<4D F736F F D E616C2DA4A4B0EAC2E5C3C4A46ABEC7C0E7BE69BEC7A874BAD3A468AF5A20BAD3A468BDD7A4E520A473AD57A5CAA7EFB5BDB0AAAA6FA14B>

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1 中國醫藥大學營養學系碩士班碩士論文山苦瓜改善高油高糖餵食大鼠腹部體脂堆積及胰島素抗性 Wild Bitter Melon Ameliorate Abdominal Fat Accumulation and Insulin Resistance in High Fat High Sugar Fed Rats 研究生 : 洪雅雯撰 Ya - Wen Hong 指導教授 : 趙蓓敏博士 Pei - Min Chao, Ph. D 中華民國九十五年六月 June, 2006

2 目錄縮寫對照表..I 組別縮寫意義.. III 摘要...IV Abstract....VI 第一章前言...1 第二章文獻回顧...2 一 過氧化體與過氧化體活化增殖接受器...2 ( 一 ) 過氧化體 Peroxisome... 2 ( 二 ) Peroxisomal fatty acid β oxidation....2 ( 三 ) 過氧化體增殖劑 Peroxisome proliferators.3 ( 四 ) 過氧化體增殖劑活化接受器 Peroxisome proliferator - activated receptor...3 二 脂肪細胞生合成 Adipogenesis...11 ( 一 ) 脂肪細胞生合成的 In vitro 模式.11 ( 二 ) 脂肪組織來自 Multipotent stem cells.12 ( 三 ) 脂肪細胞生合成的過程...13 ( 四 ) 脂肪細胞生合成的轉錄調控...16 ( 五 ) 刺激脂肪細胞生合成的因子...27 ( 六 ) 抑制脂肪細胞生合成的因子...28 三 脂肪細胞是內分泌器官影響胰島素抗性.33 ( 一 ) Secretory function of adipose tissue 33 ( 二 ) Insulin resistance...34 ( 三 ) Adipocytokines..36 四 代謝症候群 Metabolic syndrome..43 ( 一 ) Characteristic of metabolic syndrome 43 ( 二 ) Definition of metabolic syndrome...44

3 五 苦瓜 Momordica charantia...46 ( 一 ) 苦瓜的植物化學成分 (Phytochemicals)..47 ( 二 ) 苦瓜的藥理特性...48 ( 三 ) 苦瓜與 PPAR.51 ( 四 ) 抗肥胖活性 Antiobesity activity.51 ( 五 ) 台灣山苦瓜 53 第三章材料與方法.55 實驗設計...55 實驗流程設計...56 一 山苦瓜凍乾粉的製備 二 山苦瓜凍乾粉乙酸乙酯萃物 三 試驗飼料之配製 四 動物飼養 五 動物犧牲及樣品收集 六 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) 酵素活性測定 62 七 Lipoprotein lipase (LPL) 酵素活性測定 八 脂解速率測定 九 血清脂質分析...72 ( 一 ) 血清三酸甘油酯含量測定...72 ( 二 ) 血清膽固醇含量測定...73 ( 三 ) 血清游離脂肪酸測定...74 十 脂肪組織三酸甘油酯含量測定...75 十一 脂肪組織 DNA 含量測定...76 十二 鋨酸染色固定...78 十三 口服葡萄糖耐受測試 Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) 81

4 十四 禁食全血葡萄糖含量測定.81 十五 禁食血清胰島素測定.82 十六 禁食血清 Adiponectin 測定...83 十七 以北方點墨法 (Northern blot) 分析 PPARγ Adiponectin Leptin LPL 及 ADD1 / SERBP1 c mrna 表現量 84 ( 一 ) 總 RNA 之抽取.. 84 ( 二 ) RNA 電泳 ( 三 ) RNA 轉印 ( 四 ) 探針標誌 ( 五 ) 雜交反應 十八 統計分析 第四章結果...93 第五章討論 第六章結論 第七章參考文獻 附錄.185

5 表目錄表 3-1 山苦瓜凍乾粉成分分析.58 表 3-2 大鼠試驗飼料組成.59 表 4-1 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之初始體重 最終體重 攝食量 能量攝取 飼料效率及能量效率.100 表 4-2 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之絕對組織重.111 表 4-3 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之相對組織重.112 表 4-4 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之腹膜後脂肪 (RE) 的脂肪細胞直徑.113 表 4-5 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之副睪脂肪 (EP) 的脂肪細胞直徑.114 表 4-6 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之腹膜後脂肪 (RE) 所含三酸甘油酯 DNA 與每毫克 DNA 中所含三酸甘油酯含量.115 表 4-7 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之副睪脂肪 (EP) 所含三酸甘油酯 DNA 與每毫克 DNA 中所含三酸甘油酯含量..116 表 4-8 Wistar 大鼠餵食試驗飲食九週之禁食血脂質.117 表 5-1 大鼠餵食試驗飲食脂肪組織中脂質生合成基因表現.144

6 圖目錄 圖 2-1 圖 2-2 圖 2-3 圖 2-4 PPAR 之結構特徵...6 PPAR 之基因轉錄作用機制...7 脂肪細胞生合成的過程 A model of the transcriptional cascade leading to adipogenesis...25 圖 2-5 胰島素抗性 肥胖與代謝症候群之相關 44 圖 2-6 山苦瓜..54 圖 3 1 山苦瓜改善高油高糖餵食大鼠腹部體脂堆積及胰島素抗性之實驗大綱.55 圖 3 2 山苦瓜改善高油高糖餵食大鼠腹部體脂堆積及胰島素抗性之實驗流程設計.56 圖 4-1 圖 4-2 Wistar 大鼠餵食試驗飲食期間之生長曲線.118 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之腹部脂肪塊堆積重量.119 圖 4-3 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之腹膜後脂肪 (RE) 與副睪脂肪 (EP) G3PDH 酵素活性 120 圖 4-4 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之腹膜後脂肪 (RE) 與副睪脂肪 (EP) LPL 酵素活性 121 圖 4-5 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之腹膜後脂肪 (RE) 刺激與基礎脂解速率.122 圖 4-6 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之副睪脂肪 (EP) 刺激與基礎脂解速率.123 圖 4-7 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測腹膜後脂肪 (RE) PPARγ mrna 相對量..124

7 圖 4-8 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測副睪脂肪 (EP) PPARγ mrna 相對量 圖 4-9 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測腹膜後脂肪 (RE) Adiponectin mrna 相對量..126 圖 4-10 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測副睪脂 (EP) Adiponectin mrna 相對量 圖 4-11 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測腹膜後脂肪 (RE) Leptin mrna 相對量.128 圖 4-12 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測副睪 (EP) Leptin mrna 相對量 129 圖 4-13 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測腹膜後脂肪 (RE) LPL mrna 相對 130 圖 4-14 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測副睪 (EP) LPL mrna 相對量 131 圖 4-15 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測腹膜後脂肪 (RE) ADD1 / SREBP1c mrna 相對量 132 圖 4-16 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週以北方點墨法偵測副睪脂 (EP) ADD1 / SREBP1c mrna 相對量.133 圖 4-17 圖 4-18 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之禁食全血葡萄糖變化 134 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之禁食血清胰島素變化 135 圖 4-19 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之血清 Adiponectin 濃度.136 圖 5-1 Wistar 大鼠餵食試驗飲食 9 週之 GOT 和 GPT 酵素活性 149

8 附圖 1-1 五種山苦瓜品種乙酸乙酯萃物處理 24 小時對 3T3 - L1 前脂肪細胞增生之影響 附圖 1-2 五種山苦瓜品種乙酸乙酯萃物處理 48 小時對 3T3 - L1 前脂肪細胞增生之影響 附圖 1-3 TZD(BRL 49653) 處理 24 及 48 小時對 3T3 - L1 前脂肪細胞增生之影響 附圖 1-4 四種山苦瓜品種乙酸乙酯萃物處理 7 天對 3T3 - L1 前脂肪細胞分化之影響 附圖 1-5 四種山苦瓜品種乙酸乙酯萃物處理 11 天對 3T3 - L1 前脂肪細胞分化之影響 附圖 : 1 游離脂肪酸與 Conjugated linolenic acid (CLN) 脂肪酸 處理 7 天對 3T3 - L1 前脂肪細胞分化之影響..198 附圖 : 1 游離脂肪酸與 Conjugated linolenic acid (CLN) 脂肪酸 處理 11 天對 3T3 - L1 前脂肪細胞分化之.199

9 縮寫對照表 縮 寫 全 名 Acrp30 Adiponectin ACC Acetyl - CoA carboxylase ACS Acyl - CoA synthetase ACO Acetyl - CoA oxidase ADD1 Adipocyte determination and differentiation factor 1 ADSF Adipocyte - specific secretory factor ALBP Adipocyte lipid binding protein AMPK AMP - activated protein kinase AP 1 Activator Protein 1 ap2 Adipocyte specific fatty acid binding protein bhlh Basic helix loop - helix B M B i t t e r m e l o n C / EBP CCAAT / enhancer binding protein CLA Conjugated linoleic acid CLN Conjugated linolenic acid CYP4A Cytochrome P 450 4A DBD DNA binding domain D E X D e x a m e t h a s o n e ES Embryonic stem ECM Extracellular matrix FAT Fatty acid transporter FATP Fatty acid transport protein FAS Fatty acid synthase FIZZ Found in inflammatory zone G3PDH Glycerol 3 - phosphate dehydrogenase G C s G l u c o c o r t i c o i d s GLUT Glucose transporter HDL High density lipoprotein HSL Hormone sensitive lipase I

10 I L I n t e r l e u k i n IRS - 1 Insulin receptor substrates 1 LBD Ligand binding domain LPL Lipoprotein lipase LPS Lipopolysaccharide L X R L i v e r X r e c e p r o r MADS Multipotent adipose - derived stem MAPK Mitogen - activated protein kinase MIX Methylisobutylxanthine MMP Metalloproteinase NF - κb Nuclear factor - κb PAI 1 Plasminogen activator inhibitor - 1 P B P P PA R γ binding protein PEPCK Phosphenolpyruvate carboxykinase P G Prostaglandin 15d - PGJ 2 15 deoxy - delta PGJ 2 PGC Peroxisome proliferator - activated receptor γ coactivator P I 3 K P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e P K P y r u v a t e k i n a s e PPAR Peroxisome proliferator - activated receptor PPRE Peroxisome proliferator responsive element Pref 1 Pre - adipocyte factor 1 RARs Retinoic acid receptors RELMs Resistin - like molecules RXR Retionoid X receptor SCD Stearoyl - CoA desaturase SREBPs Sterol regulatory element binding proteins S R E s Sterol regulatory elements TZD Thiazolidinedione TRs Thyroid hormone receptors TNFα Tumor necrosis factor α U C P U n c o u p l i n g p r o t e i n II

11 組別縮寫意義 組別縮寫 縮寫意義 BM Wild bitter melon lyophilized powder EAE Ethyl acetate extract form wild bitter melon lyophilized powder TZD Positive control (Thiazolidinedione) HF High fat control (High fat high sugar die) LF Low fat control (Low fat diet) III

12 山苦瓜改善高油高糖餵食大鼠腹部體脂堆積及胰島素抗性 中國醫藥大學營養學系碩士班洪雅雯 摘要在亞洲, 苦瓜 (Bitter melon; Momordica charantia) 為廣泛使用的食材 已有研究指出, 苦瓜具降血糖 降血脂和抗發炎的作用, 但其作用機制與功能性成分仍不明確 近來, 有研究顯示苦瓜可活化 Peroxisome proliferator - activated receptor (PPAR)α 和 γ, 暗示苦瓜在預防和治療代謝症候群上具有應用之潛力 目前臨床廣泛使用之 Thiazolidinedione (TZD) 治療糖尿病藥物雖可改善胰島素敏感性, 但卻具有肥胖的副作用 因此, 本研究擬利用體內模式探討山苦瓜對於改善大鼠腹部體脂堆積和胰島素敏感性之功效並與 TZD 藥物做比較 實驗採用 40 隻 6 週齡雄性 Wistar 大鼠, 其中 34 隻先以含 30% 奶油的高脂飲食餵食 3 週誘導肥胖後, 分成 4 組 BM 組 ( 含 5% 山苦瓜凍乾粉之高脂飲食 ) EAE 組 ( 含 0.25% 山苦瓜凍乾粉乙酸乙酯萃物之高脂飲食 ) HF 組 ( 高脂對照 ) 及 TZD 組 ( 含 0.01% Pioglitazone 之高脂飲食做為正對照 ) 另外 6 隻大鼠餵食含 5% 新鮮大豆油 (LF 組 ) 做低脂對照 分組餵食 9 週後犧牲, 分別取腹膜後脂肪 副睪脂肪和腹股溝脂肪秤重代表腹部脂肪堆積 取腹膜後脂肪和副睪脂肪進一步分析脂肪細胞大小 三酸甘油酯和 DNA 含量 脂質生合成酵素活性和脂解速率與脂肪細胞分化相關基因表現 在實驗期間, 每隔 3 週採取尾巴血測量禁食血糖及胰島素 結果顯示,TZD 組在體重上顯著高於 LF 組 (p < 0.05), 此結果與 TZD 藥物肥胖的副作用相符合 在腹部脂肪重量方面,HF 組 EAE 組和 TZD 組都顯著高於 LF 組 (p < 0.006), 而 BM 組與 LF 組無顯著差異, 表示山苦瓜凍乾粉可以改善高脂飲食誘導的腹部體脂堆積 分離自腹膜後脂肪和副睪脂肪的脂肪細胞, 其大小比例分佈的結果顯示,BM 組與 HF 組相較之下, 有較多小的以及較少大的脂肪細胞 此外,BM 組脂肪組織三酸甘油酯堆積有減少的傾向 Glycerol 3 - phosphate dehydrogenase (G3PDH) 是脂肪細胞中重要的脂質合成酵素 BM 組與 LF 組副睪脂肪中 G3PDH 活性, 皆顯著低於 TZD 組 (p < 0.05) 在北方點墨定量結果中,BM 組副睪脂肪的 ADD1 / SREBP1c 調控脂肪酸生合成之轉錄因子 mrna 顯著低於 TZD IV

13 組 (p < 0.05) HF 組在高脂飲食下會誘發高胰島素血症, 但此現象不發生在 TZD 組和 BM 組 以上這些結果指出山苦瓜如同 TZD 藥物可改善高脂飲食誘發之高胰島素血症, 但相較於 TZD 有肥胖的副作用, 山苦瓜反而抑制腹部體脂堆積 並且山苦瓜的降體脂作用可能與抑制脂質生合成有關 然而, 本研究中使用的山苦瓜凍乾粉乙酸乙酯萃物也許劑量不足, 並沒有呈現如山苦瓜凍乾粉之效用 關鍵詞 : 山苦瓜 Peroxisome proliferator - activated receptor (PPAR) Thiazolidinedione (TZD) 腹部脂肪 胰島素抗性 V

14 Wild Bitter Melon Ameliorate Abdominal Fat Accumulation and Insulin Resistance in High Fat High Sugar Fed Rats Ya - Wen Hong Abstract In Asia countries, bitter melon (Momordica charantia; BM) is a commonly used vegetable. It had been reported that the bitter melon has hypoglycemic, hypolipidemia and anti - inflammatory effects. But its mechanism and functional component are still unknown. Recently, bitter melon was found to activate both peroxisome proliferator - activated receptor (PPAR) α and γ which may be valuable in prevention and amelioration of metabolic syndrome. The clinically used antidiabetic drug TZD (thiazolidinedione) is effective in ameliorating insulin resistance, but has side effect of obesity. In this study, the effect of wild BM lyophilized powder on anti - adiposity and insulin sensitivity in high fat diet fed rats was evaluated and compared with the antidiabetic drug TZD. We used forty Wistar male rats at the age of 6 weeks. Thirty-four rats were fed with high fat high sugar diet containing 30% butter to induce obesity, then divided into four groups: BM (a high fat diet containing 5% wild BM lyophilized powder), EAE (a high fat diet containing 0.25% EA extract from wild BM lyophilized powder), HF (a high fat diet serve as a high fat control), and TZD (a high fat diet containing 0.01% clinically used antidiabetic drug - pioglitazone, serve as a positive control). For comparison, six rats fed with a low fat diet containing 5% soybean oil serve as LF group. After 9 weeks, rats were sacrificed and abdominal fat including retroperitoneal, epididymal, and injuinal fat were excised and weighted. Epididymal and retroperitoneal fat were also used for determination of adipocyte size, triglycerides and DNA contents. The activities of enzymes participate in lipogenesis and lipolysis, and the genes expression of adipocyte differentiation markers were also determined in epididymal and retroperitoneal fat pads. At wk 0, 3, 6, 9, fasting blood was collected from tail for glucose and insulin determination. VI

