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邀公孙
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高效液相色谱法 (HPLC) 转换到超高效液相色谱法 (UHPLC) 的通用工具技术指南 75 Holger ranz and Susanne abel Thermo isher Scientific, Germering, Germany 引言随着超高效液相色谱法 (UHPLC) 的商品化, 这项技术的使用呈现出一种持续增长的趋势这一趋势主要受液相色谱仪器和色谱柱填料的创新驱动

1 高效液相色谱法 (HPLC) 转换到超高效液相色谱法 (UHPLC) 的通用工具技术指南 75 Holger ranz and Susanne abel Thermo isher Scientific, Germering, Germany 引言随着超高效液相色谱法 (UHPLC) 的商品化, 这项技术的使用呈现出一种持续增长的趋势这一趋势主要受液相色谱仪器和色谱柱填料的创新驱动 UHPLC 固定相比 HPLC 固定相的粒径更小, 低至亚 2 µm 范围, 理论塔板和分离度均优于具有相同柱长但使用较大粒径的色谱柱通常情况下, HPLC 方法转换成 UHPLC 方法后, 足以维持原 HPLC 方法的分离度, 因此, 主流的做法是使用更短的色谱柱装填更小粒径的填料, 在保持分离度不变的前提下, 提高分离速度但若要保证流速进样体积或梯度曲线等参数适合新色谱柱的特性, 需要经过相当复杂的计算 Thermo Scientific Method Transfer Tool 能简化这些计算过程并且提供多语言界面支持根据现有的 HPLC 色谱参数, 自动计算出 UHPLC 方法所需的最佳色谱参数本文向您介绍了 HPLC 方法向 UHPLC 方法转换的相关理论背景和数学方程, 同时对 Thermo Scientific Method Transfer Tool 的使用方法进行了详细介绍, 方便您更熟练地获取计算结果除了基于梯度延迟体积差异进行的基本转换以外, 该工具还提供了更多有价值的功能, 如数据采集速率的调整, 以及色谱柱再平衡时间的调整等方法加速策略在尽可能短的时间内达到足够的分离度是将 HPLC 方法转换为 UHPLC 方法的主要目的具体做法是使用更短的色谱柱装填更细的填料该方法的理论基础是基于各种色谱教科书广泛收载的色谱学理论基于下文描述的各种色谱转换公式,Method Transfer Tool 可用于具有相似色谱选择性的全多孔色谱固定相在 HPLC 方法和 UHPLC 方法间的快速转换液相方法的分离效率可用峰容量 P 来表示峰容量是指一定时间周期内可分离得到的色谱峰个数, 等于运行时间除以平均峰宽因此, 较窄的峰宽是快速分离方法获取更高分离效率必不可少的条件峰宽与理论塔板数 (N) 平方根的倒数成正比考虑到柱长, 分离效率也可用理论塔板的高度 H 来表示方程 1 给出了柱长 L 与塔板高度 H 和塔板数 N 的关系方程 1: : N L H = 塔板数 = 柱长 = 塔板高度

