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宓舒
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1 甘肃紫斑牡丹花粉中脂肪酸的分析研究李运 1, 邱国玉 1, 石晓峰 1,2*, 李志俊 1, 张文 1, 沈薇院, 兰州 ) 2 (1. 兰州市食品药品检验所, 兰州 ;2. 甘肃省医学科学研究摘要 : 目的分析评价甘肃紫斑牡丹花粉中的脂肪酸类成分方法采用溶剂法超声提取紫斑牡丹花粉中脂肪酸类成分, 经三氟化硼 - 甲醇法催化甲酯化, 以 GC-MS-SIM 对紫斑牡丹花粉及其破壁花粉样品进行分析采用 HP-5MS 石英毛细管色谱柱 (30 m 0.25 mm,0.25 μm); 载气 : 高纯氦气 ; 程序升温 : 起始温度 50, 以 8 min 1 升至 155, 保持 2 min; 再以 10 min 1 升至 175, 保持 2 min; 以 1.3 min 1 升至 190, 保持 8 min; 最后以 6 min 1 升至 280, 保持 5 min 不分流进样 ; 进样口温度 :260 ; 进样量 :1 μl 结果紫斑牡丹花粉中主要含有 C8~C24 的 18 种脂肪酸, 其中辛酸肉豆蔻酸棕榈酸油酸亚油酸 γ- 亚麻酸含量较高 ; 紫斑牡丹花粉中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主, 不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的 50.45%~73.55%; 破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸总量是未破壁样品的 6~7 倍结论的分析方法简便准确, 适于甘肃紫斑牡丹花粉中脂肪酸类成分的分析关键词 : 紫斑牡丹 ; 花粉 ; 脂肪酸 ; 甲酯化 ; 定量分析 ; 气相色谱 - 质谱 - 选择离子监测模式中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2017) DOI: /j.cnki.issn 所建立引用本文 : 李运, 邱国玉, 石晓峰, 等. 甘肃紫斑牡丹花粉中脂肪酸的分析研究 [J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(6): Analysis of Fatty Acids in Paeonia Rockii Pollen from Gansu Province LI Yun 1, QIU Guoyu 1, SHI Xiaofeng 1,2*, LI Zhijun 1, ZHANG Wen 1, SHEN Wei 2 (1.Lanzhou Institutes for Food and Drug Control, Lanzhou , China; 2.Gansu Academy of Medical Science, Lanzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To analyze and evaluate the fatty acids in Paeonia rockii pollen from Gansu province. METHODS The fatty acids in Paeonia rockii pollen collected from Gansu province and it s wall-broken pollen samples were extracted by ultrasonics method with cyclohexane, then methyl esterificated via BF 3 -methanol method, and finally detected by GC-MS-SIM. HP-5MS capillary column(30 m 0.25 mm, 0.25 μm) was adopted, and the heating program was 50 programmed to 155 at 8 min 1 and kept for 2 min, then increased to 175 at 10 min 1 and kept for 2 min, and raised to 190 at 1.3 min 1 and kept for 8 min, finally increased to 280 at 6 min 1 and kept for 5 min. The sample inlet temperature was set at 260. The injection