15 Our results showed, the body weight gain of TZD group of rats was significantly higher than that of LF group of rats (p < 0.05), and this was in accordance with the well - known TZD side effect of obesity. HF, EAE and TZD group of rats also showed a significantly (p < 0.006) higher abdominal fat accumulation (retroperitoneal, epididymal and injuinal fat) than LF group, but there was no significant difference between BM and LF groups of rats. This result indicated that wild BM lyophilized powder was effective in inhibiting abdominal fat accumulation induced by high fat diet. The distribution of adipocytes size, isolated from retroperitoneal and epididymal fat, showed there were more smaller cells and less larger cells in BM group of rats when compared with those of HF group of rats. In addition, the triglycerides contents in adipose tissue of BM group of rats tended to be lowered. In epididymal fat, the activity of glycerol 3 - phosphate dehydrogenase (G3PDH) which is an important lipogenic enzyme in adipose tissue, was comparable between BM and LF, and significantly lower than TZD group of rats (p < 0.05). Northern blot showed that ADD1 / SREBP1c mrna, a transcription factor for regulating fatty acid synthesis, was significantly lower in BM group of rats than TZD group of rats (p < 0.05) in epididymal fat. Hyperinsulinemia induced by high fat diet was only observed in HF, but not in TZD and BM group of rats. These results indicate wild bitter melon, as well as TZD, could ameliorate insulin resistance induced by high fat diet. In contrast to the well - known obesity side effect of TZD, wild bitter melon is more beneficial in inhibiting abdominal fat accumulation. The anti - adiposity effect of wild bitter melon may be related to the inhibition of lipogenesis. However, the dose of EA extract from wild BM lyophilized powder used in this study (0.25%) may be too low to show its effect. Keywords: Wild bitter melon, Peroxisome proliferator - activated receptor (PPAR), Thiazolidinedione (TZD), Abdominal fat, Insulin resistance VII

16 第一章前言 第一章前言 代謝症候群 (Metabolic syndrome) 意指腹部肥胖 血脂紊亂 高血糖及高血壓, 已成為是世界性主要的公共健康問題, 並且是第二型糖尿病與心血管疾病的危險因子 雖然導致代謝症候群的原因還未清楚, 但目前認為高胰島素血症與腹部肥胖是主要原因 苦瓜 (Momordica charantia) 是常被用做藥物使用的植物之一 在亞洲, 苦瓜主要是栽培作為蔬菜食用 ; 在印度, 常作為治療糖尿病的傳統用藥 雖然許多研究指出苦瓜有許多藥理特性, 例如抗癌 降血糖及降三酸甘油酯等的作用, 其中以降血糖的作用最常被研究, 但這些作用機制與功能性成分並不清楚 近來, 轉活化研究顯示苦瓜可活化 Peroxisome proliferator - activated receptor (PPAR) α 和 γ,ppar 是細胞核荷爾蒙接受器之轉錄因子 已知 Fibrate 類降血脂藥物與 Thiazolidinedione (TZD) 類抗糖尿病藥物分別是 PPARα 和 PPARγ 的活化劑, 雖然 TZD 可改善胰島素敏感性, 但卻具有肥胖的副作用 畢竟這些都作為藥物治療使用, 若是能由飲食來源中來找尋出可活化 PPAR 的天然食物, 即可同時改善高血脂與高血糖 這也暗示了苦瓜可能具有同時調節葡萄糖利用與脂質代謝的潛力, 可應用於預防或治療代謝症候群 苦瓜降低血糖是已被確認的作用, 近來對苦瓜的研究轉移集中在抗肥胖的潛在作用 在 2003 年香港大學首度證實了苦瓜可抑制腹部體脂的堆積, 並推測可能藉此改善血糖, 但苦瓜對脂肪細胞型態或生合成影響並未被研究 因此, 本研究擬利用餵食高油高糖飲食誘發肥胖大鼠探討山苦瓜對於改善腹部體脂堆積和胰島素敏感性之功效, 並且與已知抗糖尿病藥 TZD 比較 1

17 第二章文獻回顧 第二章文獻回顧 一 過氧化體與過氧化體增殖劑活化接受器 ( 一 ) 過氧化體 Peroxisome 過氧化體是一小的單層膜胞器, 含有各種代謝反應如能量代謝的酵素, 而過氧化體至少含有 50 種不同酵素參與不同細胞型態的各種生物路徑 (Biochemical pathways) 1954 年 Rhodin 在腎細胞中發現 Microboies 此胞器 (1), 之後有學者利用細胞分離與顯微鏡觀察對此新胞器做鑑定 (2) de Duve 將此胞器命名為過氧化體, 即為含有氫氧代謝酵素的胞器 (1), 此酵素含有分解 H 2 O 2 (Catalase) 與生成 H 2 O 2 (H 2 O 2 generating oxidases) 的酵素 過氧化體在脂肪酸 β - oxidation 中扮演重要角色 (3), 當過氧化體生合成中基因突變時, 就會造成 Zellweger disease X - linked adrenoleukodystrophy (X - ALD) 等基因突變疾病 這些患者因過氧化體中脂肪酸的氧化作用受損, 而血液和組織中大量堆積極長鏈脂肪酸 (Very long - chain fatty acids, VLCFA)(4, 5), 因此可見過氧化體在人類生理角色上是必需的 ( 二 ) Peroxisomal fatty acid β oxidation 雖然脂肪酸能藉由不同機制發生氧化作用, 但大部分的脂肪酸是經由 β - oxidation 的方式而被降解 過氧化體與粒線體一樣都具有脂肪酸 β - oxidation 的機制, 包括了 4 個反應階段 :Dehydrogenation Hydration (of the double bond) Dehydrogenation again 與 Thiolytic cleavage (6) 透過此 4 步驟, 從每個脂肪酸水解下來的 2 - carbon unit 會形成 Acety l - CoA unit, 接著進入 Citric acid (Krebs) cycle 生成二氧化碳和水 過氧化體與粒線體的 β - oxidation system 催化不同脂肪酸及其衍生物的 β oxidation, 粒線體催化衍生自飲食包括 Palmitate Oleate Linoleate 和 Linolenate 的脂肪酸, 而過氧化體是催化 Hexacosanoic acid (C26:0) 的極長鏈脂肪 2

18 第二章文獻回顧 酸 Pristanic acid (2, 6, 10, 14 - tetramethylpentadecanoic acid) 以及 Di - 和 Trihydroxycholestanoic acid (DHCA 和 THCA) 因為過氧化體缺乏呼吸鏈與 Citric acid (Krebs) cycle, 所以脂肪酸 β - oxidation 的最終產物如 Acetyl - CoA Propionyl - CoA 和 Medium - chain acyl - CoA esters, 必需以 Carnitine esters 的形式運送到粒線體中 另外, 在粒線體中是由 Carnitine cycle 攜帶脂肪酸橫跨粒線體細胞內膜, 而在過氧化體中是藉由 ATP - binding cassette transporter (ABC transporter) 催化脂肪酸橫跨細胞膜的運送 ( 三 ) 過氧化體增殖劑 Peroxisome proliferators 1965 年 Hess 等學者首次發現到大鼠肝細胞中過氧化體增殖 (Peroxisome proliferation) 的現象 (7), 隨後在 1966 年 Svoboda 與 Azarnoff 也觀察到此現象 (8) 降血脂藥物 Clofibrate 的主要作用在降低血漿中三酸甘油酯與膽固醇濃度 (9), 有研究指出降血脂藥物 Clofibrate 會增加大鼠肝臟過氧化體中 Fatty acyl - CoA oxidizing system (10) 過氧化體增殖劑是一群包括有降血脂藥物 除草劑和 Industrial plasticisers 的化學物質 (11-13), 當給予齧齒類動物這些物質會造成明顯肝臟的過氧化體增殖如同肝細胞的增生 (Liver hyperplasia) 一樣 (14) 此現象會增加長鏈脂肪酸 Peroxisomal β - oxidation 以及 Cytochrome P 450 IV family 基因的轉錄作用 (9, 12, 15) ( 四 ) 過氧化體增殖劑活化接受器 Peroxisome proliferator - activated receptor, PPAR 1990 年,Isseman 和 Green 從小鼠肝臟 cdna library 篩選出與其它細胞核接受器的 DNA binding domain 中, 具高度保留序列相似的新類固醇荷爾蒙接受器, 並以其過氧化體增殖的特性命名之 (16) 之後其它的 PPAR 在不同物種與組織中被鑑定出 (17, 18), 這些 PPAR 在序列上具同源性 (Homology) 以及組織分佈差異 在過去十年, PPAR 的研究揭開了對脂質代謝調控的新機制, 以及對包括第二型糖尿病和肥胖這些代謝性疾病的可能分子因子 3

19 第二章文獻回顧 1. PPAR 的種類 PPAR 是屬於細胞核接受器的 Superfamily, 這些細胞核接受器包括有 Retinoic acid receptors (RARs) Thyroid hormone receptors (TRs) 以及 Steroid receptors (19) 到目前為止以不同基因轉殖並鑑定出三種 PPAR 種類, 分別為 PPARα (NR1C1) PPAR - δ / β (NR1C2) 和 PPARγ (NR1C3) 已知天然的脂肪酸以及 Fibrate 類降血脂藥物是 PPAR 的活化劑 (Activators),PPAR 調控許多對脂質與葡萄糖代謝相關的基因表現 (20) 在一些研究中發現 PPARγ agonists 在脂肪細胞分化上扮演重要決定角色, 以及是抗糖尿病藥物 TZD 的作用位置 (21, 22) (1) PPARα 已知 Fibrate 類降脂血藥是 PPARα 的活化劑,PPARα 在齧齒類動物和人類的許多組織中表現, 包括有肝臟 腎臟 心臟 骨骼肌和棕色脂肪 (18, 23), 而且也有研究指出 PPARα 在血管細胞如內皮細胞 (24) VSMCs (vascular smooth muscle cells)(25, 26) 和單核細胞 / 巨噬細胞 (27) 也有表現 (2) PPAR δ / β 目前對 PPAR δ / β 的功能鑑定仍然不明確, 已知 PPAR δ / β 廣泛表現在許多組 織和細胞中, 而在腦 脂肪組織和皮膚是高度表現 (18, 28) (3) PPARγ 目前有七種 PPARγ mrna 已被鑑定出 (29, 30), 它們都是由不同的 Initiation promoter 和 5 - terminal region (A1 A2 B C 和 D) 的五個 Exons 所剪輯, 而產生相同的 PPARγ 基因 PPARγ2 在 N - terminus 比 PPARγ1 多了 30 個氨基酸 PPARγ1 廣泛表現在許多組織中如結腸 肝臟和血管細胞, 但 PPARγ2 專一表現在脂肪組織中 (31),PPARγ3 大量表現在巨噬細胞 大腸和脂肪組織 (32),PPARγ4 和 PPARγ5 只表 4

20 第二章文獻回顧 現在巨噬細胞中而 PPARγ6 和 PPARγ7 則是在脂肪組織中可偵測得到 (33) 有研究指出 Prostaglandin (PG) - related compounds 如 15 deoxy - delta PGJ 2 (15d - PGJ 2 ) 是 PPARγ 有效的活化劑 (34) 另外在 Primary human trophoblasts 的研究指出, 氧化脂質如 9 - HODE 13 - HODE 和 15 - HETE 也是 PPARγ 有效的活化劑 (35) 已知 Thiazolidinedione (TZD) 類藥物如 Troglitazone Ciglitazone Pioglitazone 和 Englitazone 對 PPARγ 是專一性的活化劑 (36) 近來也鑑定出一些新的 PPARγ agonists 和 antagonists,triterpenoid 2 cyano 3 12 dioxooleana - 1, 9 dien 28 - oic acid (CDDO) 是 PPARγ agonists (37, 38), 而 Bisphenol diglycidyl ether (BADGE) 和 LG 是 PPARγ antagonists (39, 40) 雖然這些化合物具較少的臨床意義, 但可能對於了解 PPARγ 的生理作用以及新活化劑的鑑定是有幫助的 除了利用化學合成方式外, 在天然產物的研究中也發現一些有效的 PPARγ agonists, 例如一些藥用植物中, 從 Saururus chinensis (Saururaceae) 來的 Saurufuran A, 一些黃酮類像是 Chrysin Apigenin 和 Kampferol 以及 Glycyrrhiza uralensis (Fabaceae) 中的酚類化合物, 都是近來被發現新的 PPARγ agonists (41-43) 2. PPAR 之結構特徵 三種 PPAR isoforms 在結構和功能上有相似的特性, 是由四個 Functional domains 中的 6 個 Structural regions 所組成, 包括有 A / B C D 和 E / F N 端的 A / B domains 含有 PPAR 磷酸化反應的 Ligand - independent activation function 1 (AF - 1)(44) DNA binding domain (DBD) 或 C domain 是促進 PPAR 與目標基因上 Promoter region 的 Peroxisome proliferator responsive element (PPRE) 結合 (45) D site 是 Cofactors 的 Docking domain E domain 或 Ligand binding domain (LBD) 對 Ligand 是專一性反應, 並活化 PPAR 結合到 PPRE 上增加目標基因的表現 (28) 位在 E / F domain 的 Ligand - independent activation function 2 (AF - 2) 可吸引 PPAR cofactors, 來促進基因轉錄的活性 (46) 5

21 第二章文獻回顧 圖 2-1 PPAR 之結構特徵 資料來源 :Guo and Tabrizchi., 2005 (47) 3. PPAR 之基因轉錄作用機制 除了天然與合成的 Ligands 可活化 PPAR 外, 其它像是 Retionoid X receptor (RXR) PPRE 和 Coactivators 也在轉錄作用上扮演重要角色 (1) Coactivators / Corepressor (Cofactors) 許多做為 Coactivators 或 Corepressor 的蛋白質可調節細胞核接受器的起始或抑制轉錄作用的能力, 這些蛋白質是以 Ligand - dependent 的方式與細胞核接受器來作用 (17) 在沒有 Ligand 的情況下,Heterodimer 形式的細胞核接受器與含有 Histone deacetylase activity 的 Multicomponent co - repressors, 像是 Nuclear receptor co repressor (NCoR) 和 Silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor(smrt) 相連結 (48, 49), 在 Deacetylated 下的 Histone 會抑制轉錄作用 (50) 相反的, 像是 Steroid receptor co - activator (SRC) - 1 和 PPAR binding protein (PBP) 這些具有 Histone acetylase activity 的 Coactivators, 會啟動並誘導 Ligand 與基因轉錄序列的結合 (51, 52) 6

22 第二章文獻回顧 (2) PPRE 與 PPAR 目標基因 PPRE 序列是由 2 組 Hexanucleotides 以單一核酸間隔的 AGGTCA sequence 所組成的 Direct repeat (DR) - 1 elements (17, 53) 不同於其它細胞核接受器的 Responsive element DR - 3 和 DR - 4, 此 DR - 1 elements 具 PPAR - RXR heterodimer 專一性 當有 Ligand 結合在 LBD 時, 會促進 PPAR 與 RXR 形成 Heterodimer, 並與 Coactivators 結合到 PPRE 上, 啟動基因轉錄作用 在一些調節脂質代謝相關基因中如 Fatty acid transporter (FAT) Adipocyte lipid binding protein (ALBP) Acyl - CoA synthetase (ACS) 和 Acetyl - CoA oxidase (ACO) 都含有 PPRE 序列 (54) 圖 2-2 PPAR 之基因轉錄作用機制 資料來源 :Kota et al., 2005 (55) 7

23 第二章文獻回顧 4. PPAR 生理角色 (1) PPARα PPARα 在脂質代謝 發炎反應與動脈粥狀上都具有作用, 已知 PPARα agonists 對脂肪酸 β - oxidation 的調節扮演重要的角色 (56) 此外,PPARα agonists 藉由增加 Fatty acid transport protein (FATP) 和 Fatty acid transporter (FAT) 的表現, 刺激細胞對脂肪酸的汲取 (57) PPARα 的 Ligands 如 Fibrates 和其它 Peroxisome proliferator agents 會促進 Cytochrome P 450 4A (CYP4A) 的表現,CYP4A subclass 的 Cytochrome P 450 enzyme 催化脂肪酸的 ω-hydroxylation (58), 這些機制有益於降低三酸甘油酯的生合成 另外,PPARα 的活化會增加 Lipoprotein lipase (LPL) 的表現 (59) 和抑制肝臟中的 Apolipoprotein (apo) C III (22), 而降低三酸甘油酯濃度 PPARα 藉由調節對脂肪酸汲取和氧化反應的基因來供給能量給心肌 (60), 在心臟 PPARα 會降低脂肪酸氧化作用和抑制 LPL(61) 另外,PPARα agonists 已被指出可活化 ApoA - I 的表現 (62),ApoA - I 是高密度脂蛋白 (High density lipoprotein, HDL) 的主要 Apolipoprotein, 在周邊細胞的 Reverse cholesterol transport (RCT) 扮演重要的角色 PPARα 的活化也影響巨噬細胞其 Cholesterol efflux pump 中的 ATP binding cassette A - 1 (ABCA1) 之表現 (63), 這是 ApoA - I 調節 RCT 路徑的重要角色 一些研究顯示 PPARα 的活化會增強 Liver X recepror (LXRα) 來促進 ABCA1 之表現 (64) 因此,PPARα 和 LXRα agonists 可能具有預防或減輕動脈粥狀作用 PPARα agonists 在血管細胞中有抗發炎作用, 這些作用包括抑制細胞激素誘導 Vascular cell adhesion molecular 1 (VACAM 1) 的表現 (65), 以及增加 Endothelial nitric oxide synthase (enos) 的表現 (66) 在內皮細胞中,PPARα agonists 降低血漿中 Interleukin 6 (IL 6) 濃度以及藉由 Nuclear factor - κb (NF - κb) signaling repression 降低 VSMCs 中 Cyclooxygenase - 2 的表現 (26) PPARα 也誘發 Apoptosis(27) 和向下調節細胞激素活化的巨噬細胞中其 Tissue factor (TF) 和 Metalloproteinase (MMP) 的表現 (67, 68) 8