2 2 在柱长一定的情况下, 较小的塔板高度可获得较大的理论塔板数较大的峰容量意味着较窄的峰宽和较小的塔板高度哪些因素影响塔板高度 H 呢? 为了寻找答案, 必须考虑到色谱柱内的各个过程, 色谱分离过程可以用 an Deemter 方程 ( 方程 2) 表示方程 2: H u = 线速率 A = 涡流扩散项 B = 纵向扩散项 C = 传质阻力项 B A C u u 涡流扩散项 A 描述了流动相沿固定相表面不同随机路径运动导致的分析物谱带展宽分析物相对于流速的纵向扩散用 B 表示 C 描述了分析物在不同的固定相孔隙内扩散产生的色谱峰展宽随着流速的增加, 谱带展宽程度增大塔板高度 H 与流动相线速率的关系可以用 an Deemter 曲线表示 an Deemter 曲线有助于确定最佳流速, 获取最高柱效率和最低塔板高度根据 Halász 1 ( 方程 3) an Deemter 方程的简化可以对全多孔固定相的柱效率进行简单估算方程 3: H 2 d d p = 粒径 ( 单位 µm) p 2 6 d p u u 20 u = 流动相速率 ( 单位 mm/s) 塔板高度 H 相对于速率 u 的曲线取决于固定相粒径 d p ( 见图 1, 顶部 ) 该曲线直观地说明了小粒径固定相在增加速度中的关键作用 : 粒径越小, 塔板高度越低, 因此分离效果也越好使用装填小粒径固定相的短色谱柱可以获得装填大粒径固定相的长色谱柱才具备的柱效因此使用小粒径固定相可以缩短运行时间对于 2 µm 的固定相, 图 1 显示了使用较小粒径固定相的另一个好处 : 小粒径可以改善传质过程, 即使流速已超出最佳范围, 塔板高度的增加也会降至最低, 这就为进一步提高流速带来了可能将 Halász 方程的一阶导数设为零, 可以计算出最佳流速和最小塔板高度然后, 利用方程 4 求出最佳线速率 ( 单位 mm/s) 方程 4: u opt B C d u opt = 最佳线速率 ( 单位 mm/s) p 塔板高度是粒径的函数, 在方程 3 中插入方程 4, 得方程 5, 可计算最小塔板高度方程 5:H min 3 d p H min = 最小塔板高度色谱工作人员一般更愿意采用分离度代替理论塔板来衡量分离效率分离度 R 与理论塔板数的平方根成正比, 如方程 6 所示 1 k 1 方程 6: R N 4 1 k R k α = 分离度 = 容量因子 = 选择系数

3 如果保持色谱柱柱长不变, 粒径减小, 则分析物的分离度提高图 1 使用粒径分别为 5 µm 和 2 µm 的固定相论证了这一效果 10 µm 5 µm 3 µm 2 µm 在梯度方法转换时, 必须考虑梯度曲线与新色谱柱的尺寸和流速的匹配, 从而保持分离性能该理论由 L. Snyder 2 提出, 称为梯度体积原则梯度体积指在规定的梯度时间 t G 内, 流经色谱柱的流动相体积若梯度体积相对于柱体积不变, 则认为分析物在比例相同的洗脱液中进行了洗脱若保持梯度体积和柱体积之比不变, 则保证梯度方法可以准确的向不同规格色谱柱转移考虑变化后的流速和柱体积, 利用方程 7 计算出新方法的梯度时间间隔 t G 3 方程 7: t G新 t G旧旧新 L L 新旧 d d c新 c旧 2 线速率 u [mm/s] 5 µm 填料上的分离 t G = 梯度时间 = 流速 d c = 柱内径通过采用 Method Transfer Tool( 图 2), 可以实现方法参数的轻松转换, 所讨论的理论自动适用 2 µm 填料上的分离分钟分钟图 1. 不同粒径固定相分离三个化合物 ( 底部 ) 以及 an Deemter 曲线 ( 顶部 ) 最低塔板高度 H 说明, 粒径越小, 理论塔板数越多, 分离度越大使用较小粒径时, 即使线速率大于最佳线速率 u opt,h 增加幅度小, 分离速度更快因此, 在保持分离度不变的同时, 分离速度更快塔板高度 H 相对于流动相的线速率 u 的 an Deemter 曲线 ( 顶部 ) 揭示出小粒径的加速优势 : 由于最小塔板高度的降低和最佳速率的增加, 减小粒径后允许使用更高流速, 更短色谱柱优化结果是, 峰宽变小, 分离度增加 ( 底部 ) 图 2. Thermo Scientific Method Transfer Tool 实现了传统 ( 现有 )HPLC 方法到新的 ( 计划 ) UHPLC 方法的转换

4 前提条件系统要求 Method Transfer Tool 是一种通用工具, 可配合任何 HPLC 系统使用然而, 成功的方法转换必须考虑一些前提条件, 本技术指南利用七种饮料添加剂的分离案例对此进行了说明柱尺寸首先, 从 HPLC 方法到 UHPLC 方法的转换要求选用填料较小粒径的适当色谱柱如果新旧方法所用色谱柱的选择性相同, 用 Method Transfer Tool