volume was 1 μl with splitless mode. High purity helium was used as the carrier gas. RESULTS Paeonia rockii pollen contained 18 kinds of fatty acids (C8 C24). The content of caprylic acid, myristic acid, palmitic acid, linoleic acid, oleic acid and γ-linolenic acid were the more higher content among 18 kinds of fatty acids. The fatty acids in Paeonia rockii pollen were comprised of polyunsaturated fatty acids which takes up 50.45% 73.55% of the total fatty acids. The wall-broken pollen was almost 6 7 times as amounts of fatty acids as pollen. CONCLUSION The method is simple, accurate, which can be used for fatty acids analysis in Paeonia rockii pollen. KEY WORDS: Paeonia rockii; pollen; fatty acid; methyl esterification; quantification; GC-MS-SIM 紫斑牡丹 (Paeonia rockii) 为毛茛科 (Ranunculaceae) 芍药属 (Paeonia) 牡丹组 (Sect.Moutan) 多年生落叶灌木, 又名甘肃牡丹西北牡丹, 因花瓣基部有一个明显的色斑而得名 [1], 是我国中西部地区的特有中药材和花中珍品, 分布于四川北部甘肃南部陕西秦岭中段以西, 也是仅次于中原牡丹品种群的第二大品种群 [2] 近年来, 紫斑牡丹作为一种新兴重点发展的木本油料作物, 在甘肃省陇南天水定西临夏兰州等地广泛大面积种植, 资源蕴藏量大, 已开展了相关产业开发与规划花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞, 其中包含着孕育新生命所必需的全部营养物质 [3] ; 而不同的植物花粉中所含营养成分及其含量均有所差异, 目前已有 8 种花粉作为新食品资源得到开发 [4-5] 文献报道 [6-7], 丹凤牡丹花粉中含有大量可以促进健康增加机体防御基金项目 : 兰州市 2016 年第三批科技计划项目 ( ) 作者简介 : 李运, 男, 硕士生 Tel: (0931) lyun04@163.com (0931) shixiaofeng2005@sina.com * 通信作者 : 石晓峰, 男, 主任药师, 教授 Tel: 中国现代应用药学 2017 年 6 月第 34 卷第 6 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 June, Vol.34 No.6 849

2 能力的天然活性物质, 如蛋白质糖半纤维素果胶维生素微量元素以及 80 多种酶黄酮类化合物激素核酸和有机酸等, 其黄酮类化合物具有很好的抗氧化性能 ; 而有关紫斑牡丹的研究主要侧重于花粉发育的细胞形态学 [8] 脂肪酸类成分包括饱和及不饱和脂肪酸, 其中不饱和脂肪酸作为一种独特的生物活性物质对人体有重要的生理功能, 对于调控基因表达抗心血管病促进生长发育等方面发挥重要作用 [9] ; 不饱和脂肪酸的代表性成分 γ- 亚麻酸可通过多种生物学机制发挥降血脂杀菌抗炎抗高血压抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等作用 [10-12] ; 关于紫斑牡丹花粉的脂肪酸组成及其含量测定尚未见报道为全面研究紫斑牡丹花粉的功效物质基础, 本研究采用溶剂法超声提取脂类成分, 经三氟化硼 - 甲醇法催化甲酯化, 借助 GC-MS-SIM 对紫斑牡丹花粉中脂肪酸类成分进行了较为全面的定性定量分析, 为其进一步开发利用提供参考 1 仪器与试药 Agilent 7890B/7000C GC-MS-MS 型气相色谱 - 质谱联用仪 ( 配置有 7693 型自动进样器, 安捷伦仪器公司 );BSXT-02 型索氏提取器 ( 无锡沃信仪器有限公司 );MS3 digital 旋涡混合器 ( 德国艾卡公司 );BSA224S-CW 型电子天平 ( 德国 Sartorius 公司 );Milli-Q advantage A 10 超纯水系统 [ 默克化工技术 ( 上海 ) 有限公司 ];Centrifuge 5424 离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 );HH-6 型数显恒温水浴锅 ( 常州国华电器有限公司 ) 32 种脂肪酸甲酯混合对照品 ( 批号 : AMP, 供脂肪酸鉴别和含量测定用 ) 和 BF 3 - 甲醇溶液 ( 质量分数 :14%; 批号 :SHBG2724V) 均由 Sigma-aldrich 公司提供 ; 正己烷 ( 色谱纯 ; 默克公司产品 ); 异辛烷 ( 色谱纯, 阿拉丁公司产品 ); 其他试剂均为分析纯紫斑牡丹花粉采集于兰州中川牡丹园, 编号分别为 Pr1 Pr3 Pr4 Pr5, 原植物经兰州中川牡丹产业有限公司高级工程师赵潜龙鉴定为毛茛科芍药属植物紫斑牡丹 [Paeonia rockii(s.g.haw.et. Laeuner) T.Hang et.t.j.li];pr2 由甘肃省医学科学研究院药物所提供, 系将样本 Pr1 进行破壁处理得到紫斑牡丹破壁花粉 ( 破壁率达 100%) 2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备精密量取混合脂肪酸甲酯对照品 76.1 mg, 置 10 ml 量瓶中, 加入正己烷溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得脂肪酸甲酯混合对照品溶液, 冰箱冷藏备用 2.2 供试品溶液的制备取花粉约 1 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加环己烷 50 ml, 超声 ( 功率 :500 W, 频率 : 28 khz)30 min, 放冷, 摇匀, 滤过, 减压回收溶剂至干 ; 加入 0.5 mol L 1 氢氧化钠甲醇溶液 1 ml, 置 60 水浴皂化反应 30 min 至油滴消失 ; 冷却后加入 BF 3 - 甲醇 (14%) 溶液 1 ml, 于 60 水浴加热反应 15 min, 取出, 冷却后, 精密加入正己烷 2 ml 及异辛烷 5 ml, 充分振摇, 加饱和氯化钠溶液 10 ml, 转移至分液漏斗中, 分取上层异辛烷溶液, 作为供试品溶液, 备用 2.3 色谱和质谱条件色谱条件色谱柱 :HP-5MS 石英毛细管色谱柱 (30 m 0.25 mm,0.25 μm) 程序升温: 起始温度 50, 以 8 min 1 升至 155, 保持 2 min; 再以 10 min 1 升至 175, 保持 2 min; 以 1.3 min 1 升至 190, 保持 8 min; 最后以 6 min 1 升至 280, 保持 5 min 进样口温度: 260 ; 载气 : 氦气, 纯度 99.99%; 不分流进样 ; 流速 :1.0 ml min 1 ; 进样量 :1 μl 在上述色谱条件下, 混合对照品溶液与花粉样品中脂肪酸成分总离子流见图 1~2( 色谱峰编号与表 1 中编号一致 ) 根据各色谱峰的保留时间及相对分子质量, 结合 NIST 谱库的检索结果, 并与混合对照品进行比对, 对样品中的脂肪酸组分进行定性鉴定, 结果见表 1 图 1 32 种脂肪酸甲酯混合对照品总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatogram (TIC) of 32 kinds of fatty acid methyl ester reference substances 850 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 June, Vol.34 No.6 中国现代应用药学 2017 年 6 月第 34 卷第 6 期

3 图 2 紫斑牡丹花粉中脂肪酸甲酯总离子流色谱图 Fig. 2 TIC of fatty acids methyl ester in Paeonia rockii pollen 表 1 紫斑牡丹花粉中脂肪酸成分的定性结果 Tab. 1 Components of fatty acids in Paeonia rockii pollen 编号脂肪酸 t R /min 名称特征离子 1 C6: 己酸 87,99,101,131 2 C8: 辛酸 * 87,115,127,158 3 C10: 葵酸 * 74,101,143,186 4 C11: 十一烷酸 * 74,101,169,200 5 C12: 十二烷酸 * 74,171,183,214 6 C13: 十三烷酸 74,143,185,228 7 C14: 肉豆蔻脑酸 55,69,208,240 8 C14: 肉豆蔻酸 * 87,143,213,242 9 C15: 十五碳烯酸 55,110,222, C15: 