24 第二章文獻回顧 (2) PPAR δ / β PPARβ agonists 已發現對高血脂症 動脈粥狀硬化 肥胖 Cholesterol efflux 和肌肉中能量消耗是有益的 (69, 70) Selective PPARβ agonists 會活化 PPARβ, 顯著降低第二型糖尿病動物模式中三酸甘油酯和葡萄糖濃度 (71);PPARβ 活化棕色脂肪組織中的 Heat - producing uncoupling enzymes (Uncoupling protein, UCP1 和 3) 以及肌肉中的 UCP2, 此作用可能有益於肥胖的控制 (72) 近來有研究指出 PPARβ 與癌症的關係, 在 Gastrointestinal neoplasias 的形成中,PPARβ 做為 β catenin 和 Sulindac (NSAID) - sensitive factor 直接轉錄目標 (73), 表示 PPARβ 與小腸和結腸腫瘤形成有關 (74) 相反的, 在缺乏 PPARβ 小鼠的研究中指出,PPARβ 抑制直腸致癌物的生成 (75), 因此 PPARβ 對直腸癌的作用仍是需要進一步的研究 PPARβ 在神經系統上也具有角色, 先前研究表示 PPARβ 大量表現在中樞神經系統, 特別在前額皮質 神經節以及丘腦核仁這些地方中具高度表現 (76) Bromopalmitate 和 L 這些 PPARβ agonists 被發現可增加寡狀神經膠質細胞的分化, 顯示出 PPARβ 參與軸突的 Myelination, 也指出了 PPARβ 可能在腦中脂質代謝上扮演重要角色 (77, 78) 近來,Smith 等人培養大鼠小腦粒狀神經細胞的研究指出,PPARβ 有神經保護特性, 顯示了 PPARβ 在神經退化過程中具潛在作用 (79) (3) PPARγ PPARγ 對發炎反應與動脈粥狀有密切關係,PPARγ 在內皮細胞 血管平滑肌細胞以及巨噬細胞中的表現, 對脂質代謝的影響是值得注意的問題, 因而促進對 PPARγ 其抗發炎特性的研究 另外,PPARγ 在慢性發炎疾病如動脈粥狀硬化 關節炎和 Inflammatory bowel syndrome 也被研究,PPARγ agonists 在抗動脈粥狀硬化上也扮演重要角色的, 這些 Agonists 會促進單核球上 Scavenger receptor CD36 之表現, 增加併吞氧化型 LDL 而增加 Foam cells 的形成 (80) 在內皮細胞中,TZD 抑制黏附因子 VCAM - 1 和 Intercellular adhesion molecule (ICAM - 1) 的表現, 使動脈內膜的單核細胞堆積減少 (81) 在人類單核細胞衍生的巨噬細胞中,PPARγ agonists 抑制 9

25 第二章文獻回顧 MMP - 9 gelatinolytic activity, 而 MMP - 9 為具有斑塊脫落 (Plaque rupture) 的酵素 (82) VSMCs 在動脈粥狀硬化的形成中是最重要的角色, 而近來研究顯示其為 PPARγ agonists 的主要作用目標,TZD 藉由降低 Retinoblastoma protein 的磷酸化以及增加 Cyclin dependent inhibitor p27 的表現, 而抑制 VSMCs 的增生 (83) PPARγ agonists 在巨噬細胞脂質恆定中會調節一些基因的表現如 Apolipoprotein E (apoe)(84), 而 PPARγ agonists 也會調節巨噬細胞的細胞激素生成, 但其作用仍然不清楚 較早之前研究指出 TZD 或 15d - PGJ 2 會活化 PPARγ, 使培養的巨噬細胞大量表現各種前發炎細胞激素 (Pro - inflammatory cytokines) 如 Tumor necrosis factor α (TNFα) 或 IL 6 (85), 但這些作用在 LPS - challenged mice 中並未發現 (86) 此外, 也有研究曾指出巨噬細胞的分化是不需要 PPARγ, 顯示出 PPARγ 沒有專一性抑制巨噬細胞生成細胞激素 (87) 一些其它研究對此指出的機制包括有 1 PPARγ 抑制巨噬細胞中 ApoB - 48 receptor, 2 PPARγ 增加巨噬細胞的 Apoptosis, 3 PPARγ 藉由降低 Activator Protein 1 (AP - 1) Signal Transducer and Activator Transcription (STAT) 和 Nuclear Factor κb (NF - κb), 來抑制 Nitric oxide synthase Gelatinase B 和 Scavenger receptor A 的基因表現 (88-90) 綜合而言,PPARγ agonists 在控制發炎反應與動脈粥狀硬化上具有益處 另外也有報告指出 PPARγ 與癌症的關係, 在一些 In vivo 和 In vitro 的動物模式中發現,PPARγ 促進 Apoptosis 和細胞分化作用的特性對不同癌症如乳癌 結腸癌 前列腺癌 胰臟癌和胃癌的治療是有益的 (91) 另外還有 PPARγ 影響 Retinal disorders 的文獻指出, 在 Retinal pigment epithelial (RPE) cells 和 Bovine choroidal endothelial cells (CECs) 中,Troglitazone 抑制血管內皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor, VEGF) 誘導的 Choroidal angiogenesis,tzd 也抑制大鼠和猴子中 Choroidal neovascularization 的形成 (90) PPARγ 調節 TZD 對大鼠的 Retinal ganglion cells (RGC - 5) 之抗氧化特性 (92) 這些作用顯示 PPARγ ligands 對 Age - related 和 Diabetes - induced retinal disorders 具潛在的作用 10

26 第二章文獻回顧 二 脂肪細胞生合成 Adipogenesis 脂肪組織 (Adipose tissue) 的形成與身體能量恆定調節相關, 當能量攝取超過能量消耗時, 會使脂肪組織重量增加最後造成肥胖 (Obesity) 在細胞層次上, 正的能量平衡會刺激成熟脂肪細胞 (Adipocytes), 經由增加三酸甘油酯的儲存來調節過多的能量, 當脂肪細胞達到一個臨界大小閾值時, 會傳送訊息給前脂肪細胞 (Preadipocytes) 去刺激新的脂肪細胞產生, 來儲存過多的能量 在幼年期, 主要是經由新的脂肪細胞形成或脂肪細胞增生 (Hyperplasia) 使脂肪組織擴大, 人與囓齒類動物在生命期中具有從前脂肪細胞形成新脂肪細胞的能力, 與瘦的動物相比較下, 肥胖的動物有較多且較大的脂肪細胞 脂肪組織重量在肥胖和 Lipodystrophy 中扮演重要角色, 而肥胖又與第二型糖尿病和胰島素抗性息息相關 因此, 對於了解脂肪細胞生合成的正向與負向調節是必要的 ( 一 ) 脂肪細胞生合成的 In vitro 模式 在研究脂肪細胞生合成的 In vitro 模式中, 最常用的是分離自 Swiss 3T3 cells 的 3T3 - L1 和 3T3 - F442A 齧齒類前脂肪細胞株 (Preadipocyte cell lines)(93, 94) 另外, 衍生自 ob / ob mice 副睪脂肪的 ob17 cell line 也是常被使用到的 (95) 在 1970 年間,Green 與其團隊發展出 3T3 - L1 system 來研究脂肪細胞生合成 (94), 這些鼠科細胞的形態與增殖類似纖維母細胞 (Fibroblasts) 研究顯示, 細胞在長滿之前會在擴大生長的階段, 當長滿時接著給予 Proadipogenic agents 如胰島素 Dexamethasone 和 Phosphodiesterase inhibitor, 就會停止生長然後進入分化階段 在分化非常早期時, 因為細胞外基質和 Cytoskeleton proteins 使細胞從纖維狀變成圓形, 未成熟的脂肪細胞需要有絲分裂信號 (Mitogenic signals) 的 Clonal expansion, 此作用可增加最後已分化的脂肪細胞比例, 之後接著進入最後成熟階段變成脂肪細胞 此分化作用的 In vitro 模式與 In vivo 的過程極為相似, 因為培養的細胞會堆積脂質, 表現出成熟脂肪細胞的特徵並且具有胰島素敏感性 相反的, 因為 Catecholamine - sensitive lipolytic pathway 的調節, 在能量喪失時脂肪細胞也會 11

27 第二章文獻回顧 水解三酸甘油酯, 最後成熟的脂肪細胞具有生合成並分泌許多 Factors 的能力, 其中這些 Factors 與 Endocrine control 的能量恆定有關 在 In vivo 研究指出, 注射 3T3 - L1 或 Ob17 preadipocyte cell lines 到 Nude mice 體內中, 形成的脂肪組織與正常小鼠體內的脂肪組織是無法區分的 (96), 此結果表示 In vitro differentiated adipocytes 與 In vivo adipocytes 具有相似的機制來發生脂肪細胞生合成 近來也發展出 Human preadipocyte cell lines, 例如有分別衍生自脂肪肉瘤以及 Simpson Golabi - Behmel syndrome 嬰孩的 Human preadipocyte cell strains (97, 98), 還有新生兒肩胛骨棕色脂肪的 SV40 T - Ag transformation 來的 Brown preadipocyte cell line PAZ1 (99) 將重組的 Telomerase activity 結合 Human papillomavirus - E7 表現, 可使 Human preadipocyte 在 Immortalization 之後保留其分化能力 (100) 更近來, 也發展出分離自年幼捐贈者脂肪組織的 Multipotent adipose - derived stem (MADS) cells, 這些細胞可以維持 Ex vivo 的特性, 表示在體內有 Self - renewal 的能力, 因此可表現出正常的二倍體染色體 (Diploid karyotype), 且保持有分化為許多 Mesenchymal cell types 作用的能力 (101, 102) In vivo 中, 脂肪組織分布在許多部位, 包括在生殖器周邊的 腹膜後的以及皮下的脂肪, 分離自不同部位的前脂肪細胞有不同的脂質生合成潛力, 這個問題至今仍是未知的 除此之外, 不同部位的成熟脂肪細胞其代謝反應也不同, 例如內臟脂肪與皮下脂肪對腎上腺素所刺激的脂解反應就有所差異 因此, 建立前脂肪細胞的細胞株來研究脂肪細胞生合成是必要的 ( 二 ) 脂肪組織來自 Multipotent stem cells 進來研究指出脂肪組織來自是 Multipotent stem cells, 根據接收不同的信號 Multipotent stem cells 可分化為不同的細胞類型 在 In vitro 中 Mouse embryonic stem (ES) cells 的分化是脂肪細胞的來源之一, 可用來了解早期脂肪細胞生合成以及對調節基因和環境因子的鑑定 (103) Multipotent stem cells 也存在於成熟的組織中, 最早是從骨髓中被分離出來 (104) 在現在, 脂肪組織也可分離出 Stem 12

28 第二章文獻回顧 cells(105) 從人脂肪組織來的 Multipotent stem cells 可被誘導分化成為其它細胞類型, 包括有軟骨 (Cartilage) 骨頭和肌肉(106, 107) hmads cells 也可形成脂肪細胞, 將 hmads cells 培養在無血清促脂肪細胞生成的培養基下, 會有脂質油滴堆積以及脂肪細胞分化指標和轉錄因子的表現 (101), 特別的是會像人的脂肪細胞一樣有 Lipolytic pathway, 而能分泌出 Leptin 和 Adiponectin 人脂肪組織中的 Stroma vascular fraction 可衍生出具功能的 Cardiomyocyte - like cells Endotheliallike cells 和 Insulin - secreting cells ( ) 脂肪組織衍生的細胞也能參與骨骼肌的再生以及促進新血管形成 (111, 112), 這些顯示出衍生自脂肪組織的 Multipotent stem cells 可能對疾病的治療是重要的 ( 三 ) 脂肪細胞生合成的過程 前脂肪細胞在轉變成脂肪細胞前具維持生長的能力, 在脂肪細胞分化期間, 脂肪細胞的表型 (Phenotype) 是許多基因的表現, 此反映在早期 中期和晚期 mrna / protein markers 的表現以及三酸甘油酯堆積 (113, 114) 這些變化主要是發生在轉錄層次 (Transcriptional level) 上, 除了基因的活化之外, 這些抑制脂肪細胞生合成的或對脂肪細胞功能不需要的基因會被抑制 1. Growth arrest 前脂肪細胞株和初代前脂肪細胞一樣, 當長滿時就會停止生長 已知的兩個轉錄因子,CCAAT / enhancer binding protein - α (C / EBPα) 和 PPARγ 是有轉錄活性的脂肪細胞專一性基因 (Transactivate adipocyte specific genes),c / EBPα 和 PPARγ 似乎都與停止生長有關且對於脂肪細胞分化是需要的 McKnight 和其團隊利用 C / EBPα - estrogen receptor fusion protein 使 C / EBPα 具抗有絲分裂活性 (Antimitotic activity), 在給予 Estrogen 的活化作用下, 觀察細胞數目和 DNA 合成的結果顯示出有細胞會停止生長 (115) Darlington 等人的研究中發現 C / EBPα 會增加 p21 / SDI - 1 mrna 和蛋白質的表現, 因為 Antisense p21 / SDI - 1 可削減 C / EBPα 的生長抑制作用, 這表示 C / EBPα 具有增加 p21 / SDI - 1 表現的功能 13

29 第二章文獻回顧 Spiegelman 和其團隊指出 PPARγ 可誘發纖維母細胞和 Adipogenic simian virus 40 large T antigen transformed cells 停止生長, 在這些表現有 PPARγ 的細胞中, 因為 DP 1 的磷酸化和 Serine / threonine phosphatase PP2A catalytic subunit 表現減少而使細胞週期退去, 並伴隨 E2F / DP - 1 complex 的轉錄活性和 DNA 結合活性的減少 (116) 因此,C / EBPα 和 PPARγ 可能共同作用來使生長停止, 雖然 C / EBPα 和 PPARγ 在脂肪細胞分化期間顯著地增加表現, 但在前脂肪細胞中的低表現能夠在分化之前調節使細胞停止生長 2. Clonal expansion 當長滿時而停止生長之後, 前脂肪細胞必須受到適當的 Mitigenic signals 和 Adipogenic signals 的組合來繼續之後的分化步驟 在前脂肪細胞株的研究顯示, 停止生長的細胞會進行細胞分裂發生 DNA 複製和細胞增殖, 來使細胞複製放大 對 3T3 - F442A 和 Ob17 細胞而言, 細胞分裂增加與晚期 mrna markers 的表現有關, 而抑制細胞分裂會防止脂肪細胞的形成, 但是 Primary human preadipocytes 即使培養在含有絲分裂抑制劑條件下, 還是能正常發生分化作用 (117) 這表示了對培養的 Cell line system 而言, 需要依賴外來的刺激使長滿後的細胞進行有絲分裂, 但對分離自脂肪塊的前脂肪細胞, 其在 In vivo 就已發生了與之後脂肪細胞發展階段相關的細胞分裂 3. Early changes in gene expression Lipoprotein lipase (LPL) mrna 的表現通常作為脂肪細胞分化的早期指標, LPL 是由成熟的脂肪細胞所分泌且在控制脂質堆積上扮演重要的角色 (118) C / EBPs 和 PPARγ 這兩個轉錄因子在脂肪細胞分化早期就被誘導,C / EBPs 和 PPARγ 的早期表現與之後參與最後分化的 Adipocyte specific genes 有關 (119) PPARγ 的表現在荷爾蒙誘導分化作用之後會快速地增加, 在 3T3 - L1 脂肪細胞分化的第 2 天期間就能測得 PPARγ 而且在成熟脂肪細胞中達到最大的表現 PPARδ 的誘導似乎在 PPARγ 之前, 但是 PPARδ 的表現是廣泛分佈的, 在各種組織中和一些培養的細胞 14

30 第二章文獻回顧 株中包括 CH310T1 / 2 3T3 - C2 和 NIH 3T3 都能測得 C / EBPβ 和 C / EBPδ 短暫的增加是在 PPARγ 表現增加之前,C / EBPβ 和 C / EBPδ 在早期和中期分化階段之後會減少並伴隨誘導 C / EBPα mrna 的表現, 在 Adipocyte specific genes 表現之前 C / EBPα 會輕微地增加表現 (120) 在脂肪細胞分化期間, 細胞從纖維狀變成圓形並且在形態上 Cytoskeletal components 和 Extracellular matrix (ECM) components 的濃度和型式有明顯的改變 許多 Cytoskeletal 和 ECM components 對脂肪細胞分化影響的研究指出脂肪細胞轉錄因子的特徵, 這些變化可能是影響脂肪細胞分化期間 PPAR 或 C / EBPs 的表現和作用 4. Late events and terminal differentiation 在分化的最後階段, 培養中的脂肪細胞主要增加 De novo lipogenesis ( 脂質生合成 ) 和對胰島素的敏感性 一些參與三酸甘油酯代謝的酵素包括有 ATP citrate lyase Malic enzyme Acetyl - CoA carboxylase (ACC) Stearoyl - CoA desaturase (SCD1) Glycerol 3 - phosphate acyltransferase Glycerol 3 - phosphate dehydrogenase (G3PDH) Fatty acid synthase (FAS) 和 Glyceraldehyde 3 - phosphate dehydrogenase, 它們的活性 蛋白質和 mrna 表現增加了 10 ~ 100 倍 (121),Glucose transporters Insulin receptor 的數量和胰島素敏感性也都增加 在脂肪細胞分化期間,β 1 - adrenergic receptors 的減少以及 β 2 - 和 β 3 - subtypes 的增加, 增加了 Total adrenergic receptor 的數量 除了與脂質代謝相關蛋白質的 mrna 增加外, 脂肪細胞也合成其它脂肪組織專一性產物, 包括 Adipocyte specific fatty acid binding protein (ap2),fat / CD36 這個 Fatty acid transporter 以及 Perilipin 這種 Lipid droplet - associated protein 除此, 脂肪細胞還生成一些 Secreted products 包括有作為 Angiogenic agent 的 Monobutyrin 屬於 Serine protease complement factor D 的 Adipsin Acrp30 / AdipoQ PAI - 1 和 Angiotensiongen II (122) PPARγ 和 C / EBPα 共同活化一些基因的表現包括了 ap2 GLUT4 SCD1 Phosphenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) 和 Leptin (123) 15