4 4 前提条件系统要求 Method Transfer Tool 是一种通用工具, 可配合任何 HPLC 系统使用然而, 成功的方法转换必须考虑一些前提条件, 本技术指南利用七种饮料添加剂的分离案例对此进行了说明柱尺寸首先, 从 HPLC 方法到 UHPLC 方法的转换要求选用填料较小粒径的适当色谱柱如果新旧方法所用色谱柱的选择性相同, 用 Method Transfer Tool 转换所得的 UHPLC 方法将与实际应用更加吻合因此, 来自同一制造商表面改性相同的色谱柱更适合于方法的精确转换如果此法不适用, 可选择基质和键合相相同的色谱柱使用较短的色谱柱可以加快分离, 但使用较短色谱柱的前提是能提供足够的分离度, 实现分析物的基线分离表 1 概括了不同柱长和粒径大小组合的 Thermo Scientific Acclaim 120 C18 柱所预期的理论塔板数需要注意的是, 色谱柱制造商一般采用 4~5 μm 固定相填充规定粒径为 5 μm 的色谱柱 Acclaim 120 C18 5 μm 的色谱柱实际上填充的是平均粒径为 4.5 μm 的固定相, 这在表格中有所体现表 1. 取决于柱长和粒径的理论塔板数 ( 使用方程 5 计算 ) 理论塔板 N 粒径 4.5 µm 3 µm 2.2 µm 柱长 :250 mm mm mm mm mm 如果初始的分离度高于要求的分离度, 可以缩短柱长保持柱长不变, 同时使用较小的色谱柱填料, 可以提高分离度减小柱内径并不能缩短分析时间, 只是减少了流动相消耗和样品体积但出于对高温分离的考虑, 较小的柱内径可降低色谱柱温度不均匀的风险小粒径固定相会产生较高的背压减小粒径时必须增加流动相的线速率, 以便色谱柱在 an Deemter 最佳范围内工作在高达 15,000 psi (1034 bar) 的工作压力下,Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RS 系统可以完美实现这种方法在流速不超过 5 ml/min 的整个流速范围内, 最大压力恒定不变从 5 ml/min 到 8 ml/min, 最大压力线性调整到 800 bar 通过增加流速, 这些承压能力有可能进一步地加速应用需要注意的是, 小粒径的色谱柱也可用于生物兼容的快速分析系统 :Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 BioRS 系统它支持相同的流量和压力范围, 因此可以以同样的方式使用泵图 3. HPLC 系统的梯度延迟体积和柱外体积二者在方法加速中均发挥着重要的作用梯度延迟体积 (GD) 对于快速梯度法起着关键性作用 Method Transfer Tool 遵循 L. Snyder. 2 引入的梯度体积原则梯度体积的含义是, 在特定的梯度时间 t G 内, 流经色谱柱的流动相体积在该时间点下, 可视为分析物被某一特定梯度比例所洗脱因此, 若保持梯度体积和柱体积的比值不变, 则可以保证梯度方法在不同规格色谱柱之间准确的转换为此, 系统的梯度延迟体积 (GD) 也必须遵循梯度体积原则 ( 方程 8) 方程 8: GD 柱梯度延迟体积 GD, 新自动进样器柱外体积 GD, 旧 = 梯度延迟体积 = 柱体积 column GD, 新检测器柱外体积 GD 是从第一个混合点到柱头的体积 ( 图 3) GD 主要受泵混合体积自动进样器流路和柱前所有连接管路体积的影响作者建议采用参考文献 3 中描述的方法确定 GD 柱

