李乾

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牙梧逄
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1 864 中国肿瘤生物治疗杂志 Chin J Cancer Biother, Aug. 207, Vol. 24, No. 8 DOI:0.3872/j.issn x 基础研究 mir-86 通过下调垂体瘤转化基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡李乾, 魏志辉, 肖前仁 2, 陈佳骏, 周新, 王滕羽, 张中卒, 张铭华 (. 重庆医科大学附属永川医院骨科, 重庆 40260;2. 南昌大学附属第一医院骨科, 江西南昌 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir-86 对骨肉瘤细胞增殖凋亡及侵袭能力的影响, 并探讨其可能机制方法 : 实时荧光定量 PCR 检测骨肉瘤细胞 HOS U2-OS Saos-2 及成骨细胞 NHOst 中 mir-86 表达, 并运用人工合成的 mir-86 模拟片段及对照 scramble mimic 转染至人骨肉瘤 HOS 及 U2-OS 细胞内, 运用实时荧光定量 PCR 检测转染后细胞中 mir-86 的表达水平 ; 分别运用 CCK-8 法流式细胞检测技术及 Transwall 体外侵袭实验检测过表达 mir-86 对 HOS 及 U2-OS 细胞增殖凋亡及侵袭能力的影响 ; 运用 Western blotting 及实时荧光定量 PCR 检测 mir-86 过表达对细胞中垂体瘤转化基因 (pituitary tumor transforming gene, PTTG) 的蛋白及 mrna 表达水平的影响结果 : 骨肉瘤细胞中 mir-86 呈现低表达 ; 转染人工合成的 mir-86 片段可上调 HOS 及 U2-OS 细胞中 mir-86 的表达 ;mir-86 过表达组细胞的增殖能力较 scramble 组明显下降 (P<0.0), 转染组 HOS[(6.9±2.)% vs (0.4±.6)%,P<0.05] 及 U2-OS[(22.6±2.9)% vs (4.±2.2)%,P<0.05] 细胞的凋亡比例明显高于 scramble 组, 转染组 HOS 及 U2-OS 细胞的穿膜数明显低于 scramble 组 (P<0.0); 转染组细胞中 PTTG 的蛋白及 mrna 表达水平均明显下降 (P<0.0), 而 scramble 组无明显变化 (P>0.05); 结论 : mir-86 能够抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭并促进细胞凋亡, 其作用机制可能与抑制 PTTG 表达相关 [ 关键词 ] mir-86; 骨肉瘤 ; 垂体瘤转化基因 [ 中图分类号 ] R730.59;R736.4 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] X(207) mir-86 suppresses the proliferation and invasion and promotes apoptosis of osteosarcoma cells partially through targeting PTTG LI Qian, WEI Zhihui, XIAO Qianren 2, CHEN Jiajun, ZHOU Xin, WANG Tengyu, ZHANG Zhongzu, ZHANG Minghua (. Department of Orthopedics, Yongchuan Hospital Affiliated to Chongqing Medical University, Chongqing 40260, China; 2. Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang , Jiangxi, China) [Abstracts] Objective: To explore the effects of mir- 86 on the cell proliferation, apoptosis and invasion of human osteosarcoma cells, and identify its putative mechanisms. Methods: The expression of mir-86 in osteosarcoma cell lines (HOS, U2-OS and Saos-2) and osteoblast NHOst cells was detected using RT-PCR assays. Artificially synthesized mir- 86 mimic and relative control scramble mimic was transfected into osteosarcoma