十五烷酸 * 87,143,213, C16: 棕榈烯酸 152,194,236, C16: 棕榈酸 * 87,143,227, C17: 顺 10- 十七碳烯酸 * 55,208,250, C17: 十七烷酸 * 87,143,241, C18: γ- 亚麻酸 * 79,95,121, C18: 亚油酸 * 67,109,263, C18: 油酸 * 55,222,264, C18:2tt 反式亚油酸 67,81,263, C18:1t 反式油酸 55,222,264, C18: 硬脂酸 * 74,143,255, C20: 花生四烯酸 79,133,150, C20: 二十碳五烯酸 79,105,175, C20: 二十碳三烯酸 67,93,177, C20: 二十碳二烯酸 * 55,67,291, C20: 二十碳烯酸 55,208,292, C20: 花生酸 * 43,74,283, C21: 二十一烷酸 74,143,297, C22: 二十二碳六烯酸 44,79,130, C22: 二十二碳二烯酸 * 55,67,109, C22: 榆树酸 * 43,74,311, C23: 二十三烷酸 74,143,325, C24: 木蜡酸 * 43,74,339,382 注 :* 紫斑牡丹花粉样品中测得的脂肪酸 Note: * components of fatty acids in Paeonia rockii pollen 质谱条件扫描模式 :SIM; 电子轰击离子源 (EI), 离子源温度 230, 电子能量 70 ev, 质量扫描范围 m/z 40~400, 溶剂延迟 4.0 min 2.4 线性关系考察分别精密吸取 2.1 项下混合对照品储备液适量, 加正己烷配制成浓度为 2,4,5,6,9,10, 15 μg ml 1 系列的标准溶液, 按 2.3 项下所述条件分别进样 1 μl, 进行 GC-MS/SIM 分析, 以脂肪酸甲酯对照品溶液质量浓度 (X,μg ml 1 ) 为横坐标, 峰面积平均值 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程和相关系数, 见表 2 结果显示,32 个被测脂肪酸甲酯化成分在各自浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系 (r= ~ ) 表 2 32 种脂肪酸的线性关系考察结果 Tab. 2 Linear relations of 32 kinds of fatty acid methyl esters 编定量线性范围 / 脂肪酸标准曲线 r 号离子 μg ml -1 1 C6:0 87,131 Y= X ~ C8:0 87,158 Y= X ~ C10:0 74,186 Y= X ~ C11:0 74,200 Y= X ~ C12:0 74,214 Y= X ~ C13:0 74,228 Y= X ~ C14:1 55,240 Y= X ~ C14:0 87,242 Y= X ~ C15:1 55,254 Y= X ~ C15:0 87,256 Y= X ~ C16:1 152,268 Y= X ~ C16:0 87,270 Y= X ~ C17:1 55,282 Y= X ~ C17:0 87,284 Y= X ~ C18:3 79,292 Y= X ~ C18:2 67,294 Y= X ~ C18:1 55,296 Y= X ~ C18:2tt 67,294 Y= X ~ C18:1t 55,296 Y= X ~ C18:0 74,298 Y= X ~ C20:4 79,318 Y= X ~ C20:5 79,316 Y= X ~ C20:3 67,320 Y=7.93*10 5 X ~ C20:2 55,322 Y= X ~ C20:1 55,324 Y= X ~ C20:0 43,326 Y= X ~ C21:0 74,340 Y= X ~ C22:6 44,342 Y= X ~ C22:2 55,350 Y= X ~ C22:0 43,354 Y= X ~ C23:0 74,368 Y= X ~ C24:0 43,382 Y= X ~0.60 中国现代应用药学 2017 年 6 月第 34 卷第 6 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 June, Vol.34 No.6 851