5 溶剂 A 溶剂 B 第一阶段 : 径向混合流向第二阶段 : 纵向混合图 4. UltiMate 3000 系列的高度可定制两步混合概念使 GD 可以适应各种需求当柱体积符合梯度体积原则要求, 并能保持原方法的选择性不变时 4 ( 假设转换前后的两根色谱柱总孔隙率 ε T 一致 ), 可以按比例缩小 GD 实际上, 按比例精确调整系统 GD 是很困难的, 而且有必要根据色谱柱体积按正确比例减小泵混合体积, 因为这是总 GD 产生的主要来源为了解决这个问题,UltiMate 3000 泵的设计提出了高度可定制的两步混合体积概念, 可以灵活满足该项需求 ( 图 4) 除了梯度延迟体积, 柱外体积也是快速 LC 方法的一个重要参数柱外体积是样品流经该系统时的管路体积, 会导致分析物的色谱峰加宽 ( 图 3) LC 系统的柱外体积应当低于峰体积的 1/10 因此, 从进样器到色谱柱色谱柱到检测器的连接管路长度和内径应当尽可能小为了避免产生死体积, 安装管路时必须特别小心 Thermo Scientific Dionex iper 连接器通过对管道尖端处进行密封, 实现了零死体积连接, 无需额外工具即可确保传统 HPLC 系统到现代 UHPLC 系统的转换 iper 是一个手拧接头系统, 可承受 1,250 bar (18,000 psi) 的 UHPLC 背压, 仅需较小扭矩便可实现密封, 并且可与其它厂家的管路和阀器件连接使用除了正确的管道连接, 流通池的体积也必须与 UHPLC 色谱柱分离所得色谱峰体积匹 5,6 配当流通池体积不超过最小峰体积的 10% 时, 柱外效应导致的色谱峰展宽一般不明显检测器设置传统方法向 UHPLC 方法转换时, 检测器设置对检测器性能具有重大影响数据采集速率和时间常数必须适应较窄的峰宽一般情况下, 每个色谱峰应由至少 30 个数据点定义数据采集速率和时间常数设置通常是相互关联的, 用于优化单个色谱峰的数据点数量, 减少短期噪声, 同时保持色谱峰高对称性和分离度 Thermo Scientific Method Transfer Tool 具有估算新方法峰宽的功能在此基础上, 该工具提出了新的数据采集速率该功能的具体细节详见本技术指南的特殊设置章节除了使用本方法转换工具进行估算,Thermo Scientific Dionex Chromeleon 变色龙色谱数据系统 (CDS) 软件也具有方法向导, 输入最小色谱峰半峰高处的峰宽即可计算出最佳参数最小色谱峰半峰高处的峰宽最好在最短运行时间和最大采集速率条件下获取在方法向导中输入通过检测获取的峰宽值, 可进行检测参数的优化若需了解更详细情况, 请参考检测器操作手册采用转换工具进行方法加速分离示例分离在二元 UltiMate 3000 RS 系统上进行, 该系统由 HPG-3200RS 二元快速分离泵带分析型定量环 (100 µl) 的 WPS-3000RS 快速分析自动进样器带预加热器 (2 µl) 的 TCC-3000RS 快速分离柱温箱带 2.5 µl 流通池的 WD-3400RS 可变波长检测器组成 Chromeleon CDS 软件同时用于仪器控制和数据报告在 45 下采用梯度洗脱法, 在两种不同的色谱柱上, 对七种常见饮料添加剂的标准混合物进行分离 : 传统 HPLC 色谱柱 :Acclaim 120 C18,5 µm, mm,(p/n ) UHPLC 色谱柱 :Acclaim RSLC 120 C18, 2.2 µm, mm 柱 (P/N ) 5 采用 HPLC 色谱柱时, 数据采集速率为 5 Hz, 采用 UHPLC 色谱柱时, 数据采集速率为 25 Hz 和 50 Hz 紫外 (U) 检测波长为 210 nm 该方法的详细情况, 如流速进样体积, 以及传统方法和 RSLC 法的梯度表在下一章节中予以说明色谱参数采用 Method Transfer Tool 进行转换和计算