HOS and U2- OS cell lines, and the expression of mir-86 in OS cells was detected using the RT-PCR assays upon transfection. Then, the effects of mir-86 over-expression on cell proliferation, apoptosis and invasion of OS cells were explored using the CCK- 8, FCSE and transwell invasion assays, respectively. The effects of mir- 86 over- expression on mrna and protein expression of PTTG (pituitary tumor transforming gene) were explored using the Western blotting and RT-PCR assays. Results: mir-86 was low expressed in OS cell lines; Transfection with artificially synthesized mir-86 mimic significantly up-regulated the expression of mir-86 in HOS and U2-OS cells; the proliferation rate of cells transfected with mir- 86 mimic was much lower than those transfected with scramble mimic [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (No ); 重庆医科大学附属永川医院院内课题资助项目 (No. YCZQN2054) Project supported by the National Natural Science Foundation of China(No ), and the Foundation of the Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University Grants (No. YCZQN2054). [ 作者简介 ] 李乾 (983-), 男, 本科, 住院医师, 主要从事骨与软组织肿瘤研究, liqian_osteo@26.com [ 通信作者 ] 张铭华 (ZHANG Minghua,corresponding author), 硕士, 教授, 硕士生导师, 主要从事骨关节损伤骨与软组织肿瘤研究, zhangminghua023@26.com [ 优先发表 ]

2 李乾, 等. mir-86 通过下调垂体瘤转化基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡 865 [HOS: (6.9±2.)% vs (0.4±.6)%; U2-OS: (22.6±2.9)% vs (4.±2.2)%; (P<0.0); the apoptotic rates of HOS and U2-OS cells transfected with mir-86 mimic were higher than those transfected with scramble mimic [HOS: (6.9± 2.)% vs (0.4±.6)%; U2-OS: (22.6±2.9)% vs (4.±2.2)%; all P<0.05], and the number of cells passing through the chambers in mir- 86 mimic transfection group was less than those of scramble transfection group (P<0.0). The expression levels of PTTG at protein and mrna level were both suppressed in cells transfected with mir-86 mimic (P<0.0); however, scramble transfection group showed no statistical difference (P>0.05). Conclusion: Overexpression of mir- 86 significantly inhibited cell proliferation and invasion, and promoted the apoptosis of OS cells, which might be related with PTTG suppression. [Key words] mir-86; osteosarcoma; pituitary tumor transforming gene (PTTG) [Chin J Cancer Biother, 207, 24(8): DOI:0.3872/j.issn X ] 微小 RNA(microRNAs, mirna/mir) 是一类内源性非编码的小 RNA 分子通过与靶基因的 3 -UTR 区完全或不完全的结合,miRNAs 能够参与靶基因的表达调控, 而 mirna/mrna 作用轴的失衡参与包括 [-2] 肿瘤形成在内的多个生物学过程骨肉瘤(osteo- sarcoma, OS) 是儿童及青少年最常见的恶性原发性骨 [3] 肿瘤, 其恶性程度高预后极差, 因此对于其发病机制及治疗的研究一直是学界关注的热点其中 mir- NAs 在骨肉瘤的发生发展诊断及治疗中发挥重要 [4] 作用 mir-86 是最新报道的 mirnas 之一, 其在多个肿瘤组织中担当抑癌基因的功能, 但是其在骨肉瘤中的作用尚不明确, 本研究主要探讨 mir-86 在多种骨肉瘤细胞系中的表达及其对骨肉瘤细胞 HOS 及 U2-OS 的增殖凋亡及侵袭能力的影响, 并探讨其可能机制, 为骨肉瘤的发病机制和基因治疗提供实验依据材料与方法. 主要材料与试剂人骨肉瘤细胞系 HOS U2-OS Saos-2 及 NHOst 细胞株均购买于中国医学科学院细胞中心研究所用引物由上海生工生物科技有限公司合成新生胎牛血清购自美国 PAA 有限公司 ;RPMI 640 培养基 0.25% 胰酶 (Trypsin-EDTA) RIPA 裂解液和脂质体 2000 转染试剂 (Lipofectamine 2000) 均购自美国 Invitrogen 公司 ; 化学合成的 mir-86 mimic 片段及对照片段 (scramble mimic) 及 Dhamafect 转染试剂购自美国 Thermo Fisher 公司 ;8.0 μm 孔径 Transwell 小室购自美国 Minipore 公司 ; 基质胶购自美国 Sigma 公司 ; 兔抗人垂体瘤转化基因 (pituitary tumor transforming gene, PTTG) 蛋白抗体购自美国 Cell signal technology 公司 ; 兔抗人 GAPDH 多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ; 增强型化学发光试剂 (enhanced chemiluminescence system,ecl) 购自美国 Millipore 公司.2 细胞培养与转染 HOS U2-OS 及 Saos-2 细胞株用 RPMI 640 完全培养基 ( 含有 0% 胎牛血清 00 U/ml 青霉素和 00 μg/ml 链霉素 ),5% CO 2 及 90% 饱和湿度的条件下培养细胞贴壁生长, 加入适量 0.25% 的胰酶 (Trypsin- EDTA) 消化传代将细胞提前 d 铺入细胞培养板中, 次日转染时细胞单层密度约为 50%, 处于对数生长期将人工合成的 mir-86 mimic 及对应的 scramble mimic 按照 Dhamafect 转染试剂说明书分别转染至 HOS 及 U2-OS 细胞株中, 根据所转染质粒的不同分为 2 组 : 转染组 ( 即转染 mir-86 的 HOS 及 U2-OS 细胞 ) 和对照组 ( 即转染 scramble 的 HOS 及 U2-OS 细胞 ) 因预实验中证实转染 scramble 组与未转染组细胞内的 mir-86 的表达无明显表达差异, 同时为了排除转染试剂引起的误差, 所以实验中仅设计了转染试剂公司配对的无义片段 (scramble 片段 ) 作为实验的对照组.3 实时荧光定量 PCR 检测骨肉瘤细胞中 mir-86 的表达转染后 48 h, 运用 TRIzol 法分别提取实验及对照组骨肉瘤细胞的总 RNA 未经转染的人骨肉瘤细胞系 HOS U2-OS Saos-2 细胞及成骨细胞 NHOst 的总 RNA, 根据逆转录试剂盒将 RNA 逆转录成 cdna, 以 cdna 为模板, 应用 PRISM 7000 型定量 PCR 仪 (Applied Biosystemss) 进行定量 PCR 检测, 以 U6 作为内参 PCR 扩增结束后绘制熔解曲线, 对目的基因的表达采用 2 -ΔΔCt 法行相对定量分析 PCR 反应引物及反应条件如表.4 CCK-8 法检测 mir-86 过表达对骨肉瘤细胞增殖的影响将转染 24 h 的 HOS 及 U2-OS 细胞按个 / 孔接种于 96 孔培养板中 (00 μl/ 孔 ) 待细胞贴壁后, 加入 CCK-8 液 0 μl,37 5% CO 2 孵育 2 h, 用自动酶标平板阅读仪于 450 nm 波长处读取光密度 (D) 值每孔设置 3 个复孔, 并设置空白对照组实验重复 3 次, 取平均值