31 第二章文獻回顧 圖 2-3 脂肪細胞生合成的過程 資料來源 :Feve., 2005 (120) ( 四 ) 脂肪細胞生合成的轉錄調控 已知有許多促進或抑制脂肪細胞生合成的轉錄因子會影響脂肪細胞生合成, 一些 In vitro 和 In vivo 的研究顯示出, 脂肪細胞生合成的調控是一連串的 Transcription cascade 在脂肪細胞發展過程中, 有三個主要直接影響脂肪細胞生合成的轉錄因子, 分別是 PPARγ C / EBPs 和 The basic helix loop - helix family (ADD1 / SREBP1c) 16

32 第二章文獻回顧 1. 轉錄因子 (1) PPARγ 1 Role of PPARγ in adipocyte differentiation 先前已知 TZD 是 PPARγ 的 Ligands, 而 Kletzien 等人發現 TZD 可以啟動脂肪細胞生合成 (124) PPARγ 最早是在哺乳動物中被發現 (125), 但 Spiegelman 發現脂肪細胞專一的 PPARγ 並在其團隊的研究也顯示出 PPARγ 主要在脂肪細胞生合成期間被誘導, 而且大量表現在脂肪組織中 (126, 127), 因此 Lehmann 等人鑑定出 TZD 是 PPARγ 高親和力的 Ligand (21) Tontonoz 等人將纖維母細胞利用 Retrovirus 異位表現 PPARγ 的 Gain of function 研究最先指出,PPARγ 在脂肪細胞生合成中的重要角色 (128) 除此, 在脂肪細胞生合成的過程中需要有 PPARγ 的存在, 當 C / EBPα 在沒有 PPARγ 的存在下是無法誘發脂肪細胞的分化, 但 PPARγ 在沒有 C / EBPα 下能誘導脂肪細胞分化 (129), 此表示 PPARγ 對脂肪細胞分化是主要的調節者 在 Adipose cell - selective fatty acid binding protein ap2 的模式中, 其 5 flanking region 被鑑定是轉錄的起始, 此 Enchancer 可開啟培養的與基因轉殖小鼠的脂肪細胞中 Promoter 的基因表現 (130) Tontonoz 等人鑑定出此 Region 是 ARF6 與 ARE6 和 ARE7 結合的 Cis - acting elements, 並指出 PPARγ 與 RXR 這個 Heterodimer 可與 ap2 基因的 5 flanking region 結合 (126, 131) PPARγ 除了誘導 ap2 基因的表現外, 也會活化許多其它 Adipocyte specific genes 的 Promoter, 在脂肪細胞中 PEPCK 的表現需要有 PPARγ 的結合 (132) 在培養的脂肪細胞與基因轉殖小鼠 In vivo 的研究也發現, 一些脂肪細胞中其 Promoter 的活化是需要 PPARγ, 但在其它組織中並不需要 (133) 許多 Loss of - function 研究也指出 PPARγ 對脂肪細胞生合成的重要性 最早在 1999 年, 完全剔除胚胎 PPARγ 的小鼠在胚胎期 10 ~ 10.5 天期間, 因為不正常的胎盤形成而胎死腹中 (134, 135) 由於囓齒類動物的脂肪細胞生合成大部份是發生在出生之後, 為了解決 PPARγ - / - embryo 無法存活的問題,Rosen 等人利用 Wild - type ES cells 與完全剔除 PPARγ 的 ES cells 製造出 Chimeric mice, 這些小鼠可存活下來並有正常的組織發育 (136) 因為 ES cell genotype 可干擾 PPARγ 對形成其它特異細胞類型或 17

33 第二章文獻回顧 器官發展的需要, 因此得知 PPARγ 對於早期胎盤的形成是需要的 Rosen 等人也觀 察了 Wild - type 和 PPARγ - / - ES cell 的 In vitro 分化發現到,PPARγ + / + cells 可發生脂 肪細胞生合成, 而 PPARγ - / - cells 不會堆積脂質 表現分化指標或有胰島素敏感性 另外 Barak 等人利用正常的 Tetraploid cells 來校正胎盤的缺失來製造 Chimeric embryos, 這些小鼠在出生後可短暫存活下來, 且在解剖後發現沒有棕色或白色脂肪組織 (137),Heterozygous PPARγ - deficient mice 與高脂飲食的 Wild - type mice 相較下, 其副睪脂肪 腹膜後脂肪和周邊脂肪塊重量是減少的, 且有增加的胰島素敏感性 Cre - loxp 策略是用來產生專一性剔除組織 PPARγ 的表現, 這些小鼠都有相似的特徵, 像是全身脂肪塊重量減少的脂肪萎縮 (Lipodystrophy) 以及胰島素抗性 目標專一性降低脂肪組織中 PPARγ 活性的 Knockout 小鼠, 皮下和副睪脂肪塊會逐漸減少, 血漿游離脂肪酸與三酸甘油酯增加, 且血漿 Leptin 和 Adiponectin 減少 (138) 選擇性破壞 PPARγ2 會使腹膜後脂肪 腹股溝脂肪和生殖器周邊脂肪減少 (139) 利用 Neomycin - resistant gene cassette 對序列轉錄干擾, 來降低脂肪組織中 PPARγ2 和 PPARγ1 表現的 PPARγ Hypomorphic mice, 也發現有脂肪萎縮的現象 (140) 目標專一性剔除肌肉組織中 PPARγ 的小鼠, 會慢慢形成胰島素抗性且會增加脂肪組織重量 (141), 上述這些小鼠模式清楚的指出 PPARγ 對脂肪細胞生合成的重要性 2 Adipose as the target tissue for insulin sensitizing effects of PPARγ ligands 一些囓齒類與人類的基因研究指出 PPARγ 的活化具有胰島素敏感性作用 在 PPARγ 基因上有 Pro12Ala 基因多型性的人有較好的胰島素敏感性 (142), 在一些少數病人身上發現,Heterozygous mutation 的 PPARγ 會造成嚴重的胰島素抗性 (143) 此外, 抑制小鼠 PPARγ 的 Serine122 磷酸化可增加 PPARγ 活性, 使其不會發生因肥胖所致的胰島素抗性 (144), 出乎意料地發現缺少其中一個 PPARγ 對偶基因的小鼠, 比正常小鼠有較好的胰島素敏感性 (145), 但這個原因尚不清楚, 有可能是削減了基因抑制作用, 因而降低在缺乏 Ligands 時 PPARγ 的表現 不管如何,PPARγ 最佳活性的表現決定於其作為胰島素敏感性轉錄調節者的作用 (146) 18

34 第二章文獻回顧 TZD 是 PPARγ 專一性的 Ligands, 而脂肪組織是一內分泌器官且大量表現 PPARγ, 在低血糖且嚴重脂肪萎縮的小鼠中,TZD 是沒有作用的 (147), 這顯示出脂肪組織是 TZD 作用的主要位置 TZD 可改善肌肉和肝臟中的胰島素敏感性 (148), 雖然 PPARγ 在骨骼肌中表現很低, 但專一剔除肌肉中 PPARγ 的小鼠有肝的胰島素抗性現象, 然而, 在給予 TZD 之後能有效反轉其胰島素抗性 (141) 相反的, 另一個專一剔除肌肉中 PPARγ 模式的小鼠有肌肉的胰島素抗性現象, 但給予 TZD 並未改善其肝臟的作用 (149) 雖然其它組織可能也具角色, 但目前研究顯示脂肪組織是 TZD 作用的主要位置, 藉由改變 Adipose factors 的分泌, 在肌肉和肝臟中有間接的胰島素敏感性作用 3 PPARγ regulation of adipocyte genes that modulate insulin sensitivity 一些脂肪細胞的內分泌產物會改變周邊組織特別是肌肉和脂肪的胰島素敏感性, 已知 PPARγ ligands TZD 影響胰島素敏感性作用中的多種脂肪細胞基因 脂肪細胞會分泌一些多胜肽, 這些與葡萄糖恆定和胰島素敏感性有關, 包括有 TNFα IL - 6 Leptin Adiponectin 和 Resistin, 這些基因表現會受到 TZD 的調節 (150) 另一個 TZD 主要的作用是降低循環的游離脂肪酸, 而游離脂肪酸顯示與肥胖所致的胰島素抗性有關 (151) TZD 同時向上調節脂肪細胞中游離脂肪酸汲取相關基因如 LPL 和 FATP (152), 以及游離脂肪酸再回收相關基因如 PEPCK 和 Glycerol kinase (GyK)(132) 的表現 因此,TZD 藉由對增加脂肪細胞汲取游離脂肪酸以及降低釋出到循環中, 因而降低血清游離脂肪酸濃度 (2) CCAAT / enhancer binding protein (C / EBP) family C / EBPs 是屬於 Basic - leucine zipper 的轉錄因子, 已知有六種 Isoforms, 每一種都有高度保留的 bzip domain 以 Homo - and / or heterodimers 的類型作用 (119), 其 Basic DNA - binding domain 與 Regulatory element 結合在下游基因的 Promoters 或 Enhancers 上 C / EBPs gene 的表現會調節三種蛋白質 (α β δ), 它們的組織分佈並不侷限於脂肪組織中, 大部分表現在脂肪與肝臟 它們有相似的 DNA - binding 19

35 第二章文獻回顧 activities, 而且在它們的 Promoters 上有 C / EBP regulatory elements 的 Trans activating reporter gene C / EBP protein 在顆粒白血球 (Granulocytes) 和肝細胞的最後分化作用上也扮演角色, 另外 C / EBPs 對感染反應的抗性也有重要角色 (114) C / EBPs 可調節許多層次包括了細胞中 mrna 表現的轉錄作用,In vitro 中 camp 已知是脂肪細胞生合成的 Inducer, 能夠同時增強 C / EBPα 和 C / EBPβ 的表現 在脂肪細胞生合成期間, 一些 C / EBP family membranes 的表現是受到調節, 近來在 Gain - and loss of - function 研究中指出, 這些蛋白質深深影響脂肪細胞的發展 在培養的前脂肪細胞株誘導分化時,C / EBPβ 和 δ 其 mrna 和蛋白質是最早且短暫的表現,C / EBPα 則在分化後期的階段被誘發出來, 並可轉活化一些 Adipocyte specific gene 的 Promoters (119) In vitro 的 Gain of - function 研究清楚表示了 C / EBPβ 和 δ 的 Proadipogenic 角色, 在沒有荷爾蒙的誘導下, 異位表現 C / EBPβ 能夠誘發 3T3 - L1 cells 的分化作用 對 C / EBPδ 而言, 仍是需要有促分化藥劑的存在, 但 C / EBPδ 可加速脂肪細胞生合成 C / EBPβ 也能促進一些細胞分化成為脂肪細胞, 異位表現 C / EBPβ 的 NIH - 3T3 纖維母細胞在荷爾蒙的誘導下可進行脂肪細胞生合成, 當胚胎的纖維母細胞缺少 C / EBPβ 或 δ 時, 會輕微降低脂肪細胞生合成的潛力, 但是當細胞同時缺少 C / EBPβ 和 δ 時, 會嚴重阻礙纖維母細胞發展成脂肪細胞 (120) In vitro 的研究也強烈顯示出 C / EBPα 在脂肪細胞生合成之角色,Retroviral 表現 C / EBPα 的 3T3 - L1 前脂肪細胞或纖維母細胞可被誘導分化成為成熟的脂肪細胞, 而當這些細胞表現有 C / EBPα antisense RNA 時, 會抑制其分化作用 (153) (3) ADD1 / SREBP1c Adipocyte determination and differentiation factor 1 (ADD1) 是 Basic helix loop - helix (bhlh) 的轉錄因子,bHLH protein 有組織專一性的調節作用, 特別是在肌肉中, 與脂肪有共同的 Mesodermal origin ADD1 是根據與 E - boxes motif (CANNTG) 這個 bhlh protein 的 DNA recognition site 結合能力, 從大鼠脂肪細胞 cdna 中分離出來的 (154),ADD1 高度表現在棕色脂肪, 其次是白色脂肪, 肝臟和腎 20

36 第二章文獻回顧 臟 Sterol regulatory element binding proteins (SREBPs) 調節膽固醇與脂肪酸代謝相關基因的轉錄作用 (155),Yokoyama 等人依據與 Sterol regulatory element 結合能力所獨立選殖出來與 ADD1 相同的轉錄因子, 命名為 Sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) 在哺乳動物中有三種 SREBPs, 分別是 SREBP1a SREBP1c 和 SREBP2 ADD1 與 SREBP1c 的 Amino terminus 是相同的 (156),ADD1 / SREBP1c 有同時與 Sterol regulatory elements (SREs) 和 E - boxes 結合的 Dual DNA - binding specificity Kim 與 Spiegelman 將 ADD1 / SREBP1c mrna 表現在前脂肪細胞株中發現可明顯誘導刺激分化作用, 表示了 ADD1 / SREBP1c 在脂肪細胞生合成之角色 (157) 高度表現 ADD1 / SREBP1c 的 3T3 - L1 cells 在有荷爾蒙的誘導分化下, 與控制組相比較有增加的 Adipocyte marker 表現以及脂質堆積 此外, 異位表現 ADD1 / SREBP1c 的纖維母細胞在強力誘導分化下會有一些脂肪細胞的轉變, 這些都指出 ADD1 / SREBP1c 與脂肪細胞生合成有關 ADD1 / SREBP1c 的脂肪細胞生合成功能的機制目前還是不清楚, 而一些研究指出與 PPARγ 有關 Kim 與 Spiegelman 在 PPARγ reporter system 中共同表現 ADD1 / SREBP1c 與 PPARγ 發現有更大的轉錄活性, 但單獨表現 ADD1 / SREBP1c 則是少的作用 (157), 另一解釋為 ADD1 / SREBP1c 會生成一些因子而增加了 PPARγ 的活性 Kim 等人利用顯性抑制 ADD1 / SREBP1c 來阻斷脂肪細胞的分化, 但當給予 PPARγ ligands TZD 時可完全回復其分化 綜合而言, 這些結果顯示 ADD1 / SREBP1c 促進內生性 PPARγ ligand 的生成 (158) 雖然 ADD1 / SREBP1c 對脂肪細胞生合成的影響尚不清楚, 但已知 ADD1 / SREBP1c 刺激許多脂質生合成與醣解酵素基因的表現, 這些基因包括有 LPL Fatty acid synthase (FAS) ACC Spot 14 或 Pyruvate kinase (L - PK) 和 Glycerol phosphate acyltransferase (159, 160) 當飢餓後再餵食會刺激脂肪組織中 ADD1 / SREBP1c 的表現而促進脂質生合成,ADD1 / SREBP1c 剔除的小鼠會對餵食後脂質生合成的反應遲鈍, 而胰島素可調節再餵食的作用, 因此強力地調節脂肪與肝臟中 ADD1 / SREBP1c 的表現 (161, 162) 21

37 第二章文獻回顧 (4) 其它轉錄因子 近來有一些其它轉錄因子可能與脂肪細胞生合成有關, 但是這些轉錄因子並沒 有像 PPARγ 與 C / EBPs 一樣是影響脂肪細胞形成的主要調節者, 它們可能是做為對 脂肪細胞發展與功能上某些層面之調節者 1 PPARδ PPARδ 是廣泛表現的, 一些研究顯示利用非專一的 PPAR 活化劑給予某些異位表現 PPARδ 的纖維母細胞, 可促進脂肪細胞生合成 (163), 但其它的研究指出, 以各種 Ligands 來活化異位表現 PPARδ 的細胞並不會促進脂肪細胞生合成 Berger 等人用 PPARδ ligands 給予內生性表現有 PPARδ 的 3T3 - L1 cells, 發現並沒有誘導脂肪細胞的形成 (71) 由這些研究可知 PPARδ 對脂肪細胞生合成的角色仍然是不明確的 2 GATA family GATA - 2 和 GATA - 3 這兩個 GATA family 的轉錄因子, 是參與發展過程的 Zinger - finger DNA-binding protein, 它們表現在前脂肪細胞中並在最後成熟作用期間被向下調節 GATA - 2 和 GATA - 3 的重組表現會抑制脂肪細胞分化, 此對脂肪細胞生合成的抑制作用可能是透過降低 PPARγ 活性來調節的 此外, 缺乏 GATA 3 的 EC cells 可增強分化為脂肪細胞的能力 ; 在基因的肥胖小鼠, 其脂肪組織中 GATA - 2 和 GATA - 3 的表現顯著地被向下調節 (164) 3 FOXC2 轉錄因子 FOXC2 在脂肪細胞中對基因表現是 Pleiotropic action, 一些研究指出這個蛋白質可能在脂肪細胞發展與代謝中扮演重要角色 過度表現 FOXC2 的小鼠其脂肪組織有瘦的表型且會增加胰島素敏感性, 並增加了脂肪細胞中 β - adrenergic respronsiveness 以及氧消耗 (165) 22