6 6 色谱峰 :1. 安赛蜜 K 5. 苯甲酸适当分离度的柱选择 2. 糖精 6. 山梨酸酯 3. 咖啡因 7. 苯甲醛 4. 阿斯巴甜快速分离方法开发的前提是保证高效分离在本例中, 化合物 5 和 6 的分离最具挑战性根据表 1, 通过对塔板数的考虑, 可以做色谱柱的预选 mm,5 µm 色谱柱实际填充的固定相粒径为 4.5 µm 因此, 它的理论塔板数约为 11,100 塔板 / 柱在该色谱柱上, 分离度 R(5,6)=3.48 此分离度足够大, 可选择具有较少理论塔板数的快速 LC 色谱柱因此, 选用了塔板数约为 7600 的 mm,2.2 µm 色谱柱分钟图 5. 方法加速, 采用 Method Transfer Tool, 从 A) 在 Acclaim 120 C18 5 µm 粒径色谱柱上的传统 LC 分离到 B) 和 C) 在 Acclaim RSLC 120 C µm 粒径色谱柱上的 UHPLC 分离七种饮料添加剂的传统分离法如图 5A 所示利用 Method Transfer Tool, 该方法在两种流速下成功地实现了向 UHPLC 方法的转换 ( 图 5B 和 C) 下一章节描述了如何利用该通用工具进行轻松的转换输入到 Method Transfer Tool 黄颜色字段中的第一组数值分别是当前柱尺寸计划柱尺寸和关键对的分离度为了获得最精确的方法转换, 采用制造商提供的色谱柱规格表中所列粒径, 而非标称的粒径, 两者可能有所不同标称粒径为 5 µm 的 Acclaim 120 C18 色谱柱实际填充的是 4.5 µm 粒径的固定相, 该数值应当用于实现精确的方法转换计算此时, 根据固定相化学性质不变的假设, 计算者预测出新方法提供的分离度 ( 图 6) 在图 6 的示例中, 苯甲酸和山梨酸酯之间的预测分离度为 2.87 分离度 R 1.5 时, 将弹出对话框, 并显示达到基线分离这表明, 在具有足够分离度的情况下, 利用计划色谱柱, 有可能实现成功的方法转换如果 R 小于 1.5, 则出现红色警告未达到基线分离注意, 加权因子 B 为 1 时方可进行分离度计算, 否则禁用调整流速一节描述了加权因子的作用图 6. 以关键化合物间的分离度作为选择色谱柱的依据

7 7 图 7. 当前方法的流速进样体积和背压根据新的色谱柱尺寸进行调整图 8. 通过应用加权因子 2.5, 使新的流速得到进一步加速仪器设置 Method Transfer Tool 的下一章节涉及基本的仪器设置这些设置包括当前方法的流速进样体积和系统背压, 以及数据采集速率 ( 图 7) 此外, 如果输入需要运行的样品数量, 则可以计算出新方法的处理量增益调整流速根据 an Deemter 理论, 小粒径固定相需要较高的线速率, 以提供最佳的分离效率因此, 利用当前方法和计划方法的粒径比,Method Transfer Tool 自动优化了线速率此外, 如果柱内径发生变化, 新流速须根据柱截面的变化进行流速的调整, 以保证流动相的线速率不变可以输入加权因子 (B), 乘以流速, 进一步减少分离时间如果 B = 1 时, 所得的分离度可实现基线分离该方法可以通过增加加权因子进行加速, 因此增加了流速图 1 显示了粒径相较小时, 超出最佳线速率也不会引起塔板数的显著降低注意,B 1 时,Method Transfer Tool 的分离度计算功能被禁用对于即将开始的分离, 从 Acclaim 120 C mm,4.5 µm 色谱柱变化到 mm,2.2 µm 色谱柱时, 流速从 1.5 ml/min 按比例调整到 ml/min( 见图 7), 使线速率与柱尺寸和粒径相对应软件预测化合物 5 和 6 的分离度为 R = 2.87 实际达到的分离度为 R = 2.91, 与计算结果大致吻合 ( 图 5 的色谱图 B) 输入加权因子 2.5, 对该方法进一步增加流速 ( 图 8) 然后执行该方法, 令流速为 ml/min, 分离度 R = 2.56, 仍然符合要求 ( 见图 5 中的放大色谱图 C) 注意, 估算压力超过 8,700 psi (600 bar) 时, Method Transfer Tool 显示警告检查系统 / 柱压限由于该工具可以与任何 LC 仪器和色谱柱配合使用, 我们可以避免意外地施加过高压力目前, 尽管 UHPLC 是一项成熟技术, 许多所谓的 UHPLC 色谱柱仍不能在高于 8,700 psi 的压力下使用

