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1 第十九章细胞工程 生物工程 : 通过技术手段, 利用生物体或生 物过程生产有经济价值的产品的学科

2 1. 细胞培养 1962 年开始, 用于生物医学研究, 生产酶制剂, 生长因子, 疫苗, 单抗等 2. 细胞融合 3. 细胞拆合 细胞工程的主要技术领域 : 4. 哺乳动物胚胎培养和胚胎移植 5. 转基因技术 : 转基因动物 ; 转基因植物 6. 哺乳动物克隆技术 : 动物克隆 ; 细胞克隆

3 1. 细胞培养 植物细胞培养植物组织与细胞培养 原生质体培养 无性繁殖 消除病害 种质保存 合成次生代谢物 动物细胞培养 血清 无血清

4 Vero 细胞和狂犬病毒的培养工艺 加碱 ( 碳酸氢钠 ) DMEM 培养基 胎牛血清 加糖 ( 葡萄糖 ) 灌注培养液 50L 生 接种狂犬病毒 其他成分 微载体 物反应 出液口 锥形瓶逐级放大培养 5L 种子罐培养 器 收获病毒 培养液

5 2. 细胞融合 两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的过程 单克隆抗体 融合 :B 淋巴细胞 + 骨髓瘤细胞 筛选 :HAT 选择培养液,HGPRT- TK- 骨髓瘤细胞株

6 单克隆抗体 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合, 成功建立了单克隆抗 体技术, 而获得 1984 年诺贝尔医学和生理学奖 每个 B 淋巴细胞仅专一地产生 分泌一种针对某 种抗原决定簇的特异性抗体, 而肿瘤细胞可以无限 增殖, 因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量单克隆抗体 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗 原分子大量制备纯一的单克隆抗体

7 杂生单交瘤细胞产克隆抗体示意图

8 HAT 系次黄嘌呤 (hypoxantin) 氨基蝶呤 (aminopterin) 和胸腺嘧啶脱氧核苷 (thymidin) 三种物质各英文首字之缀列, HAT 培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基

9 3. 细胞拆合 细胞拆合 : 把细胞核与细胞质分离开来, 然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合, 形成核质杂交细胞 方法 : (1) 物理法 : 微玻璃针 紫外线 激光 (2) 化学法 : 细胞松弛素 B 处理, 并结合离心技术, 将细胞拆分为核体 (karyoplast) 或称小细胞 (minicell) 和胞质体 (cytoplast)

10 4. 哺乳动物胚胎培养和胚胎移植 (1) 胚胎培养 体外受精 (2) 胚胎移植 (3) 嵌合体 (4) 胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ES 细胞 ) 早期胚胎内细胞团分离来的, 能在体外培养的一种高度未分化的全能或多能细胞 ES 细胞的特点 :A: 具有全能性或多能性 ;B: 可在体外扩增 进行遗传操作, 而不失去其全能性 C: 在条件培养基或饲养层细胞上, 才处于未分化状态 ES 细胞的主要应用 :A: 制作转基因动物 B: 基因打靶或称基因敲除 C: 克隆细胞和组织

11 干细胞工程 干细胞定义 现在发现哺乳动物的许多已分化组织和器官中都保留了一些能够分裂形成该组织或器官的未分化原始细胞, 这些细胞称为干细胞 干细胞形态特征 : 圆形, 椭圆型, 体积小, 核质比大, 具有较强的端粒酶活性, 因此具有较强增殖能力

12 干细胞增殖特性 缓慢性, 自稳性 干细胞分类 人体干细胞基本分为三种类型 : 全能干细胞 多能干细胞和专能干细胞

13 干细胞分化模式 胚胎干细胞 (embryo stem cell): 具有分化成多种细胞类型及构建组织的潜能 造血干细胞 单能干细胞 (monopotential cell)

14 体内干细胞的意义在于源源不断地补充体内一些短命组织的细胞来源, 如血液细胞 皮肤细胞以及精巢等, 或者组织或器官受到局部损伤时, 它们可以再分裂形成新的该组织和器官, 是体内的一种自我修复机制 人类干细胞工程就是利用人体内干细胞的特征来达到体外产生人类所需的产物的探索 主要用于器官修复, 基因治疗等

15 5. 转基因技术 转基因动物 转基因植物

16 6. 哺乳动物克隆技术 克隆动物在畜牧业和医学方面的应用 :(1) 良种家蓄的培育 ; (2) 研究药理的实验动物 ; (3) 保护濒危动物 ; (4) 提供治疗疾病的组织器官 ; (5) 与转基因动物技术结合, 提高转基因动物的生产效率