38 第二章文獻回顧 4 Olf - 1 / early B - cell factor (O / E - 1) O / E - 1 是 Helix loop - helix 的轉錄因子, 大量表現在 B 淋巴細胞 神經細胞和脂肪組織中 (166),O / E - 1 控制 B 淋巴細胞專一性的基因以及轉錄調控 Olfactory receptor neurons 中的基因 ( ) 有研究指出 O / E - 1 參與脂肪細胞中 GLUT4 基因的調控 (169), 但其在脂肪細胞生合成中的角色仍然未知 Akerblad 等人以 Retrovirus 感染 3T3 - L1 cells NIH - 3T3 和 MEF cells 使其表現 O / E - 1, 發現了在誘導分化 2 天之後 PPARγ2 ap2 G3PDH 和 GLUT4 這些 Adipocyte specific gene 有較高的表現, 且 O / E - 1 可刺激最後脂肪細胞的分化作用 另外, 顯性抑制 3T3 - L1 cells 中 O / E - 1 的表現會降低其最後分化為脂肪細胞的能力, 而且一些在分化期間的 Adipocyte specific gene 如 G3PDH Adipsin 和 GLUT4 表現會下降, 也發現了 ap2 PPARγ1 和 γ2 以及 C / EBPα 表現減少 這些結果顯示出 O / E - 1 直接參與脂肪細胞的最後分化而且也參與了脂肪細胞發展的起始作用, 指出了 O / E - 1 在脂肪細胞生合成中扮演新的 Initiator 和 Stimulator 之角色 (170) 5 Liver X receptor α (LXRα) 近來研究顯示 LXRα 這個細胞核接受器與脂質和膽固醇代謝的調節有關 (171, 172),LXRα 主要表現在與脂質代謝相關的組織中, 如肝臟 脂肪組織 腎臟和脾臟 在肝臟中 LXRα 的表現是受 PPARα 的調節 (173), 而在巨噬細胞中會受 PPARγ 的調節 (174) Juvet 等人對 LXRα 在脂肪組織中的角色之研究, 指出 LXRα 對成熟脂肪細胞中調控脂質堆積的角色, 並暗示了 LXRα 與 PPARγ 在脂質代謝中的關連性 其發現給予 PPARγ agnoists 會向上調節 Obese Zucker rats Human adipocytes 和成熟 3T3 - L1 adipocytes 中 LXRα 的表現 ; 在分化中的 3T3 - L1 adipocytes 給予 LXRα agnoists 之後, 會增加其脂質堆積的情況 另外, 給予內生性 LXRα agnoists 會增加成熟 3T3 - L1 adipocytes Human adipocytes 和剔除 LXRα 小鼠中 LXRα 的表現, 也會增加脂質生合成基因的表現 (175) 23

39 第二章文獻回顧 LXRα 是否直接參與脂肪細胞分化的過程還是不確定的 Seo 等人研究了 LXRα 在脂肪細胞分化的角色, 在分析脂肪細胞分化期間的活化作用發現到, 以 LXRα agnoists 處理 3T3 - L1 preadipocytes 3T3 - F442A preadipocytes 和 Primary human preadipocytes, 會促進脂肪細胞分化加速油滴堆積並增加一些 Adipocyte specific gene 如 PPARγ 和 ap2 的表現 另外, 利用 EMSA 分析活化的 LXRα 是否會直接結合到 PPARγ promoter 上, 其結果發現 PPARγ 是 LXRα 新的 Target gene 這些結果顯示 LXRα 藉由調節脂質生合成與 Adipocyte specific gene 表現, 而參與脂肪細胞分化作用 (176) 2. A transcription network 在對脂肪細胞生合成的研究顯示出有一個轉錄調控網的模式, 這是與 C / EBPs 和 PPARγ 連續的活化作用有關,C / EBPβ 和 δ 在此模式中主要功能之ㄧ是誘發 PPARγ 的表現 在較早階段,C / EBPβ 和 δ 內生性的表現是在 PPARγ 之前, 而 C / EBPβ 和 δ 的異位表現則誘發出 PPARγ 的表現 (177), 此誘導作用是透過在 PPARγ promoter 中 C / EBP binding sites 的直接轉錄作用 異位表現 PPARγ 的 Gain of function 之研究或應用專一性 PPARγ ligands 誘導 C / EBPα mrna 之研究指出了, PPARγ 有誘導 C / EBPα 的反應 當胚胎纖維母細胞或胚胎幹細胞完全缺乏 PPARγ 時, 這些細胞無法變成脂肪細胞, 它們雖然有正常 C / EBPβ 和 δ 的表現, 但 C / EBPα 的表現極低 然而,C / EBPα - / - 的纖維母細胞其 PPARγ 的表現減少, 且培養在荷爾蒙誘導劑中無法快速形成脂肪細胞, 當以 Retroviral vector 把 C / EBPα 送入到這些細胞中時, 回復了 PPARγ 以及分化的能力 此顯示出在 PPARγ 和 C / EBPα 互相增強表現作用的 Cascade 中, 有一個 Positive feedback loop, 表示了一旦開始分化,Cascade 會維持這些主要因子的表現一直到最後的分化階段 另外, 可能是有 C / EBPs 和 PPARγ 的上游 下游或以平行方式來促進或維持脂肪細胞生合成, 而 ADD1 / SREBP1c 在此模式中扮演這樣的角色,ADD1 / SREBP1c 會誘導 PPARγ 表現以及經由生成內生性 Ligands 來活化 PPARγ (121) 24

40 第二章文獻回顧 到底 C / EBPs 與 PPARγ 在脂肪細胞生合成中的作用是平行且相互增強的, 或是只是由其中一個因子調控脂肪細胞生合成, 然後再與其它因子調節整個過程? 已知的是 PPARγ 可以刺激大部分但並非全部 C / EBPα - deficient cells 的脂肪細胞生合成,C / EBPα - deficient cells 可以堆積脂質且表現大部分脂肪細胞生合成的指標, 因為有較低的胰島素接受器和 IRS - 1 的表現以及在胰島素傳訊中缺乏 Postreceptor, 而有差的胰島素敏感性 另外, 也知道 PPARγ 和 C / EBPα 具協同作用, 可活化在分化過程中相關基因之表現 (118), 此協同作用的機制仍不清楚, 但許多脂肪細胞基因同時有 C / EBP protein 與 PPARγ / RXR 的 Binding sites, 例如 PEPCK (132) 和 ap2 (126), 此可能顯示出一般轉錄調節者的相互作用 最後綜合而言,PPARγ 在脂肪細胞生合成中是絕對需要的, 但 C / EBPα 則是扮演輔助的角色, 主要是提升 PPARγ 在細胞中的表現 另外,C / EBPα 也在維持已分化的脂肪細胞其胰島素敏感性中扮演重要角色 (178, 179) 圖 2-4 A model of the transcriptional cascade leading to adipogenesis 資料來源 :Rosen., 2005 (180) 25

41 第二章文獻回顧 3. Coactivators of transcriptional regulation by PPARγ and C / EBPs 為了活化其下游基因, 轉錄因子會與其 Coregulators 結合來修飾染色質結構以及調節它們轉活化特性, 這作用是由一群稱為 Coactivators 的蛋白質以 Temporotemporal manner 調節, 可能影響脂肪細胞分化的過程 (181) PPARγ 會和 p160 family CBP / p300 或其它的 Coactivators 相互作用, 當有 Ligands 結合時, 這些 Coactivators 結合到 PPARγ 的 Carboxy - terminal AF - 2 domain 有兩種主要類型的 Coactivator complex, 分別為 p160 / CBP / p300 complex 以及 DRIP / TRAP complex 第一種類型有 SRC - 1 / NCoA1 TIF2 / GRIP1 / NCoA2 和 pcip / ACTR / AIB1 (116), 這些蛋白質除了結合在 PPARγ 的 AF - 2 domain 外, 也會和 CBP / p300 相互作用, 而 CBP / p300 可直接和 PPARγ 作用因此使 Complex 更穩定 第二種類型有 DRIP / TRAP / ARC complex 會以 Ligand dependent 的方式與細胞核接受器相互作用 (114), 其中對轉錄活化作用的 Complex 是 DRIP205 / TRAP220, 此 Complex 與 PPARγ binding protein (PBP) 一樣是以 PPARγ 誘導利用 Yeast two - hybrid screen 所選殖出來的 兩種 PPARγ 的 Coactivators 分別是 PPARγ coactivator - 1 和 - 2 (PGC - 1, - 2), 它們不是 Ligand dependent 但顯示有生物專一性,PGC - 1 是以 PPARγ 誘導利用 Yeast two - hybrid screen 從棕色脂肪中所選殖出來的 ;PGC - 2 是以 Amino - terminal AF - 1 domain 誘導利用 Two - hybrid screen 從白色脂肪 Library 中所選殖出來的 較少知道有與 C / EBPs 相互作用的 Coactivator complex, 已知有兩種類型的 Coactivators 會與 C / EBPβ 相互作用 (181), 一種是 Chromatin remodeling SWI /SNF complex, 其存在於骨髓細胞中活化一些基因 ; 第二種是 CBP / p300 coactivator, 其因為也是 PPARγ 的有效 Coactivator, 所以 CBP / p300 可能對 C / EBPs 與 PPARγ 之間的協同作用是重要的 26

42 第二章文獻回顧 ( 五 ) 刺激脂肪細胞生合成的因子 1. Glucocorticoids (GCs) Rubin 等人利用 Dexamethasone (DEX) 這個合成的 GCs, 來作為 3T3 - L1 cells 的 DEX / MIX differentiation cocktail 的成分, 而且 DEX 也常用在其它前脂肪細胞株和衍生自齧齒類或人類脂肪塊初代前脂肪細胞的分化上, 在 PPARγ 和 C / EBPα 的 Transfection 研究中 (182),DEX 可以誘導纖維母細胞分化為脂肪細胞 在 3T3 - L1 cells 中,GCs 誘導 C / EBPδ 的表現,C / EBPδ 的增加可能是因為 C / EBPδ 與 C / EBPβ heterodimers 的形成, 然後接著使 PPARγ 表現 在 Ob1771 前脂肪細胞的研究中,GCs 的調節作用是透過增加 Arachidonic acid 的代謝使得 Prostacyclin 的生成增加, 然後增加細胞內的 camp (177, 178, 183) 2. Methylisobutylxanthine (MIX) MIX 加速前脂肪細胞株和初代前脂肪細胞的分化,MIX 就像是 GCs 一樣, 常用在各種前脂肪細胞的分化上,MIX 會增加 C / EBPβ 的表現, 而且此增加對於之後 PPARγ 的表現以及脂肪細胞分化是需要的 MIX 作用的明確方式還未了解, 已知 MIX 是抑制 Phosphodiesterases 以及競爭抑制 A1adenosine receptor, 也藉由阻斷 Inhibitory regulatory protein G1 來刺激 Adenylyl cyclase 的活性, 這表示 MIX 可能是透過增加 camp 的方式來作用 (113) 3. 其它 在脂肪細胞生合成的早期階段 MEK / ERK signalling pathway 的 Transient activation, 對促進分化過程的轉變似乎是重要的 (184) Bost 等人利用 ERK1 - / - mice 的研究指出缺少此蛋白質會減少脂肪細胞, 而且可以抑制高脂飲食誘導的肥胖與胰島素抗性, 在培養從 ERK1 - / - mice 的前脂肪細胞中發現其脂肪細胞生合成是受阻的 (185) 27

43 第二章文獻回顧 p38 mitogen - activated protein kinase (MAPK) 對脂肪細胞生合成也是需要 的,p38 的活化促進前脂肪細胞自發性的分化作用 (186), 在脂肪細胞中, 胰島素可 以刺激 p38 的活性 (187) ( 六 ) 抑制脂肪細胞生合成的因子 1. Protease inhibitors : highly active antiretroviral therapy Highly active antiretroviral therapy 是對 HIV / AIDS 病人體脂分布與代謝問題的治療方法, 這些病人有胰島素抗性 血脂紊亂 周邊脂肪肥大 (Lipohrpertrophy) 的現象 (188) 在細胞培養的研究指出一些 Protease inhibitors 尤其是 Nelfinavir 和 Indinavir, 會降低前脂肪細胞分化與脂質生合成, 且增加 Apoptosis 和脂解作用 ( ) 近來,In vitro 研究指出 Efavirenz 這個 Non - nucleoside reverse transcriptase inhibitor 可強力地抑制脂肪細胞分化期間脂質的堆積, 而此現象與 SREBP1c 顯著向下調節有關 (194) 2. WNT family WNT family 經由 Autocrine 或 Paracrine 的方式影響許多細胞種類的發展, 異位表現 WNT1 gene 抑制脂肪細胞生合成 (195) WNT 完全抑制 PPARγ 和 C / EBPα 的表現, 相反的在前脂肪細胞中抑制 WNT signaling 可有自發性的分化作用, 表示了前脂肪細胞會產生內生性的 WNT 而抑制分化 一些研究指出 WNT10b gene 高度表現在前脂肪細胞中並隨著分化時間而向下調節, 缺乏 WNT10b 可增加 Myofibers 中脂質堆積並且增加 Myoblasts 的脂肪細胞生合成潛力, 相反的若是過度表現 WNT10b 則抑制白色與棕色脂肪組織的形成 (196) 28

44 第二章文獻回顧 3. Pre - adipocyte factor 1 (Pref - 1) Pref - 1 是屬於 Epidermal growth factor - like repeats containing transmembrane proteins (197), 其高度表現在前脂肪細胞中, 並在脂肪細胞分化期間表現會隨之減少, 且在成熟脂肪細胞中偵測不到 Pref - 1 的表現, 過度表現 Pref - 1 會抑制 3T3 - L1 cells 的脂肪細胞生合成 (198) 有新的研究指出, 將 Soluble form 的 Pref - 1 表現在小鼠脂肪組織或肝臟中, 會降低脂肪組織的重量並增加胰島素抗性 (199); 另一研究也指出,Pref - 1 knockout mice 會出現肥胖 (200) 這些研究顯示 In vivo 中,Pref-1 是負向的調節者 5. Cytokines 發炎細胞激素包括有 Tumour necrosis factor α (TNFα) Interleukin - 1 (IL 1) IL - 6 IL - 11 Leukaemia inhibitory factor Interferon - γ Oncostatin M 和 Ciliary neurotrophic factor (CNTF) 都與抑制脂肪細胞生合成有關 ( ) 例如 IL - 1 會抑制 3T3 - L1 cells 分化以及骨髓 Stroma - derived H 1 / A cells 的脂肪細胞分化 ;Interferon - γ 和 IL - 1 抑制 3T3 - derived preadipocyte cell lines 和 Primary rodent preadipocytes 的脂肪細胞分化 TNFα 減少 LPL 合成以及抑制脂肪細胞分化, 當長期以高劑量的 TNFα 給予成熟脂肪細胞一段時間, 會使細胞質內的脂質減少, 並有類似前脂肪的表型 除此, 給予 TNFα 會快速地降低 PPARγ 的 mrna 和蛋白質表現, 也同時降低 PPARγ DNA binding activity, 並也有減少的 C / EBPα 和 ap2 表現, 此顯示 TNFα 影響成熟脂肪細胞作用的機制可能是向下調節 PPARγ TGF β 也是一種細胞激素, 在大部分的細胞培養模式中,TGF - β 對脂肪細胞分化是有效的抑制劑, 而 TGF - β 抑制脂肪細胞分化的可能機制是藉由增加 ECM components 的合成 在 In vitro 中 TGF - β 會刺激前脂肪細胞的增生並抑制脂肪細胞生合成, 當小鼠過度表現 TGF - β 時會減少脂肪組織的 這些 TGF - β 抑制脂肪細胞分化的作用是受轉錄因子 SMAD3 所調節, 來阻斷 C / EBPα 和 PPARγ 的表現 (120) 29

45 第二章文獻回顧 6. Dietary factors (1) Medium - chain triglycerides (MCTs) 雖然大部分的脂肪酸如 Linoleic acid 會增加人脂肪細胞中三酸甘油酯的儲存, 但已知ㄧ些脂肪酸會抑制脂肪細胞生合成 飲食的 MCTs 降低齧齒類動物的脂肪細胞數目及大小 (204), 此作用可能與抑制脂肪細胞生合成, 以及降低 PPARγ C / EBPα 和 ADD1 / SREBP1c 基因與蛋白質的表現有關 (205, 206) 臨床上, 給予含有 MCTs 飲食的受試者可降低體脂, 但此作用是因為 MCTs 影響脂肪酸的氧化作用 (2) Conjugated linoleic acid (CLA) CLA 是 Linoleic acid (18 : 2 n6) 的異構物, 主要的兩種異構物為 c9, t11 和 t10, c12, 在反芻動物腸道中經由細菌作用而產生 在動物研究中 t10, c12 CLA 顯示會降低體脂重量並增加瘦體重量而改變體組成 (207) 許多 In vitro 研究指出, 給予 CLA 異構物會抑制脂肪細胞中的脂質堆積, 以 t10, c12 CLA 處理 3T3 - L1 adipocytes 會減少細胞內三酸甘油酯含量 (208), 在人脂肪組織 SV cells 的初代培養中也有相同的結果 (209) CLA 的抑制脂肪細胞生合成作用之機制仍然不清楚, 有研究發現 t10, c12 CLA 下降 3T3 - L1 preadipocytes 中 PPARγ 和 ap2 的表現, 以及降低 Primary human preadipocytes 中 PPARγ C / EBPα 和 ap2 的表現 (210) Guanlund 等人研究 t10, c12 CLA 影響脂肪細胞中脂質堆積的分子機制, 其發現 t10, c12 CLA 同時抑制 3T3 - L1 cells 和 Human adipocytes 的脂質堆積, 也發現即使 t10, c12 CLA 不是 PPARγ ligands 但卻可以降低成熟脂肪細胞中 PPARγ 的活化, 以及向下調節 PPARγ 及其下游基因如 ap2 和 LXRα 的表現 這些結果指出在脂肪細胞生合成期間,t10, c12 CLA 是做為 PPARγ 的調節者來降低 3T3 - L1 adipocytes 中 Adipogenic marker gene 的表現, 因而抑制脂肪細胞中脂質堆積 (211) 接著 Guanlund 等人繼續探討是否 t10, c12 CLA 向下調節脂肪細胞分化期間所有的 Adipogenic marker gene 表現, 以及給予脂肪細胞 t10, c12 CLA 的時間與處理時間的長短如何影響脂質的堆積 其結果顯示在分化早期 ( 分化第 0 到 6 天 ) 給予 t10, c12 30