8 8 图 9. 采用 Thermo Scientific Method Translate Tool 调整后的数据采集速率的示例数据采集速率色谱峰是精准采集的 30 个数据点集成的结果从 HPLC 到 UHPLC 的方法转换通常会减少峰体积和峰宽为了满足 30 个数据点的要求, 必须调整数据采集速率在假设当前采集速率适用于给定的分离方法前提下,Method Transfer Tool 可根据当前的数据采集速率和输入的两种色谱柱尺寸, 计算出新方法的数据采集速率 ( 方程 9) 在当前的示例中, 数据采集率从 5 Hz 变成 64 Hz( 图 9) 方程 9: D 新 L L 新旧 D 旧 d d 3 p, 新 3 p, 旧 D 新 = 调整后的数据采集率 (Hz) D 旧 = 当前数据采集率 (Hz) L 新 = 新色谱柱柱长 (mm) L 旧 = 旧色谱柱柱长 (mm) d p 新 = 新色谱柱固定相粒径 (µm) d p 旧 = 旧色谱柱固定相粒径 (µm) 调整进样体积为了适应新色谱柱尺寸以达到与原方法接近的色谱峰高, 需调整进样体积, 使进入色谱柱的单位载样量相同, 进样体积主要根据色谱柱内径按比例加以调整此外, 与原来的长色谱柱相比, 可以预估新色谱柱获得的色谱峰更尖锐, 峰宽更窄调整后的进样体积可根据方程 10 计算得到方程 10: inj inj, 旧 column, 新 column, 旧一般情况下, 建议 UHPLC 方法使用较小的流通池, 以尽量减少柱外效应这种流通池带有较短的光程 ( 取决于制造商和检测器的类型 ), 直接影响检测器的响应方法转换工具未考虑到这种潜在的差异在软饮料分析示例中,Acclaim 120 C mm,4.5 µm 柱更换为 mm,2.2 µm 柱时, 进样体积从 25 µl 按比例调整到 2.1 µl( 见图 7) 预测背压若通过减小粒径和柱径以及增加流速来加速当前方法, 则意味着柱压的升高柱两端的压差可以利用 7 Kozeny-Carman 公式求得近似值考虑到柱内径流速和粒径的变化, 新方法的压降利用 Method Transfer Tool 进行预测, 然后乘以加权因子在方法转换过程中, 认为流动相的粘度不变所计算的压力只是一个近似值, 并未考虑标称粒径分布和实际粒径分布 ( 依柱制造商而定 ) 在软饮料分析示例中, 在 mm 柱上 B = 1 时, 实际压力从 92 bar 增加到 182 bar(1334 psi 到 2640 psi), 使用 UHPLC 方法,B = 2.5 时, 实际压力增加到 460 bar (6671 psi) 利用 Method Transfer Tool 预测的压力分别为 262 bar 和 656 bar(3,800 psi 和 9,514 psi) 压力计算考虑固定相粒径的变化在方法转换情况下, 压力还受到其他因素的影响, 如粒径分布系统压力流通池的变化等采用加权因子等乘法因数时, 可明显看出计算压力和实际压力之间的差异压力计算只是为了给出一个参考值, 即对于计划色谱柱, 可使用什么样的流速, 实际的压力还需要将该流速用于色谱柱以后测得梯度曲线的调整根据梯度 - 体积原理, 梯度曲线必须适应于变化后的色谱柱尺寸和流速将当前梯度方法输入梯度表然后对梯度曲线进行相应调整, 并创建新的梯度曲线式中, inj = 进样体积

9 图 10. 根据梯度 - 体积原则, 当前方法 (A) 的梯度表适合加权法 (B) 当使加权因子 B = 1 时, 软饮料分析的调整梯度表如图 10 所示根据梯度 - 体积原则, 由于色谱柱尺寸从 4.6 150 mm,5 µm( 填充 4.5 µm 固定相 ) 变化到 2.1 50 mm,2.2 µm, 流速从 1.5 ml/min 减少到 0.