17 动物克隆 生物繁殖后代通常是以精 卵细胞结合的有性生殖方式进行 通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性繁殖 克隆是指离体条件下的无性繁殖 1981 年 Illmenses 率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠 随后, 1984 年 Willadsen 用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊 英国 PPI 生物技术的罗斯林 (Roslin) 研究所的维尔穆特 (Wilmut) 博士 1997 年 2 月 27 日在世界著名权威杂志 Nature 宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊 多莉 (Dolly) 的消息 多莉 的诞生, 既说明了体细胞核的遗传全能性, 也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章 此项技术因而荣登美国 Science 周刊评出的 1997 年十大科学发现的榜首

18 绵羊 A 取出 绵羊 B 未受精卵 去核 乳腺细胞核植入易核卵电激融合卵 克隆多莉羊 体外胚胎发育植入 示意 绵羊 C 子宫 图 生产 多莉

19 多莉 克隆猴

20 克隆技术将对 21 世纪产生的重大影响 (1) 遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物 ( 人 ) 生长 发育 衰老和健康等机理的研究 ; (2) 有利于大量培养品质优良的家畜 ; (3) 经转基因的克隆哺乳动物, 将能为人类提供源源不断的廉价的药品 保健品以及较易被人体接受的移植器官 ; (4) 科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆, 即借腹怀胎的新领域, 这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作

21 植物细胞工程

22 植物细胞工程, 就是进行物种改良, 选育优良作物品种, 增加植物的优良性状, 利用植物生产各种化学制品, 还可用于保留濒危灭绝和有重要经济价值的植物物种

23 植物细胞工程技术 : 一 快速繁殖技术通过植物体细胞胚胎再生成一完整植株 这种技术主要用于花卉 树木 蔬菜 果树 中草药和农作物的快速繁殖 二 诱导增加或减少植物体内染色体组数的技术有些植株的染色体比正常细胞少一半 ( 单倍体 ), 而有些经诱导后染色体加倍 ( 多倍体 ) 单倍体对植物品种的改良很有利 ; 多倍体产量高, 为不同倍性植物间的杂交提供了遗传保证 三 体细胞杂交技术利用自然或人工方法使两个工几个不同细胞融合成一个细胞, 形成体细胞杂种 四 植物细胞应用生产技术利用植物细胞培养技术, 给植物细胞提供最适宜的生活环境, 让它们进行无性繁殖, 大量地培养成植株, 解决天然资源的不足

24 一. 植物组织培养 外植体愈伤组织新植株

25 进行植物组织培养, 一般要经历以下五个阶段 : 1 外植体的选择及培养 2 诱导去分化阶段 3 继代增殖阶段 4 诱导分化生根成芽阶段 5 移栽成活阶段

26 二. 植物细胞培养 植物细胞培养定义 在离体条件下, 将愈伤组织活则其他易分散的组织置于液体培养基中, 进行振荡培养, 得到分散成游离的悬浮细胞, 通过继代培养使细胞增殖, 从而获得大量的细胞群体的一种技术

27 工业化植物细胞培养系统主要有两大类 : 悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统

28 三. 植物细胞杂交 ( 细胞融合 ) 1960 年英国诺丁汉大学 Cocking 教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶, 成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体, 开辟了原生质体融合研究的新阶段 植物细胞杂交的主要过程如下 : 1. 原生质体的制备 2. 原生质体的融合 3. 杂合体的鉴别与筛选

29 植物细胞工程的应用 细胞育种诱导突变, 筛选新品系 新品种次生代谢产物生成从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物 优点 比栽培原料作物更易控制最佳生产条件 ; 培养物为无菌 无虫材料, 能保证产品质量 ; 工艺操作较为简单, 可减少劳动费用, 提高生产率

30 PERSPECTIVES for the Future Advances in the culture of human cells will allow them to be applied to the treatment of disease and injury. Even today, severe burn patients can be treated by removing some of their undamaged skin, culturing the fibroblasts, and applying them to areas where the skin has been destroyed. As specific growth factors for various cell types are identified and expressed in sufficient quantities by recombinant DNA techniques, other cell types will be cultured and used therapeutically. In the not too distant future, safe and effective viral vectors will likely be developed to deliver genes encoding therapeutic proteins or RNAs to the specific cells where they are needed. Such gene therapy potentially could successfully treat numerous human diseases caused by the absence of critical cellular molecules.

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