46 第二章文獻回顧 CLA, 向下調節 PPARγ 和 C / EBPα 表現, 當增加處理時間 ( 分化第 0 到 11 天 ) 則會抑制 PPARγ 下游基因如 LXRα ap2 和 CD36 的表現 這些結果指出了 t10, c12 CLA 抑制脂肪細胞分化期間的脂質堆積, 此與分化早期的 PPARγ 和 C / EBPα 以及晚期的 LXRα ap2 和 CD36, 這些 Adipogenic marker gene 之間的相互調節有關 (212) (3) Flavonoids Flavonoids 是大量存在於植物和水果中的酚類化合物, 大部分對 Flavonoids 的研究都在其抗氧化活性上 Kuppusamy 和 Das 發現一些 Flavonoids 對 Primary rat adipocytes 有 Epinephrine - induced lipolysis 的作用 (213, 214), 另外 Shusheva 和 Shechter 發現 Quercetin 這種 Flavonoids, 藉由抑制 Insulin receptor tyrosin kinase 阻斷了胰島素調節的脂質生合成 (215) 這些 Flavonoids 對大鼠脂肪細胞中潛在的脂解與抑制脂質生合成作用, 顯示出 Flavonoids 可能降低脂肪組織的重量或抑制脂肪細胞生合成 Genistein 是具有生物活性多酚類的 Flavonoids, 可預防心血管疾病 卵巢癌 前列腺癌 骨質疏鬆和更年期症狀, 近來有研究指出 Genistein 對一些脂肪細胞有抑制脂肪細胞生合成的作用, 但其作用機制仍不清楚 (216) Harmon 等人的研究指出,Genistein 抑制長滿前與長滿後 3T3 - L1 preadipocytes 增生, 其抑制脂肪細胞生合成的作用是發生在誘導分化之後的前 72 小時期間, 當發生分化時給予 Genistein, 會經由降低 C / EBPβ 與其下游的 Adipogenic transcription factors 的表現與活化而阻斷脂肪細胞的形成 (217) 已知 AMP - activated protein kinase (AMPK) 調控能量的恒定, 而且也促進 Apoptosis (218, 219), 之前研究指出 Genistein 會抑制脂肪細胞分化, 另外一些研究指出某些天然化合物誘發 Apoptosis 促進體脂的減少 (220) 因此,Hwang 等人假設 Genistein 會抑制脂肪細胞分化與誘發成熟脂肪細胞 Apoptosis 是透過 AMPK signaling 其研究指出,Genistein 是透過 AMPK 的活化以及誘發脂肪細胞的 Apoptosis, 而具有脂肪細胞分化的抑制作用, 同時也指出綠茶多酚 EGCG 和紅辣椒多酚 Capsaicin 可以抑制 3T3 - L1 adipocytes 的分化 (221) 31

47 第二章文獻回顧 Procyanidins 也是 Favonoids 的一種, 先前有研究指出 Grape seed procyanidin extract (GSPE) 調節脂肪的代謝, 且 PPARγ 在 GSPE 對脂肪細胞的脂解作用中扮演重要角色 (222) Pinent 等人研究了 GSPE 是否影響 3T3 - L1 cells 的脂肪細胞生合成, 並且是首次指出 GSPE 會干擾 3T3 - L1 adipocytes 一開始的分化, 以 GSPE 處理 3T3 - L1 cells 後分化的 24 小時期間,Adipocyte specific gene 如 G3PDH 會下降以及 Pref - 1 的表現會增加 ; 在 Microarray 分析中發現 GSPE 向下調節分化早期中與細胞週期以及生長相關的基因表現 這些結果顯示了 GSPE 主要影響分化而干擾脂肪細胞生合成, 並且 Procyanidins 可能在抑制脂肪細胞形成上扮演一新角色 (223) 32

48 第二章文獻回顧 三 脂肪細胞是內分泌器官影響胰島素抗性 Adipose tissue as an endocrine organ : impact on insulin resistance 一直以來, 脂肪組織被認為只是儲存過多能量而造成肥胖的器官, 但近幾年顯露出脂肪細胞會分泌一群信號因子並同時表現有這因子的接受器, 指出脂肪組織不僅是能量儲存的器官, 也會分泌一大群蛋白質, 這些分泌出的蛋白質稱作 Adipokines 或 Adipocytokines (224) 在現在認為脂肪組織參與調節體重恆定 葡萄糖與脂質代謝 生殖 免疫 血壓控制 纖維蛋白溶解 (Fibrinolysis) 血液凝固以及血管生成 (Angiogenesis) 等作用, 許多 Adipocyte - secreted proteins 顯示出對脂肪組織重量變化的調節, 例如過度餵食 (Overfeeding) 以及脂肪萎縮 (Lipodystrophy), 因此指出了與肥胖之相關性 胰島素抗性通常與體重增加有關, 而 Adipocyte - secreted proteins 在肥胖下會改變且影響胰島素敏感性 (225) ( 一 ) Secretory function of adipose tissue 脂肪組織的內分泌活性 (Endocrine activity) 首先被 Siiteri 所提出, 其表示此活性是組織有分泌固醇類荷爾蒙的能力 (122), 特別是直到 Leptin 的發現之後, Adipocyte secreted proteins 才被重視 脂肪組織分泌的蛋白質廣泛地包含有酵素如 LPL 或 Hormone sensitive lipase (HSL) 荷爾蒙如 Leptin 或 Adiponectin 以及細胞激素如 IL - 6 或 TNFα, 還有其它結構的和功能的相關胜肽如 Adipsin 或 Plasminogen activator inhibitor - 1 (PAI - 1) 脂肪組織的內分泌作用參與脂質代謝中的產物生合成, 例如 Perilipin ap2 Cholesteryl ester transfer protein (CETP) 和 Retinol - binding protein (RBP) 另外, 脂肪組織也被認為可產生參與免疫與血壓反應中的免疫因子如 Acylation - stimulating protein (ASP) 和 Metallothionein (226) 近來, Angiotensinogen (Agt) Adiponectin PPARγ angiopoietin - related protein / fasting - induced adipose factor (PGAR / FIAF) 以及 C - reactive protein (CRP), 這些 Adipocyte - secreted proteins 對心血管功能控制的重要角色已被證實 (227) 脂肪組織也具有 Autucrine paracrine 的功能, 這些 Adipocyte - secreted proteins 也與其它 33

49 第二章文獻回顧 因子的分泌有關, 例如 PPARγ Insulin like growth factor - 1 (IGF - 1) Monobutyrin 和 Uncoupling proteins (UCPs) 雖然有一些脂肪組織所分泌的因子不被認為是典型的 Adipocytokines, 但至少如固醇類和 Leptin 這些由脂肪組織合成並分泌的荷爾蒙是確定的 Adipocytokines (224) ( 二 ) Insulin resistance 肥胖, 特別是中央型肥胖 (Central obesity) 與胰島素抗性相關, 許多研究探討其相關性的機制, 例如肌肉與肝臟中脂質堆積以及近來發現的 Adipocytokines 胰島素抗性會減弱對胰島素的生理反應, 是第二型糖尿病的重要特徵也與脂肪萎縮有關, 並且是代謝症候群的重要因素 1. The insulin signaling cascade 胰島素是胰臟 β cells 合成的重要代謝荷爾蒙, 會刺激各種器官對葡萄糖的汲取, 特別是肌肉 脂肪組織和肝臟, 並抑制脂肪組織的脂解作用 胰島素傳訊路徑的起始步驟是胰島素與胰島素接受器 (Insulin receptor) 結合在具胰島素敏感性組織的細胞膜上, 胰島素接受器是由兩個 Insulin - binding extracellular α subunits 和兩個主要的 Intracellular β subunits 組成的橫跨細胞膜的 Heterotetrameric receptor (α 2 β 2 )(228) 胰島素與 α subunits 結合會使本身的 Tyrosine kinase 活化 胰島素接受器自體磷酸化以及胰島素傳訊路徑中主要蛋白質 Insulin receptor substrates 1 (IRS - 1) 磷酸化 (229, 230), 此作用會發生細胞內一連串的反應, 包括有 Phosphatidylinositol - 3 (PI - 3) kinase 酵素的活化 葡萄糖轉運子 GLUT4 從細胞囊泡位移到細胞膜上來增加細胞對葡萄糖的汲取, 接著在最後改變一些對肝糖與三酸甘油酯有關的酵素活性, 此反應不是增加合成就是減少分解 34

50 第二章文獻回顧 2. Metabolic links between obesity and insulin resistance 胰島素傳訊路徑中專一性缺失會使胰島素調節的葡萄糖汲取受損, 其機制可能是胰島素敏感性組織中脂質過度供給而造成胰島素抗性 腹部區域的脂肪堆積被認為是全身性胰島素抗性的主因 (231), 相反的周邊脂肪組織似乎與不利的代謝結果無關, 而且可能具保護性 在 In vivo 研究中, 使用 Hyperinsulinemic - euglycemic clamp 來直接測量正常或過重女性其胰島素敏感性, 發現了中央腹部脂肪比全身 四肢或軀幹脂肪更是決定胰島素敏感性的因子 (232) 在非脂肪組織具胰島素敏感性的器官如肌肉和肝臟中, 脂肪酸的堆積會減少這些組織中胰島素調節的葡萄糖汲取 (The lipid supply hypothesis of insulin resistance)(233); 雖然一般認為脂肪酸氧化作用抑制的影響使葡萄糖氧化作用減少 (The Randle hypothesis), 近來也有其它研究提出脂質種類誘發胰島素抗性的機制 (234) 除了脂肪酸的作用外, 脂肪細胞生成的荷爾蒙也會調節胰島素作用, 近幾年提出的 Adipocytokines 或 Peptide messengers, 包括有 Adiponectin Resistin TNFα 以及 Leptin 都是與肥胖以及胰島素抗性相關 (150, 235) 3. Hormone and drugs influencing insulin sensitivity 一些臨床與動物研究顯示, 增加交感神經系統的活性會導致胰島素抗性 在分子層次上,β - adrenergic activation 抑制對胰島素作用的胰島素信號分子如 IRS protein, 而且 β - adrenoceptor 刺激作用是強力促進脂解, 使血清游離脂肪酸濃度增加, 隨後抑制胰島素信號而造成胰島素抗性 (236) 除了 β - adrenergic agonists 外, 各種 Adipocytokines 包括有 IL - 6 和 TNFα, 以 Actocrine 機制刺激脂肪細胞的脂質來增加全身游離脂肪酸濃度而導致胰島素抗性 (235) 高胰島素血症 (Hyperinsulinacmia) 與周邊胰島素抗性相關, 是主要造成發展成第二型糖尿病並且向下調節胰島素信號分子, 因此破壞了血清胰島素增加促進胰島素敏感性的作用 In vivo 中,Glucocorticoids 導致胰島素抗性, 但是在肥胖中造成胰島素抗性的 Glucocorticoids 濃度範圍仍不清楚 此外, 在 In vivo 和 In vitro 中,Growth hormone 強力地抑制胰島素敏感性的組織如肌肉 脂肪組織和肝臟中胰島素的作用, 因此長期給予 Growth hormone 的大鼠會有胰島素抗性並伴隨有胰島素接受器活性和 IRS 35

51 第二章文獻回顧 protein phosphorylation 的減少 (237) TZD 類藥物包括有 Troglitazone Pioglitazone 和 Rosiglitazone, 是臨床上普遍用來治療第二型糖尿病, 可增加胰島素敏感性, 在分子層次上 TZD 是 PPARγ 的專一性 Ligand 且作用在脂肪組織中 (238) 雖然 TZD 促進胰島素敏感性的機制尚未完全了解, 但已知是 TZD 的作用是經由影響體脂肪來調節的 PPARγ 的活化會增加前脂肪細胞的增生與分化, 而形成成熟的脂肪細胞, 特別是非內臟的 ( 周邊的 ) 脂肪 在皮下的 (Subcutaneous) 脂肪細胞中, 脂肪酸儲存增加會造成 Lipid steal, 導致較低循環的脂肪酸以及減少肌肉和肝臟中三酸甘油酯濃度 (239) 因為周邊皮下脂肪堆積而使體重增加是 TZD 普遍的副作用,TZD 同時促進脂肪細胞的脂肪細胞生合成以及脂肪酸的汲取, 也藉由改變脂肪細胞荷爾蒙生成, 使 Adiponectin 和 TNFα 減少 (235, 240) ( 三 ) Adipocytokines 1. Interleukin - 6 (IL - 6) (1) Modulators of IL - 6 production IL - 6 是具多功能循環的細胞激素, 由許多細胞種類如纖維母細胞 內皮細胞 單核球細胞 巨噬細胞 T - cell lines 以及脂肪細胞所生成的分子量 21 ~ 28 kd 的蛋白質 (241) 最初是被鑑定為 Leukocyte - derived proinflammatory protein, 因為約 10% 全身的 IL - 6 是由脂肪組織所分泌, 所以此蛋白質也屬於 Adipocytokines (242) 在囓齒類動物與人的脂肪細胞中,IL - 6 的生成是受 Catecholamines 刺激而被 Glucocorticoids 所抑制 (243) 另一個刺激 IL - 6 釋放的因子是 TNFα, 有研究顯示 TNFα 會增加 3T3 - L1 adipocytes 中 30 倍的 IL - 6 生成 有研究指出培養的脂肪細胞會分泌 IL - 6 並發現有 mrna 的表現,Omental fat 比皮下脂肪組織產生 3 倍多的 IL - 6, 且分離自 Omental fat 的脂肪細胞也比分離自皮下的分泌較多的 IL 6 (244) 36

52 第二章文獻回顧 (2) IL - 6 in obesity and insuline resistance IL - 6 會干擾胰島素敏感性,Omental fat 分泌的 IL - 6 直接進入到肝臟, 可能刺激肝的三酸甘油酯分泌, 此外藉由降低 IRS - 1 和 PI3K 的活化使 IL - 6 直接損害初代大鼠肝細胞和 3T3-L1 preadipocytes 中的胰島素傳訊, 也破壞肝細胞中胰島素誘導的醣質新生 (245, 246) 在囓齒類動物與人的 In vivo 研究中, 給予重組的 IL - 6 會降低肝的醣質新生, 接著導致高血糖 (Hyperglycaemia) 和補償性高胰島素血症 (Compensatory hyperinsulinacmia) 在胰島素抗性與肥胖的鼠科動物及人類中, 血漿 IL - 6 濃度顯著地被向上調節, 而且基礎值下的 IL - 6 濃度與形成第二型糖尿病的風險是互相獨立的 (241) 2. Tumor necrosis factor α (TNFα) (1) Modulators of TNFα production 最初 TNFα 被認為是巨噬細胞分泌的產物, 為代謝失調的慢性發炎反應與惡性瘤中的細胞激素 (237),TNFα 有許多生物作用包括有誘發胰島素抗性 厭食以及體重減少 脂肪組織同時也會分泌 TNFα 並且是其作用目標 (247); 在巨噬細胞和單核球細胞中,TNFα 的表現與生成是受內毒素如 Lipopolysaccharide (LPS) 所刺激 LPS 會刺激人脂肪組織以及 In vitro 中的脂肪細胞產生 5 倍的 TNFα,TZD 會降低肥胖齧齒類動物脂肪細胞中 TNFα 的釋放, 但對 In vitro 中人的脂肪組織並不影響 (248) 脂肪酸或三酸甘油酯也會調節 TNFα 的表現, 在 In vivo 中高脂飲食會使脂肪組織中 TNFα mrna 表現顯著增加, 而且缺乏 ap2 的小鼠其脂肪組織中不表現 TNFα, 表示脂肪酸在脂肪組織中對 TNFα 表現的調節是重要的 (247, 249) 37