4 2.5 仪器精密度试验精密吸取浓度为 6 μg ml 1 的混合脂肪酸甲酯对照品溶液 1 μl, 依 2.3 项下色谱条件重复进样 6 次, 测定所分析各脂肪酸甲酯化成分的峰面积, 计算所分析 18 种脂肪酸甲酯化成分峰面积的 RSD(n=6), 结果见表 3, 其 RSD 为 0.51%~1.78%, 表明该仪器精密度良好 2.6 稳定性试验精密称取同一批次花粉样品 (Pr2)1.0 g, 按 2.2 项下方法制备供试品溶液, 按 2.3 项下色谱条件, 分别在 0,2,4,8,12 和 24 h 各进样 1 μl, 测定所分析各脂肪酸甲酯化成分的峰面积, 计算其 RSD 值, 结果见表 3, 所分析 18 种脂肪酸的 RSD 为 1.16%~2.90%, 表明供试品溶液中所分析 18 种脂肪酸在 24 h 内具有较好的稳定性 2.7 重复性试验精密称取紫斑牡丹花粉样品 (Pr2)1.0 g,6 份, 按 2.2 项下方法制备供试品溶液, 按 2.3 项下色谱条件进样 1 μl, 测定所分析各脂肪酸甲酯化成分的峰面积, 计算各脂肪酸的平均含量的 RSD, 结果见表 3, 所分析 18 种脂肪酸平均含量的 RSD 为 0.89%~2.76%, 表明本法重复性良好 2.8 加样回收率试验精密称取已测知脂肪酸含量 ( 其中 γ- 亚麻酸 6.50 μg mg 1 亚油酸 μg mg 1 ) 的花粉样品 (Pr2)0.5 g,6 份, 分别精密加入等量的对照品, 按 2.2 项下方法制备供试品溶液, 按 2.3 项下色谱条件进样 1 μl, 测定所分析各脂肪酸甲酯化成分的峰面积, 然后计算各脂肪酸的平均加样回收率及其 RSD, 结果见表 3, 所分析 18 种脂肪酸的平均加样回收率为 92.71%~103.58%,RSD 为 1.57%~2.78% 2.9 样品测定取紫斑牡丹花粉样品, 按 2.2 项下方法制备供试品溶液, 按 2.3 项下色谱条件进样分析, 5 批样品测定结果见表 4 3 讨论 3.1 样品前处理条件的考察通常脂肪酸的色谱分析都要进行衍生化前处理, 也即脂肪酸的甲酯化或乙酯化,C5 以下脂肪酸一般可衍生化为乙酯,C6 以上脂肪酸一般转化为甲酯, 甲酯化的方法有三氟化硼 - 甲醇法酸催化甲酯法碱催化甲酯法和重氮甲烷甲酯化法 [13] 表 3 精密度重复性稳定性和加样回收率试验结果 (n=6) Tab. 3 Results of precision, repeatability, stability and recovery tests (n=6) 编号脂肪酸 RSD/% 精密度重复性稳定性加样回收率平均加样回收率 /% RSD/ % 1 C8: C10: C11: C12: C14: C15: C16: C17: C17: C18: C18: C18: C18: C20: C20: C22: C22: C24: 表 4 紫斑牡丹花粉中脂肪酸含量测定结果 (n=5) Tab. 4 Results of the content determination of fatty acids in Paeonia rockii pollen (n=5) μg mg 1 编号脂肪酸名称 Pr1 Pr2 Pr3 Pr4 Pr5 1 C8:0 辛酸 C10:0 葵酸 C11:0 十一烷酸 C12:0 十二烷酸 C14:0 肉豆蔻酸 C15:0 十五烷酸 C16:0 棕榈酸 C17:1 顺 10- 十七碳烯酸 C17:0 十七烷酸 C18:3 γ- 亚麻酸 C18:2 亚油酸 C18:1 油酸 C18:0 硬脂酸 C20:2 二十碳二烯酸 C20:0 花生酸 C22:2 二十二碳二烯酸 C22:0 榆树酸 C24:0 木蜡酸脂肪酸总量不饱和脂肪酸总量不饱和脂肪酸占脂肪酸总量 /% Chin J Mod Appl Pharm, 2017 June, Vol.34 No.6 中国现代应用药学 2017 年 6 月第 34 卷第 6 期

5 本研究的样品衍生化前处理考察了三氟化硼 - 甲醇法和碱催化甲酯法 2 种方法结果表明,2 种衍生化方法在待测脂肪酸成分的种类方面没有明显差异, 然而在脂肪酸测试含量方面存在显著差异, 其中三氟化硼甲醇法测得的脂肪酸总量是碱催化甲酯法的 4 倍左右故本试验选择了三氟化硼 - 甲醇法用于样品的前处理 3.2 色谱条件的考察为了保证紫斑牡丹花粉中脂肪酸甲酯化成分具有良好的分离, 本实验考察了 4 种不同极性固定相的石英毛细管柱 HP-5MS RTX-1701 RTX-Wax HP-88 对混合标样中 32 种脂肪酸甲酯和紫斑牡丹花粉中脂肪酸甲酯化成分的分离效果进行比较结果表明,HP-5MS 色谱柱对混合标样和样品中的脂肪酸甲酯化成分均实现了良好分离, 且对样品中的脂肪酸甲酯化顺反异构体得到分离 ; 进一步对程序升温方法进行优化, 得到了良好的分离效果和时间相对较短的 GC-MS/SIM 分析程序 3.3 甘肃紫斑牡丹花粉中脂肪酸的含量分析本研究采用 GC-MS-SIM 分析紫斑牡丹花粉脂肪酸含量, 该方法分析速度快, 专属性好, 灵敏度高, 操作简便分析结果表明, 甘肃紫斑牡丹花粉中主要含有 C8~C24 的 18 种脂肪酸, 总量为 7.49~56.15 μg mg 1, 其中辛酸肉豆蔻酸棕榈酸油酸亚油酸 