 微量元素中以 B Fe 对生根有利, 糖的浓度通常采用低浓度一般在 1%-3%;(2) 植物激素 : 采用单一种生长素的占 51.5%, 生长素加激动素占 20.1%, 愈伤组织分化根时, 使用 NAA 最多浓度为在 0.02-o.6mg/L 为多, 使用 IAA+KT 的浓度范围为 和 0.01mg/L 而以 1-4 和 mg/L 居多数, 而要胚轴 茎段插枝等材料分化根时使用 IBA 居首位, 浓度为 mg/L 以 1mg/L 为多, 可见生根培养多数使用生长素, 大都以 IBA IAA NAA 单独用或配合使用或与低浓度 KT 配合使用,NAA 与细胞分裂素配合时摩尔比在 20-30:1 为好 不定根形成, 其中激素起决定性作用, 生长素却能促进生根, 一般赤霉素 细胞分裂素 乙烯通常利于生根, 如与生长素配合, 一般其浓度均低于生长素浓度, 脱落酸 (ABA) 可能有助于生根 近年来为促进试管苗的生根, 改变了通常将激素预先添加在培养基中的做法, 而是将需生根材料在一定浓度激素中浸泡或培养一定时间, 然后转入无激素培养基中培养, 能显著提高生根率, 如苹果新梢预先在 IAA 溶液中浸泡 1 小时, 这样比预先加到培养基中效果好 组培苗的移栽驯化 组织培养中培育出来的苗通常称为组培苗或试管苗 由于试管苗是在无菌 有营养供给 适宜光照和温度近 100% 的相对湿度环境条件下生长的, 因此, 在生理 形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异 所以必须通过炼苗, 例如通过控水 减肥 增光 降温等措施, 使它们逐渐地适应外界环境, 从而使生理 形态 组织上发生相应的变化, 使之更适合于自然环境, 只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功 1. 准备工作 (1) 选择育苗容器组培苗移栽驯化一般用穴盘, 经济实惠

30 原苗移栽可选穴格 穴容稍大的, 插扦苗可选二者较小的 以节省空间, 降低生产成本 (2) 基质选配基质选配有其固定原则 基质的作用是固定幼苗, 吸附营养液 改善根际透气性 组培苗的移栽一般用土栽培, 为提高空间利用率选用穴盘的格小, 容纳的营养介质少, 因而对介质的要求高 要求基质保肥, 吸水力强, 透气性好, 不易分解, 支撑性好 采用泥炭 珍珠岩 蛭石 沙及少量有机质 复合肥混合调配为好 (3) 场地 工具及基质灭菌 装盘移栽场地及所有工具必须用灭菌药水清洗 (10% 的漂白粉溶液, 或 800 倍的高锰酸钾液泡 10-15min) 基质要先充分混匀, 用 1000 倍液百菌清喷雾, 搅拌 如果基质内含土壤, 消毒更应严格 (4) 营养液配制 1 营养液主要成分 植物生长发育需要的大量元素有碳 氢 氧 氮 磷 钾 钙 镁 硫 微量元素有铁 氯 锰 硼 锌 铜和钼 2 常用的盐类的来源 配制营养液常用的盐类是由工厂提供的工业化合物 微量元素用量少, 也可用化学药品代替 如 : 氮肥 : 硝酸钙 硝酸钾 磷酸二氢铵 硝酸铵 尿素 氮磷钾三元复合肥 磷肥 : 磷酸二氢钾 硫酸钾 氯化钾 氮磷钾三元复合肥 钙肥 : 硝酸钙 硫酸钙 过磷酸钙 石膏 2. 组培苗移栽 (1) 自然适应组培苗由试管内条件转入温室, 暴露于空气中, 环境落差大, 需逐步适应 一般要求从培养室内将培养瓶拿到室温下先放置 2 周左右, 再打开瓶盖, 置架上 4-12h (2) 起苗 洗苗 分级将苗瓶置水中, 用小竹签伸入瓶中轻轻将苗带出, 尽量不要伤及根和嫩芽, 置水中漂洗, 将基部培养基全部冼净 将苗分为有根苗和无根苗两类 (3) 移栽拿起苗, 用手指在基质上插洞, 将苗根部轻轻植入洞内, 撒上营养土, 将苗盘轻放入洇苗池中, 待水漫漫上洇 洇透后, 将盘放在传送带上, 送入缓苗室 无根苗需光蘸生根液再行移植 若用栽苗机应按规定操作 3. 组培苗扦插 (1) 为加快繁殖, 提高繁殖系数, 还可将组培苗切段扦插繁殖 a. 自然适应组培苗由试管内条件转入温室, 暴露于空气中, 环境落差大, 需逐步适应 将瓶苗转入温室, 一般要求从培养室内将培养瓶拿到室温下先放置 2 周左右, 再打开瓶盖, 置架上 4-12h b. 洗苗洗净的小苗每叶节切一段, 基部向下扦插在洇足水的沙盘中 如果苗不易生根, 可先蘸生根粉, 再扦插 c. 移栽同试管苗移栽 4. 幼苗驯化管理组培苗移栽后送入驯化室, 驯化室一般为防虫温室 移栽后 1-2 周为关键管理阶段, 主要是光照 水分 通风 透气等方面 本阶段需弱光 适当低温和较高的空气相对湿度 高温季节简易温室气温回升快, 应加强通风