89 min 梯度时间相应地进行了调整图 5 中显示洗脱顺序的变化, 在方法转换过程中可以保持梯度的分离性能 Method Transfer Tool 的附加功能除了本技术指南的背景部分介绍的方法调整流动相组成适应梯度延迟体积以外,Transfer Tool 还可以补偿 GD 差异激活工具中的考虑梯度延迟体积 (GD) 复选框, 出现新行, 此处当前方法和计划方法均可以输入 GD

11,Method Transfer Tool 可以通过延迟梯度时间为梯度延迟较小的系统做自动补偿如果线性梯度的开始时间为 0 分, 计算工具就在进样后引入一段等度时间 ( 图 12) 因此, Method Transfer Tool 可确保用户可以确认目标 GD, 补偿方法转换的微小差异, 实现方法间的无缝转换需要特别注意的是, 根据梯度体积原则, 柱外体积必须使用与 GD

9 9 图 10. 根据梯度 - 体积原则, 当前方法 (A) 的梯度表适合加权法 (B) 当使加权因子 B = 1 时, 软饮料分析的调整梯度表如图 10 所示根据梯度 - 体积原则, 由于色谱柱尺寸从 mm,5 µm( 填充 4.5 µm 固定相 ) 变化到 mm,2.2 µm, 流速从 1.5 ml/min 减少到 ml/min, 所以总运行时间从 29.0 min 减少到 4.73 min 当使加权因子 B = 2.5, 分离时间进一步减少到 1.89 min 梯度时间相应地进行了调整图 5 中显示洗脱顺序的变化, 在方法转换过程中可以保持梯度的分离性能 Method Transfer Tool 的附加功能除了本技术指南的背景部分介绍的方法调整流动相组成适应梯度延迟体积以外,Transfer Tool 还可以补偿 GD 差异激活工具中的考虑梯度延迟体积 (GD) 复选框, 出现新行, 此处当前方法和计划方法均可以输入 GD 假设当前方法在 GD 为 1000 μl 的四元液相系统中运行当 B = 1 时, 应用将被转换到 GD 为 400 µl 的二元液相系统中计算者将该值与最佳 GD 进行对比 ( 方程 11) Method Transfer Tool 显示新应用方法的最佳 GD 为 70 µl 当 GD 为 50 µl 时 ( 小于最佳 GD), 梯度比原来的方法更容易影响色谱结果利用方程 11,Method Transfer Tool 可以通过延迟梯度时间为梯度延迟较小的系统做自动补偿如果线性梯度的开始时间为 0 分, 计算工具就在进样后引入一段等度时间 ( 图 12) 因此, Method Transfer Tool 可确保用户可以确认目标 GD, 补偿方法转换的微小差异, 实现方法间的无缝转换需要特别注意的是, 根据梯度体积原则, 柱外体积必须使用与 GD 相同的因数按比例进行缩小柱外体积的定义是在没有色谱柱的情况下, 自动进样器和检测器之间的体积自动进样器后的所有连接管直径必须降至最低值这样才能确保即使使用常规的 HPLC 也能有效应用 UHPLC 色谱柱方程 11: t D GD GD, opt 图 11. GD 较大时, 计划方法采用延迟进样和增加平衡时间 t D GD, opt GD = 进样延迟和 / 或附加梯度步的延迟 (min) = 最佳梯度延迟体积 (µl) = 输入的梯度延迟体积 (µl) = 流速 (µl/min) 在本例中, 较大的 GD 不仅影响色谱柱中实际的流动相比例, 还影响色谱柱平衡时间因此, 建议延迟进样并延长平衡时间请注意, 在图 11 的示例中, 建议的延迟进样时间 (0.517 min) 和最后增加的平衡时间相同 ( min) 图 12. 进样后,Translator Tool 通过增加一段等度洗脱对较低的 GD 加以补偿如果线性梯度开始时间为 0 分钟, 则增加一个梯度洗脱