γ- 亚麻酸含量较高 ; 紫斑牡丹花粉中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主, 不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的 50.45%~73.55% 3.4 破壁对紫斑牡丹花粉脂肪类成分提取的影响本研究对破壁紫斑牡丹花粉中的脂肪酸进行了分析, 结果表明, 破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸类化合物的含量明显高于不破壁的花粉, 破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸总量是未破壁样品的 6~7 倍, 其中亚油酸 γ- 亚麻酸油酸棕榈酸的提取分别增高了 15,11.6,1.7,8.5 倍由此可见, 紫斑牡丹花粉的破壁, 更有利于脂肪酸类成分的溶出与提取, 这为进一步开发利用紫斑牡丹花花粉提供了技术支撑 REFERENCES [1] 李熙莉, 李平平, 岳桦. 紫斑牡丹研究进展 [J]. 北方园艺, 2007(5): [2] 何登文. 紫斑牡丹的研究概况 [J]. 甘肃中医, 2005, 18(3): 34. [3] 毛礼米, 王开发. 我国花粉资源应用及其研究进展 [J]. 自然杂志, 1997, 20(5): [4] 王开发. 我国常见八种花粉的功效探讨 [J]. 蜜蜂杂志, 2010, 30(12): 5-9. [5] 李彬彬. 卫生部公布第三批药食两宜名单 [J]. 江苏调味副食品, 1999(3): 23. [6] 刘俊民, 于荟, 阴英超, 等. 凤丹牡丹雄蕊营养成分分析及其功效描述 [C]. 第十二届全国营养科学大会论文汇编, 2015: [7] LIU J, LI N, WANG C T. Research on extraction method of flavonoids from peony pollen and its antioxidative activity [J]. Food Res Dev( 食品研究与开发 ), 2012, 33(10): [8] CHENG F Y. Cytomorphological studies on the pollen development of blotched tree peony (Paeonia rochii) [J]. Acta Hortic Sin( 园艺学报 ), 1998, 25(4): [9] SU X Y, GAO G T, DUAN A L, et al. Research progress in polyunsaturated fatty acids [J]. Sci Technol Food Indust( 食品工业科技 ), 2017, 33(7): [10] ZHOU T Y, REN F, DENG L, et al. Research progress in physiological and biochemical function of γ-linolenic acid [J]. Guizhou Agric Sci( 贵州农业科学 ), 2011, 39(3): [11] YANG Y F, RAMOS K S, CHAPKIN R S. Dietary gamma-linolenic acid enhances mouse macrophage-derived prostaglandin E 1 which inhibits vascular smooth muscle cell prolifeeation [J]. J Nutr, 1997, 127(9): [12] WEN G J, HISEOX S, HALLETT M B, et al. Regulation of the expression of E-cadherin on human cancer cells by gamma-linolenic acid (GLA) [J]. Cancer Res, 1995, 55(21): [13] YU Z H. Oil fatty acid derivatization method and choose in B gas chromatography [J]. Grain Process( 粮食加工 ), 2004, 29(6): 收稿日期 : ( 本文责编 : 李艳芳 ) 中国现代应用药学 2017 年 6 月第 34 卷第 6 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 June, Vol.34 No.6 853

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.