53 第二章文獻回顧 (2) Relation between TNFα, obesity and insuline resistance 在齧齒類動物中,TNFα 是胰島素敏感性主要調節者,TNFα 誘發 In vitro 中 IRS - 1 的 Serine phosphorylation, 然後 Serine phosphorylated IRS - 1 抑制 Insulin receptor kinase activity 和下游信號 PI3K 的活化, 因此 TNFα 干擾胰島素傳訊導致胰島素阻抗, 此外 TNFα 誘導脂解以及向下調節 IRS - 1 和 GLUT4 在肥胖中,TNFα 以 Actocrine 方式被向上調節因此改變脂肪組織, 在 fa / fa 大鼠中 TNFα 的 Neutralisation 會改善胰島素敏感性, 但在肥胖糖尿病病人中並不會發生作用 許多基因轉殖造成胰島素抗性和肥胖的動物模式中, 包括有 ob / ob 小鼠 db / db 小鼠和 fa / fa 大鼠都有 TNFα 過度表現的現象 在人的脂肪中,TNFα mrna 和蛋白質的表現是低的, 但與身體脂肪細胞是正相關, 而且當肥胖者體重減少之後, 其表現也降低了, 但是血清 TNFα 濃度在符合 BMI 的胰島素抗性者與胰島素敏感性者之間是沒有差異的 In vivo 中 TZD 會抑制肥胖 Zucker rats 脂肪中 TNFα mrna 的表現, 表示 TNFα 可能是此藥物影響胰島素敏感性作用目標之一 (236, 237, 241) 3. Leptin (1) Modulators of leptin production 在 1994 年為了要更加了解脂肪細胞及其對能量恆定的角色, 因此發現了 Leptin (250),Leptin 是位在 Chromosome 7931 的 ob gene 之產物, 此蛋白質由 67 個胺基酸所組成 Leptin 主要表現在脂肪組織中,Leptin 作用在下視丘的 Neuropeptide - containing regions 並增加 Leptin signaling 來降低食物攝取 增加能量消耗和增加生熱作用, 因此促進體重減少 Leptin 的表現與儲存的體脂成正相關, 因此肥胖者有較高的 Leptin (251) 在禁食期間 Leptin 表現會快速減少但於餵食後可回復 胰島素 葡萄糖和 Glucocorticoids 會刺激 ob gene 的表現而增加 Leptin mrna 的表現, 而游離脂肪酸和 Growth hormone 則是抑制的作用 (252) 在分子層次上, 刺激 PPARγ 會向下調節 Leptin 生成, 但 C / EBPα 會刺激 Leptin 生成 ;In vivo 和 in vitro 中 TZD 會降低齧齒類動物脂肪中 Leptin 表現 此外,ob gene 的表現與循環的 Leptin 濃度有明顯的性別差異, 女性幾乎有高於男性二倍的 Leptin 濃度 Leptin 除了參與 38

54 第二章文獻回顧 調節食物攝取與體重控制外, 也有廣泛的生理功能, 例如葡萄糖代謝 生殖 免疫 造血 血管形成 造骨 傷口癒合以及血壓恆定 (241) (2) Role of leptin in obesity and insuline resistance 一開始對 Leptin 的了解是作為抗肥胖的荷爾蒙, 由下述研究所表示其作用的 首先, 缺乏 Leptin 的 ob / ob 小鼠和缺乏 Leptin receptor 的 db / db 小鼠會有食慾過剩 (Hyperphagia) 而增加脂肪細胞形成肥胖 降低能量消耗以及胰島素抗性 再來, 以靜脈或腦內注射 Leptin 到 ob / ob 小鼠中, 會因為抑制食物攝取和增加能量消耗而降低體重和脂肪重量 最後, 在下視丘發現的 Leptin receptor 參與調節食物攝取與能量平衡 (253) 許多肥胖者有增加的血清 Leptin 濃度, 表示肥胖呈現出 Leptin 抗性階段,Leptin 對胰島素敏感性的組織如肌肉 肝臟和脂肪組織, 它們對胰島素的反應有不一致的結果 ; 另外在臨床研究中血清 Leptin 和胰島素濃度之關連性與肥胖是獨立的 (236) 4. Adiponectin (1) Modulators of adiponectin production Adiponectin 又稱作 Acrp30 AdipoQ apm1 和 GBP28, 是近幾年由許多研究團隊以不同方式發現的,Adiponectin 是一種由脂肪組織所分泌 30 kd 循環的蛋白質 (241),Adiponectin 專一表現在脂肪細胞分化期間並沒有表現在纖維母細胞中 胰島素 IGF - 1 和 TZDs 刺激 Adiponectin 的表現, 而 TNFα 和 β - adrenergic stimulation 則是抑制 3T3 - L1 adipocytes 中 Adiponectin 基因表現 Adiponectin 參與能量平衡的調節與胰島素作用, 也有抗前發炎反應和抗動脈粥狀形成的特性, 其在心臟功能上也扮演重要角色 (254) 研究指出 Adiponectin 參與防止動脈粥狀斑塊的形成, 透過 camp - dependent pathway 降低 NF - κb singalling 來抑制單核球黏附到內皮細胞上 ; 此外 Adiponectin 也顯示經由對內皮細胞直接的作用來調節血管的發炎情況, 還有藉由降低血小板衍生因子 (Platelet - derived growth factor) 和 Heparin - binding epidermal growth factor 來降低血管平滑肌細胞增生和遷移 除此之外, 在 ob / ob 小 39

55 第二章文獻回顧 鼠和缺乏 ApoE 小鼠動脈粥狀的齧齒類模式研究指出,Adiponectin 具保護作用使這 些小鼠不會形成動脈粥狀硬化和第二型糖尿病 (236) (2) Serum and mrna levels of adiponectin in obesity and insuline resistance 血漿 Adiponectin 濃度在肥胖 胰島素抗性和第二型糖尿病的發病情況下是減少的, 在隱性糖尿病的情況下, 血漿 Adiponectin 濃度是低的且同時減少胰島素敏感性, 當發展為明顯的第二型糖尿病時這個情況仍持續發生 Adiponectin 會降低餐後上升的血漿游離脂肪酸, 而改善吸收後由胰島素調節所抑制肝的葡萄糖產生, 此顯示出血漿 Adiponectin 濃度與全身胰島素敏感性有強烈相關性 在胰島素抗性和肥胖下, 脂肪組織和血漿中 Adiponectin mrna 表現減少, 當 Adiponectin 表現增加時可改善胰島素敏感性和體重流失 In vivo 和 In vitro 的研究指出,TZD 可增加 Adiponectin mrna 的生成與分泌, 給予糖尿病患者 TZD 藥物增加了 2 倍的血漿 Adiponectin 濃度 ( ) 許多荷爾蒙會誘發胰島素抗性而向下調節 Adiponectin 表現 (225),In vitro 中 β adrenergic action 會抑制分化的 3T3 - L1 cells 其 Adiponectin mrna 表現 ; 同樣的在 In vitro 中 β - adrenoceptor agonists 向下調節 Human adipocytes 的 Adiponectin mrna 和蛋白質生成 長期給予 3T3 - L1 adipocytes 胰島素會降低 Adiponectin mrna 表現, 此與 In vivo 中禁食胰島素濃度和血漿 Adiponectin 濃度是負相關的結果相符合 Glucocorticoids 同時降低 3T3 - L1 cells 和 Human adipocytes 的 Adiponectin mrna 表現和蛋白質分泌, 此外許多研究指出以 TNFα 處理 3T3 - L1 adipocytes 和 Human primary adipocytes 之後,Adiponectin mrna 表現和蛋白質分泌都減少 ; 還有 IL 6 會向下調節 3T3 - L1 adipocytes 的 Adiponectin 分泌和 mrna 表現 綜合以上而言,Adiponectin 會受到 TZD 而向上調節, 而會被 β - adrenoceptor agonists Glucocorticoids TNFα 和 IL - 6 所抑制, 在此表示了 Adiponectin 是一重要的內生性 Insulin sensitizer (236, 237) 40

56 第二章文獻回顧 (3) Theory with regard to possible mechanism of action of adiponectin Adiponectin 的 Globular C - terminal fragement 可以降低血漿葡萄糖濃度以及增加肌肉中脂肪酸氧化作用, 這可能與 Adiponectin 影響胰島素敏感性有關 其它研究也指出 Globular fragement 與 Full length adiponectin 相較下,Globular fragement 較能增加肌肉中脂肪酸氧化作用, 因此降低血漿葡萄糖濃度, 但有研究指出在 In vivo 和 In vitro 中, 只有 Full length adiponectin 可有效增加胰島素誘導的抑制肝細胞葡萄生產生 在 Adiponectin knockout mice 研究中, 這種小鼠有受損的胰島素敏感性, 表示了 Adiponectin 是內生性的 Insulin sensitizer 最近兩種 Adiponectin receptors 分別是 AdipoR1 和 AdipoR2 被鑑定出,AdipoR1 大量表現在骨骼肌中, 而 AdipoR2 主要表現在肝臟中 這些 Receptors 似乎藉由增加 AMPK 和 PPARγ ligands 的活性, 以及增加脂肪酸氧化作用和葡萄糖汲取, 來調節 Adiponectin 的 Insulin - sensitizing action (241) 5. Resistin (1) Modulators of resistin expression 2001 年 Steppan 等人分離出 Resistin 這個新的 Adipocytokines, 其分子量為 12.5 kd,resistin 是屬於 Cysteine - rich secretory proteins 又稱為 Resistin - like molecules (RELMs) 或 Found in inflammatory zone (FIZZ) 另外 Kim 等人將這個 Adipocyte - secerted factor 鑑定為 Adipocyte - specific secretory factor (ADSF) / Resistin, 近來發現 Resistin 不僅表現在脂肪組織中也在腸胃管 腎上腺以及骨骼肌中有表現 (258) 許多會降低 Resistin 基因表現的因子包括有胰島素 TNFα Epinephrine β - adrenoreceptor stimulation TZD, 但當胰島素 β-adrenoreceptor stimulation 和 TZD 與其它因子如 Glucose Growth hormone 和 Glucocorticoids 一起作用時, 發現會增加 Resistin 表現, 因此對於 Resistin 基因表現的調節目前仍是不清楚的 (241) 41

57 第二章文獻回顧 (2) Resistin in obesity and insuline resistance 在 In vitro 中 Resistin 會抑制 3T3 - L1 cells 的脂肪細胞分化, 在棕色和白色脂肪組織中分泌的 Resistin 與脂肪大小儲存量成比例, 會降低葡萄糖耐受性與胰島素作用 Steppan 等人發現 TZD 會抑制 Resistin, 並最先指出 Resistin 對胰島素抗性的功能與肥胖和糖尿病相關, 其發現基因肥胖 ob / ob 和 db / db 小鼠與高脂飲食誘導肥胖小鼠, 牠們循環的 Resistin 濃度增加 Resistin immunoneutralization 會改善高脂飲食誘導肥胖小鼠的高血糖和胰島素抗性, 但給予正常小鼠重組的 Resistin 反而會使葡萄糖耐受性及胰島素作用受損 此外衍生自脂肪組織的 Resistin 和衍生自腸類似 Resistin 分子 (Gut - derived resitin - like molecule - β) 會選擇性破壞葡萄糖生成中的胰島素作用 (237, 259, 260) 這些研究都指出 Resistin 與調節脂肪細胞生合成和胰島素抗性有關, 因此 Kim 等人探討 Resistin 在脂肪細胞生合成以及葡萄糖恆定的功能角色, 其建構了表現有顯性抑制 Resistin 的 vector (ADSF - hfc), 用顯性抑制的方式可以防止因為 Resistin 抑制 3T3 - L1 cells 的分化 過度表現 ADSF - hfc 的基因轉殖小鼠其脂肪細胞組織中顯示出, 有增加且變大的脂肪細胞以及增加的 Adipocyte marker 表現,ADSF - hfc 基因轉殖小鼠因為 Resistin 表現減少了, 所以有改善的葡萄糖耐受性及胰島素敏感性 因為也增強了脂肪細胞的分化, 所以 ADSF - hfc 基因轉殖小鼠的脂肪組織中,Leptin 和 Adiponectin 的表現增加, 因為循環的 Leptin 和 Adiponectin 增加因而降低血漿三酸甘油酯與游離脂肪酸濃度, 這可能是改善這些基因轉殖鼠葡萄糖與胰島素耐受性的原因 這些結果顯示出 Resistin 的作用是抑制脂肪細胞生合成並增加胰島素抗性 (150, 235, 237) 另外在人體的研究上仍然是具爭議,Nagaev 等人在有胰島素抗性和肥胖病人的脂肪細胞中沒有發現 Resistin mrna 表現 ; 另一研究則是在肥胖病人的脂肪組織中與瘦者相比較下, 發現有增加的 Resistin mrna, 但在新鮮分離的 Human adipocytes 中是減少表現的 除了在一些胰島素抗性者無法測得 Resistin mrna 表現,Janke 等人發現在培養的 Human preadipocytes 與成熟 Adipocytes 相比較, 有增加的 Resistin mrna 表現, 但 Resistin 基因表現與胰島素抗性或體重之間的關連性還是 42

58 第二章文獻回顧 無法得知 雖然在腹部脂肪組織有較高的 Resistin mrna 表現可能可解釋腹部肥胖 會增加代謝異常, 但 Resistin mrna 在皮下脂肪和 Omental fat 中的表現非常相似, 因此還是無法了解 Resistin 在腹部脂肪細胞以及胰島素抗性之間的相關性 (241) 四 代謝症候群 Metabolic syndrome ( 一 ) Characteristic of metabolic syndrome 1923 年, 代謝症候群最早被敘述為包括有高血壓 (Hypertension) 高血糖 (Hyperglycaemia) 和高尿酸血症 (Hyperuricaemia) 的症候群 在 1947 年的研究指出腹部肥胖 (Abdominal obesity) 和脂質分佈與糖尿病及其他疾病的相關性 ; 接著在 1965 年再次敘述到此症候群是含有高血壓 高血糖以及肥胖的症候群 Reaven 於 1988 年將腹部肥胖 高胰島素血症 (Hyperinsulinemia) 高三酸甘油酯血症 (Hypertriglyceridemia) 高血壓以及 Low HDL - cholesterol, 這一群對糖尿病和心血管疾病的危險因子命名為 Syndrome X, 並指出代謝症候群主因是與胰島素抗性有關 (261) 也有其它學者將其命名為 The Deadly Quartet (262) 以及 The Insulin Resistance Syndrome (263) 造成代謝症候群的原因是複雜且目前尚不明確, 一般認為胰島素抗性與腹部肥胖是代謝症候群的主因, 胰島素抗性是第二型糖尿病主要發病特徵, 而第二型糖尿病又與 Atherogenic dyslipidaemia 和前發炎反應階段有關 一些數據指出胰島素抗性或其相關的高胰島素血症對心血管疾病 (CVD) 的相關性是獨立的危險因子, 而此關聯性上需要更一步的探討 ( ) 一些研究指出特別是中央脂肪堆積的內臟肥胖與代謝症候群最相關, 且肥胖又與高血糖 高血壓 高血清膽固醇 Low HDL - cholesterol 胰島素抗性有關, 這些肥胖相關性是較高的心血管疾病危險因子 在臨床以及病理研究中, 肥胖與所有心血管疾病危險因子有強烈相關聯, 但其中央肥胖尤其是內臟肥胖與代謝症候群之間的機制也是不明確且複雜的 (269) 儘管造成代謝症候群的原因都指向是胰島素抗性與肥胖, 但其它因子如 Endothelial dysfunction 生活型態的改變加上基因的影響, 都指出可能與代謝症候群有關 (270) 43

59 第二章文獻回顧 圖 2-5 胰島素抗性 肥胖與代謝症候群之相關性 資料來源 :Avramoglu et al., 2006 (271) ( 二 ) Definition of metabolic syndrome 有一些組織對代謝症候群建立的判斷標準, 這些組織有 The World Health Organization (WHO) The European Group for study of Insulin Resistance (EGIR) 與 The National Cholesterol Education Program Third Adult Treatment Panel (NCEP ATP III)(271) 44

60 第二章文獻回顧 1. The 1999 WHO definition 最早是在 1999 年由 WHO 所建立的, 其判斷標準為有受損的葡萄糖調節包括葡萄糖耐受性受損 胰島素抗性或糖尿病, 並伴隨其中兩項因子, 包括有增加的血壓 高三酸甘油酯血症或 Low HDL - cholesterol 以腰臀比 Wasit / Hip ratio 或身體質量指數 BMI 評估出來的肥胖 2. The 1999 EGIR definition 接者 EGIR 對 WHO 所建立的判斷標準加以調整成必須要同時有糖尿和高胰島 素血症, 以腰圍來評估肥胖 (272) 3. The 2001 ATP III definition ATP III 所建立的判斷標準是目前最廣泛被使用的, 其主要是針對心血管疾病的危險所建立的判斷標準, 較少有以葡萄糖或胰島素為主的評估 其判定為須符合五項因子的其中三項以上即認為有代謝症候群而會增加罹患心血管疾病的風險, 包括有中央肥胖 增加的血壓 增加的三酸甘油酯 Low HDL - cholesterol 以及禁食高血糖 (273) 4. New IDF definition 在 2004 年,International Diabetes Federation (IDF) 建立出適用於任何國家, 且可同時判定具高風險心血管疾病的和有糖尿的人 所建立的判斷標準包括有評估腹部脂肪堆積 胰島素抗性 Atherogenic dyslipidaemia 增加的血壓 Proinflammatory state 和 Pothrombotic state 目前 IDF 在 2005 年又建立了最新的判斷標準, 是針對不同民族和性別提出不同的腰圍標準來評估肥胖 (274) 45

61 第二章文獻回顧 五 苦瓜 Momordica charantia 植物與藥草常常被用作傳統醫療用藥, 苦瓜是常被用做藥物使用的植物之一 (275, 276) 苦瓜, 學名為 Momordica charantia 的葫蘆科攀緣植物, 英文名為 Bitter gourd 或 Bitter melon; 印度名稱為 karelar Momordica 意指其葉子呈齒狀的邊緣, 所有部位包括果實的味道是苦的, 果實的形狀類似胡瓜的橢圓形狀, 未成熟時是鮮綠色的, 當成熟時會轉變為橘黃色 苦瓜生長在亞洲 亞馬遜河 東非等這些熱帶地區, 栽培作為蔬菜食用, 在一些發展中國家如中國 印度等也作為治療糖尿病 消除脹氣及治療腹痛的傳統用藥 (277); ( 其他用途包括有治療創傷 內服或外用於處理寄生蟲 作為調經劑 抗痲疹和肝炎病毒 ; 在土耳其民間醫療中, 苦瓜的成熟果實外服於傷口幫助瘉合, 並內服治療消化性潰瘍 在印度, 苦瓜具有許多藥物用途, 包括有抗糖尿病藥 墮胎藥 驅蟲劑 避孕藥 抗瘧藥 以及通便劑等, 但最普遍的用途是作為蔬菜食用 關於苦瓜的效用與安全性, 在近十年來有數百篇研究指出苦瓜有抗糖尿病 抗病毒 抗腫瘤 抗白血病 抗細菌 驅除腸內寄生蟲 抗突變 抗黴菌 抗氧化 抗潰瘍 抗發炎 降低膽固醇 降低三酸甘油酯 降血壓 刺激免疫的特性 (278, 279) 在動物實驗中顯示低劑量的苦瓜是安全的,Virdi 等人的研究表示, 給予糖尿病大鼠每公斤體重 20 mg 的苦瓜水萃粉末 4 週, 對肝和腎沒有肝毒性與腎毒性 (280), 且不影響大鼠食物攝取 生長發育和血液生化質 (281) 46