31 透气, 进行人工喷雾 本阶段可适施薄肥, 结合喷水喷施 3-5 倍 MS 大量元素液 一周后每隔 3 天叶面喷施营养液一次 由于空气湿度低, 气温低, 幼苗易感染立枯病. 猝倒病 枯叶病, 造成死亡, 因此要及时喷药, 防冶病虫害 5. 组培苗驯化 (1) 适宜的基质不同栽培基质对组培苗移栽成活率有显著影响 (2) 苗的生理状况影响试管苗移载成活率高低 (3) 温 湿度影响移载成活率组培苗比较纤弱, 适应能力差, 需经过逐渐地气候适应驯化 高温季节应注意遮阳 保温 通风透气, 并经常进行人工喷雾 温度以 l8-20, 空气相对湿度保持在 70 %-85% 为宜 6. 绿化 炼苗温室组培苗移栽成活 1-6 周后, 可逐渐移至遮阳大棚下进行 绿化 炼苗 本阶段特点是幼苗由驯化 缓苗期进入正常的生长 根系刚恢复生长, 幼叶长大, 嫩芽抽梢, 肥水管理非常重要 7. 成苗管理苗床温 湿度要适宜, 促 控结合, 使苗木即不徒长, 又不老化 同时, 还需根据气象预报, 注意防寒 通风换气, 确保苗木的正常生长发育

32 实验十一 番茄离体再生体系的建立 一 实验目的学习利用番茄子叶柄 下胚轴进行番茄离体培养的方法 二 实验安排分组提前做好培养基, 接种单独完成 三 材料 仪器与试剂 1. 光照培养箱 超净工作台 高压灭菌锅 2. 培养皿 三角瓶 培养瓶 镊子 剪刀 解剖刀等 3. 70% 酒精 10% 的 84 消毒液 无菌水 6-BA IAA 等四 方法步骤 ( 一 ) 番茄种子的灭菌采用了两大类共三种方法对番茄种子进行灭菌, 一类直接进行灭菌处理, 另一类先做预处理 方法如下 : 1 将番茄种子在 70% 的乙醇溶液中浸泡 30~60s, 再用 10% 的 84 溶液浸泡 10~15min, 最后用无菌水润洗 3 次 2 番茄种子用自来水冲洗 30min, 再用蒸馏水冲洗 3 遍, 然后按照 1 的方法处理 3 番茄种子用 55 温水浸泡 15min, 降至室温浸泡 12h, 然后按照 1 的方法处理 番茄种子灭菌处理完后接种于 MS 培养基上 ( 方法同油菜种子接种方法 ), 置于光照培养箱内先暗培养三天, 按如前述的培养条件进行培养, 观察发芽情况 自种子发芽开始计算苗龄 比较上述三种方法的灭菌效果 ( 二 ) 外植体的获得子叶外植体的获得 : 取一定苗龄的幼苗, 将子叶切下, 去除叶尖和叶缘, 竖切使暴露的切口尽量长且平整, 切成 cm 和 1 1cm 左右的叶块, 作为对比, 研究子叶外植体大小对建立番茄高效离体培养体系的影响 下胚轴外植体的获得 : 取一定苗龄的幼苗, 取其下胚轴切成 0.5cm 的小段 ( 三 ) 外植体不定芽分化的诱导取番茄子叶外植体 下胚轴外植体接种于附加了不同浓度的 6-BA 的 MS 培养基上 子叶外植体每皿接种 20 块左右, 下胚轴外植体每皿接种 20 段左右 每个处理重复两次 天后进行观察统计 比较不同的培养基的激素配比对番茄外植体不定芽分化率的影响 具体培养基配方为 : a: MS+1.0mg/L6-BA;

33 b: MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA; c: MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIAA; d: MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+1mg/LAgNO 3 ; e: MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+3mg/LAgNO 3 ; ( 四 ) 不定芽诱导生根将番茄的子叶 下胚轴外植体诱导形成的芽当其芽高 3~4 厘米, 带有 2~3 个叶片, 生长健壮的不定芽从外植体上切下, 切取的芽段要大于 0.5 cm, 接种到含有不同 IAA 浓度的 MS 培养基中,10 天后观察不定根生长情况 比较不同的培养基的激素配比对诱导番茄外植体不定芽生根的影响 具体培养基配方如下 : a: MS+0.2mg/LIAA; b: MS+0.5mg/LIAA; c: MS+0.2mg/LIAA+0.6mg/L6-BA; 五. 作业 1 观察统计实验结果, 整理实验报告