10 10 建议采用的平衡时间根据输入的色谱柱参数, 计算色谱柱平衡时间建议的色谱柱平衡时间, 用于典型的反相梯度分析具有挑战性的梯度应用可能需要大大延长平衡时间图 13. 建议采用的平衡时间在梯度表下方两个不同场景的计算有所不同考虑梯度延迟体积 ( 方程 12) 时 : 在不考虑梯度延迟体积时, 采用方程 11: 方程 11: t D GD GD, opt 方程 12: T Re g 5C T GD T Reg C ε T = 平衡时间 (min) = 几何柱体积 (ml) = 0.65; 平均总孔隙度图 14. 利用 Method Transfer Tool 计算的当前 ( 紫色 ) 和计划 ( 绿色 ) 方法的分析时间洗脱液使用量和样品用量由于方法转换而节省的流动相样品和时间采用突出显示

消耗和节省快速方法具有几点优势 : 更快的分离分析速度更少的流动相和样品消耗这三点优势显示在梯度表正下方的 Method Translation Tool 中在将计算时间洗脱液和样品用量时, 需要将样品个数也考虑在内 ( 见图 7) 软饮料分析示例中, 将 HPLC 方法转换成 UHPLC 方法节省了 93% 的流动相和 92% 的样品采用 B = 1, 样品处理量增加了 6.

11 消耗和节省快速方法具有几点优势 : 更快的分离分析速度更少的流动相和样品消耗这三点优势显示在梯度表正下方的 Method Translation Tool 中在将计算时间洗脱液和样品用量时, 需要将样品个数也考虑在内 ( 见图 7) 软饮料分析示例中, 将 HPLC 方法转换成 UHPLC 方法节省了 93% 的流动相和 92% 的样品采用 B = 1, 样品处理量增加了 6.1 倍与传统 LC 方法相比,B = 2.5 时, 较高的流速使处理量增加了 15.3 倍 ( 图 14) 结论本技术指南介绍了从 HPLC 方法到 UHPLC 方法转换所需的理论背景 Thermo Scientific Method Transfer Tool 使不同方程之间相当复杂的转换关系更容易理解, 同时支持 12 种操作语言除了基本参数, 它还提供了有价值的功能, 即关于如何处理变化的梯度延迟体积数据采集速率的调整, 以及色谱柱平衡时间的调整, 使其成为对于任何 HPLC 或 UHPLC 用户来说都具有价值的工具该工具是免费的, 可以在这里下载参考文献 1. Halász, I.; Endele, R.; Asshauer, J. J. Chromatogr., A 1975, 112, Snyder, L.R.; Dolan, J.W.; Grant, J.R. J. Chromatogr., A 1979, 165, Gilroy, J.J.; Dolan, J.W. LC/GC Europe, 2004, 17(11), Schellinger, A.P.; Carr, P.W. J. Chromatogr., A 2005,1077, Poole, C.. The Essence of Chromatography; Elsevier Science: Amsterdam, The Netherlands, 2003; pp Hanai, T.T. HPLC: A Practical Guide; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, U.K., 1999; pp Bear, J. Dynamics of luids in Porous Media; Dover: Mineola, NY, 技术指南 Thermo isher Scientific Inc. 保留所有权利 ISO 为 International Standards Organization 的商标所有其它商标的所有权均归 Thermo isher Scientific 及其子公司所有本文件信息旨在呈现 Thermo isher Scientific 的产品能力, 不鼓励以侵犯他人知识产权的任何方式使用这些产品产品规格 Thermo isher Scientific, Sunnyvale, CA USA 通过 ISO 9001:2008 认证术语以及定价有可能随时变更并非各个产品在所有国家均有售详情请咨询当地销售代表非洲澳大利亚奥地利比利时巴西加拿大中国 ( 国内免费电话 ) 丹麦欧洲 - 其他芬兰法国德国印度意大利日本韩国拉美中东荷兰新西兰挪威俄罗斯 / 独联体新加坡瑞典瑞士台湾英国 / 爱尔兰美国 TN70828_E 11/13S Thermo isher Scientific 旗下品牌

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CHCN_5989_5672.qxd.qxd 将传统方法转移成使用安捷伦 Poroshell 色谱柱的快速方法进行人参分析应用报告医药作者 Rongjie Fu 安捷伦科技 ( 上海 ) 有限公司中国上海浦东英伦路 4 号邮编摘要本文实验将使用 4.6 5 mm,5 µm 色谱柱进行人参分析的传统方法转移到了 Agilent Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱上在线速度相同的情况下, 所需梯度时间从