62 第二章文獻回顧 ( 一 ) 苦瓜的植物化學成分 (Phytochemicals) 苦瓜含有許多生物活性化學物質, 包括有配醣類 (Glycosides) 皂素(Saponins) Alkaloids Fixed oils 三松烯(Triterpenes) 蛋白質以及固醇類 ( 未成熟的果實是維生素 C 良好來源, 而且也提供了維生素 A 磷和鐵( 許多其他植物化學成分也已被分離出來, 如 Momorcharins Momordenol Momordicilin Momordicins Momordicinin Momordin Momordolol Charantin Charine Cryptoxanthin Cucurbitins Cucurbitacins Cucurbitanes Cycloartenols Diosgenin Elaeostearic acids Erythrodiol Galacturonic acids Gentisic acid Goyaglycosides Ggoyasaponins 和 Multiflorenol ( )), 而這些成分存在於整個植物中 (286) 苦瓜的降血糖化學成分有報告提及是 Charantins Insulin-like peptides 和 Alkaloids 的 Steroidal saponins 混合物, 這些成分集中在苦瓜的果實中, 因此苦瓜果實具較明顯的降血糖與抗高血糖活性 (287) 苦瓜種子中脂質含量大於 40% 的乾重,Takagi 和 Itabashi 指出在這些脂質中, 苦瓜種子油含有 56.2% 的 α - eleosteraric acid, 這類 c9, t11, t13-18:3 (Conjugated linolenic acid, CLN) 的多元不飽和脂肪酸 (288) 其他成分如分子量 28.6 kd 的 MRK29 分子量 30 kd 的 M. charantia protein (MAP30) 以及 Lectin 這類的 HIV 抑制蛋白質 (HIV inhibitory proteins)(289), 還有 Trypsin inhibitors (290) Elastase inhibitors (291) Aguanylate cyclase inhibitors (292) 與 D - (+) - trehalose 的 α-glucosidase inhibitor (293) 也都存在於苦瓜中 47

63 第二章文獻回顧 ( 二 ) 苦瓜的藥理特性 1. 抗糖尿病活性 Antidiabetic activity (1) 動物模式 苦瓜的抗糖尿病活性是最常被研究的, 其所有部位包括果肉 種子 果實和整株植物對正常動物都有降血糖活性 (294, 295), 以及在藥物誘導的 (296, 297) 和基因模式 (298) 的糖尿病囓齒類動物中具抗高血糖活性 給予糖尿病大鼠含苦瓜的多種藥草, 會降低大鼠血糖和糖化血色素, 並增加血漿胰島素和總血紅蛋白 (299) Vridi 等人在糖尿病大鼠研究中證實, 苦瓜果實的抗高血糖活性 (280) Kar 等人給予藥物誘導的糖尿病大鼠, 餵食苦瓜乙醇萃取物 2 週後發現, 大鼠的血糖達到幾近正常血糖值 (296) 另外, 以苦瓜水萃物分別餵食 Alloxan 糖尿病大鼠 和 4 個月, 以及 STZ 糖尿病大鼠 和 60 天之後發現, 這些大鼠血漿葡萄糖濃度都顯著降低 (297) 一些從苦瓜分離出來的植物化學成分如 Charantin Polypeptide - p Momordin Ic Oleanolic acid 3 O - monodesmoside 和 Oleanolic acid 3 O - glucuronide, 都具有降血糖活性 (300) 給予正常和 NIDDM 大鼠苦瓜果肉製成的果汁與萃取自果實中不含皂素的果汁甲醇萃取物, 在禁食與餐後的狀況下有顯著的降血糖作用, 但在 IDDM 大鼠中沒有 (287) 苦瓜降低血糖的機制還不是很清楚, 在 STZ 糖尿病大鼠研究中指出, 餵食苦瓜果汁可增加胰臟 β 細胞的數目 (301) 在其它研究中顯示, 苦瓜有類似胰島素的作用或促進胰島素釋放 (302, 303) 另外有些研究表示苦瓜的降血糖活性是胰臟外的作用 (304), 包括有增加肌肉中葡萄糖轉運蛋白 GLUT4 (298) 增加肝臟和肌肉中葡萄糖的利用 (305) 抑制肝臟中的 Glucose - 6 phosphatase 和 Fructose - 1, 6 bisphosphatase 以及刺激肝臟的 Glucose 6 phosphate dehydrogenase 活性 (306) Matsuda 等人認為苦瓜的降血糖活性是因為抑制小腸刷狀緣中葡萄糖的運送 (307); Rathi 等人發現給予苦瓜會回復糖尿病小鼠肝臟中 Hexokinase Glucokinase Phosphofructokinase 和 Substrate glucose 6 - phosphate 這些醣類代謝酵素活性 (308) 48

64 第二章文獻回顧 (2) 對糖尿病併發症的作用 Effect on diabetic complications 糖尿病通常會引起其他的併發症, 而對許多器官如腎臟 眼睛 神經和血管會造成不可逆的傷害 (American Diabetes Association, 1998) 在一些動物研究中, 苦瓜已指出可預防以及延緩糖尿病併發症的進展, 如腎病 神經疾病 Gastroapresis 白內障和胰島素抗性 (297, 309, 310) 胰島素抗性是糖尿病重要特徵之一, 且與肥胖 高血壓 脂質紊亂和動脈粥狀硬化有關 (311) 以高果糖餵食大鼠可誘發出 Syndrome X 包括有高血糖 高胰島素血症 高三酸甘油酯血症以及肥胖 (312), 以苦瓜水萃物餵食高果糖飲食的大鼠, 發現可預防大鼠發生高血糖和高胰島素血症 在西方國家白內障是糖尿病重要的危險因子, 在糖尿病大鼠研究中給予苦瓜果實或苦瓜水萃物, 可延緩或抑制大鼠白內障的形成 (313) (3) 臨床試驗 在人體試驗研究指出, 苦瓜果實水萃物顯著降低 NIDDM 病患血中葡萄糖濃度, 在每日飲食中補充乾燥苦瓜果實可改善糖尿病患者的葡萄糖耐受性, 但在血清胰島素濃度則沒有增加 (314) Welihinda 與其團隊發現苦瓜果汁明顯改善已發病的糖尿病患者的葡萄糖耐受性 (315) 49

65 第二章文獻回顧 2. 抗病毒活性 Antiviral activity 苦瓜以及一些分離自苦瓜的植物化學成份如 α - 和 β - momorcharin Lectin 以及 MAP 30, 在 In vitro 都指出具有可抵抗疱疹病毒 科薩奇病毒 Epstein Barr HIV 和脊髓灰質病毒 ( ) MAP 30 是最重要的抗 HIV 活性成分,MAP 30 的抗病毒活性是因為對 HIV - 1 intergrase 的抑制作用 (319) Cunnick 等人在 In vitro 中發現, 苦瓜葉子萃取物具增加抵抗病毒感染的能力, 也有免疫刺激的作用 ((320) α - 和 β - momorcharin 這兩種存在於苦瓜種子 果實和葉子中的成分, 在 In vitro 中指出具抗 HIV 活性 (321, 322), 而且發現可抑制 HIV - 1 intergrase 3. 抗癌症活性 Anticancer activity 對苦瓜粗萃取物與其純化物如 MAP 30 和 c9, t11, t13 18 : 3 CLN 的 In vitro 與 In vivo 研究中, 顯示苦瓜有抗癌活性可抵抗淋巴白血病 淋巴瘤 絨毛腺癌 黑色素瘤 乳癌 皮膚腫瘤 前列腺癌 舌喉癌 人類膀胱癌 Hodgkin s disease 以及結腸癌 (279, 323, 324) 4. 降血膽固醇與抗氧化 Hypocholesterolemic and anti-oxidant potential 在一些正常與糖尿病動物模式研究中指出, 苦瓜具降血膽固醇的作用 (325) Dhar 等人指出餵食大鼠 4 週分離自苦瓜種子油中的 c9, t11, t13 18 : 3 CLN, 顯著下降血漿中脂質過氧化和紅血球細胞膜脂質過氧化, 因為 CLN 會與自由基結合而被氧化, 因此降低 H 2 O 2 形成而具有抗氧化性 (326) 5. 其它活性 另外一些研究也指出苦瓜的其他藥理特性, 如抗細菌活性 (277) 抗潰瘍活性 (307) 免疫調節活性 (327) 抗發炎活性 (328) 降血壓活性 (289) 50

66 第二章文獻回顧 ( 三 ) 苦瓜與 PPAR PPAR 是脂質活化的轉錄因子, 透過基因的作用調節能量恆定,PPAR 與調節脂質和葡萄糖恒定 細胞分化及凋亡 癌症形成以及控制發炎反應相關 許多研究也指出苦瓜有許多藥理特性, 例如抗癌 降血糖以及降三酸甘油酯的作用 (329) 已知 Fibrate 類降血脂藥物與 TZD 類抗糖尿病藥物分別是 PPARα 和 PPARγ 的活化劑, 但這些都作為藥物治療使用, 若由飲食或食物來源中找出 PPAR 的活化劑, 可能更具健康上之效益 因此,Chao 等人從各種蔬菜 水果 藥草的萃取物去篩選是否有可同時活化 PPARα 和 PPARγ 的飲食因子 (330) 在轉活化試驗中證實, 苦瓜乙酸乙酯萃取物可同時活化 PPARα 和 PPARγ, 另外在 H4IIEC3 肝癌細胞株的 In vitro 中發現, 苦瓜乙酸乙酯萃取物增加 ACO 活性以及 ACO 和 FABP mrna 的表現 此發現有利於之後從一般蔬果來源去找尋如同 PPARα 和 PPARγ 在改善高血脂與高血糖上的作用 ( 四 ) 抗肥胖活性 Antiobesity activity 苦瓜降低血糖是已被確認的作用, 近來對苦瓜的研究轉移集中在抗肥胖的潛在作用,2003 年香港大學 Chen 等人首度證實苦瓜降低體脂堆積的作用 (331) 給予高脂飲食誘導肥胖的大鼠餵食冷凍乾燥的苦瓜汁, 改善葡萄糖耐受性, 降低血漿葡萄糖 血清胰島素和 Leptin 濃度, 增加血清游離脂肪酸濃度 除此, 在不影響食物攝取與脂質吸收的情況下, 可降低體脂堆積與體重增加 苦瓜降低體脂堆積的機制仍不清楚, 這些受質與荷爾蒙的變化顯示, 在低胰島素環境下同時給予苦瓜可能有利於脂解作用, 的確在餵食苦瓜的高脂飲食大鼠中發現其血清游離脂肪酸濃度增加 另外其他研究也指出, 餵食苦瓜的大鼠其血漿與肝臟中的三酸甘油酯含量較低 (332, 333) 綜合這些結果指出了苦瓜可能抑制低油組大鼠的脂質合成或高油組大鼠的脂質儲存, 因此苦瓜在改善胰島素敏感性及體重控制上扮演新的角色 血漿中腎上腺素和正腎上腺這類兒茶酚胺 (Cetacholamines) 可調節交感活性, 而交感活性增加與降低體重有關 有研究指出綠茶中的兒茶素經由增加交感活性來促 51

67 第二章文獻回顧 進生熱作用 (334), 雖然沒有報告指出苦瓜含有兒茶素, 但已知苦瓜富含 CLN 而且可能轉變為 CLA(335), 而 CLA 已指出可增加交感活性 (336) 在 Chen 等人先前研究發現苦瓜可降低體脂 (331), 且餵食苦瓜的高脂飲食大鼠其血漿中游離脂肪酸濃度增加 因此, 在 2005 年 Chen 等人探討組織中降低的脂質含量是否為苦瓜降體脂的現象, 以及觀察與胰島素抗性相關器官中三酸甘油酯含量與血漿中兒茶酚胺濃度來監測交感活性變化, 結果發現苦瓜降低肝臟中三酸甘油酯含量, 並再度證明苦瓜可降低體脂堆積, 而且也首次發現苦瓜增加血漿中兒茶酚胺濃度及降低骨骼肌中三酸甘油酯含量 (337) 在 Chen 等人 2003 與 2005 年的研究指出, 苦瓜可降低高脂飲食大鼠的體重增加與改善胰島素敏感性 給予苦瓜可降低主要器官的三酸甘油酯含量, 增加血漿中兒茶酚胺濃度與血清游離脂肪酸顯示增強了交感活性與脂解作用, 這些結果提供了苦瓜的抗肥胖活性可能有益於體重和血糖的控制 (337, 338) 但是, 苦瓜降低體脂含量和改善胰島素敏感性這些的生理反應還是不清楚 Chen 等人在 2003 的研究發現, 餵食苦瓜的大鼠其血清游離脂肪酸增加, 而這些大鼠組織中三酸甘油酯含量較少, 也有較好的葡萄糖耐受性 這個結果與先前其他研究指出的游離脂肪酸會誘導胰島素抗性的結果不符合 (339), 或許游離脂肪酸如同 PPAR 的活化劑一樣, 經由向上調節 Uncoupling protein 的表現而促進 β - oxidation 以及產熱來消耗能量 (340) 另外, 也有研究指出苦瓜乙酸乙酯萃取物可活化 PPAR 和向上調節 H4IIEC3 肝癌細胞中 ACO 基因表現, 來影響脂質氧化作用 (330) 接著在同樣研究團隊中,Chan 等人繼續探討苦瓜抗肥胖活性的可能機制 在囓齒類動物中, 棕色脂肪組織是重要的生熱調節 (341), 在高脂飲食或低溫時會誘導棕色脂肪組織中 UCP 的表現 (342), 許多因子如交感活化作用也會影響 UCP 的表現 (343) Peroxisome proliferator - activated receptor α coactivator - 1α (PGC - 1α) 可與細胞核轉錄因子相互作用, 而且其主要調節粒線體的生物生合成與氧化磷酸化作用 (344),PGC - 1α 也是 UCP 的活化劑 (345) 因為在不影響食物攝取與脂質吸收的情況下, 苦瓜可降低體脂堆積與體重增加 (331), 因此,Chan 等人假設可能是 UCP 影響能量恒定, 所以探討苦瓜對 UCP 表現的影響 此研究是首次指出苦瓜對高脂飲食誘導肥胖大鼠的 UCP 和 PGC - 1α 表現的作用, 結果顯示苦瓜可增加 UCP 和 PGC - 52

68 第二章文獻回顧 1α 的表現 (337) ( 五 ) 台灣山苦瓜 在台灣, 苦瓜又稱作錦荔枝 癩葡萄 癩瓜等, 年栽培面積約 3,000 公頃, 分布於台灣東部及中南部平原至低海拔山區 苦瓜種類繁多, 依果色可分為白色 白綠色 綠色及濃綠色等 ; 就果面突起可分為珍珠突起 尖銳突起及條肋狀突起 ; 而果實形狀又可分為紡綞形 短橢圓形 長橢圓形 圓形 三角形等 早期台灣苦瓜以皮白 肉厚 苦味淡較受一般人歡迎, 近年來由於多元化食用方式盛行, 綠皮尖銳突起之小果型的山苦瓜也漸漸引起消費者的興趣 本省山苦瓜的主要栽培地區是花蓮縣的壽豐鄉, 生產面積有 20 幾公頃,5 ~ 10 月是盛產季節 山苦瓜又名小苦瓜 野生苦瓜 野苦瓜 其品種特性分述如下 1. 植株型態株型為蔓性, 分枝多, 莖蔓中等, 深裂葉, 葉色綠, 花瓣黃色, 雌雄同株異花, 雌花於主蔓第 11 節開花, 早晨開花, 生長勢強, 春作定植後約 31 天, 夏作約 29 天, 進入始花期 2. 果實型態果皮綠色, 果面具珍珠突起及條狀突起, 長橢圓形, 果長約 13 公分, 平均果重 130 ~ 150 公克, 春作開花後約 天採收, 夏作開花後約 15 ~ 20 天採收 3. 果實產量每公頃產量春作約為 22.3 公噸, 夏作約為 17.3 公噸 4. 生育日數育苗日數約為 14 ~ 20 天, 定植至始花日數 30 天, 定植至採收日數春作約為 50 天, 夏作約為 45 天 採收期 :45 天至 60 天 ; 總生育日數 :110 天至 130 天 ( 播種至完成採收總日數 ) 53

69 第二章文獻回顧 5. 成份分析行政院農業委會花蓮區農業改良場分析山苦瓜之後發現, 其含有維生素 C 758 ppm 膳食纖維 3.95% 粗纖維 1.57% 葉酸等營養元素及磷 鈣 鎂等多種礦物質 營養價值高, 為重要瓜類蔬菜 ( 資料來源 : 農政與農情 ) 圖 2-6 山苦瓜 54