3 866 中国肿瘤生物治疗杂志, 207, 24(8) 表 RT-PCR 引物序列 Tab. Primer sequences of RT-PCR Gene Reverse transcription mir-86 U6 Real time-pcr mir-86-f mir-86-r U6-F U6-R PTTG-F PTTG-R Primer sequence 5 -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAGAGCCCAA-3 5 -AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3 5 -GCGCTAAGGCACGCGGT-3 5 -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 5 -CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3 5 -ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3 5 -TTTGACCTGCCTGAAGAGC-3 5 -CGACAGAATGCTTGAAGGAG-3.5 流式细胞术检测 mir-86 过表达对骨肉瘤细胞凋亡的影响细胞转染换液后用 3% 低浓度血清继续培养细胞 48 h, 用不含 EDTA 的胰酶消化贴壁细胞,PBS 洗涤细胞 2 次细胞重新计数, 将细胞沉淀 (4 0 5 个 ) 重悬于 00 μl 结合缓冲液 ( ), 分别加入 5 μl PE 标记的 Annexin Ⅴ 和 5 μl 7-AAD, 两个单阳对照组为分别单独加入 5 μl Annexin Ⅴ 或 5 μl 7-AAD, 阴性对照组为不加任何染料, 混匀后室温避光孵育 5 min 补加 200 μl 结合缓冲液 ( ), h 内进行流式细胞仪检测 ; 本实验中,AnnexinⅤ(+)/7-AAD(-) 的细胞被划定为凋亡细胞, 即早期凋亡细胞.6 Transwell 体外侵袭实验检测 mir-86 过表达对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响将 Matrigel 基质胶用无血清培养基稀释至 mg/ ml 备用, 冰上操作将稀释的 Matrigel 基质胶 40 μl 缓慢加入至 Transwell 小室, 避免产生气泡,37 孵育 ~2 h 后基质胶凝固 ; 细胞转染后 24 h 消化离心, 将个细胞重悬于不含血清的 200 μl 培养基中, 细胞混合液沿 Transwell 小室侧壁加入到 Matrigel 胶上 ; 600 μl 含有 20% FBS 的培养基作为趋化因子加入 Transwell 小室的下层中 5% CO 2 37 条件下培养 6 h 后取出小室, 吸出下室中 MEM 培养基,PBS 洗 3 次, 每次 5 min,4% 多聚甲醛固定 30 min,pbs 洗 3 次, 每次 5 min,0.05% 结晶紫染色 30 min,pbs 洗 3 次, 每次 5 min 将膜撕下, 中性树脂封片, 镜下观察, 随机计数 6 个视野, 计算结晶紫染色细胞数, 即为穿膜细胞实验重复 3 次, 取平均值.7 Western blotting 检测 mir-86 过表达对骨肉瘤细胞中 PTTG 蛋白水平的影响细胞转染 48 h 后消化离心,RIPA 裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定浓度 ; 将 20~30 μg 蛋白样品行 0%SDS-PAGE 分离蛋白后电转至 PVDF 膜, 置于含 5% 脱脂奶粉的封闭液中, 室温封闭 h, 分别加入 PTTG ( 000) 及 GAPDH( ) 一抗稀释液孵育,4 过夜,TBST 缓冲液洗膜 3 次, 每次 0 min, 分别加入的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗, 室温孵育 h,tbst 缓冲液洗膜 3 次, 每次 0 min,ecl 化学发光剂反应显影.8 统计学处理采用 SPSS 7.0 软件进行统计学处理, 所有数据以 xˉ±s 表示两组间数据比较采用 t 检验分析, 两组以上数据比较采用方差分析, 以 P<0.05 或 P<0.0 表示差异具有统计学意义 2 结果 2. mir-86 在骨肉瘤细胞中呈低表达 RT-PCR 检测 mir-86 在骨肉瘤细胞 (HOS U2- OS 及 Saos-2) 中的表达, 结果 ( 图 ) 表明, 相比于正常成骨细胞 (NHOst),miR-86 在骨肉瘤细胞中呈低表达 (P<0.05 或 P<0.0) 2.2 人工合成的 mir-86 片段在 HOS 及 U2-OS 细胞中表达成功实时荧光定量 PCR 检测结果显示, 转染 mir-86 模拟片段 48 h 后 HOS 及 U2-OS 细胞中 mir-86 表达水平与转染 scramble 片段组相比, 分别增加约 5 倍及 8 倍 (HOS: 5.3±2.5 vs.±0.,u2-os: 8.±2.8 vs.0±0.; 均 P<0.0) 2.3 过表达 mir-86 抑制 HOS 及 U2-OS 细胞的增殖能力运用 CCK-8 法, 检测了细胞 h 及 72 h 各组细胞的增殖状态, 结果 ( 图 2) 显示, 转染 24 h 内, 转染 mir-86 组细胞与 scramble 组细胞相比较, 增殖能力无明显差异 (P>0.05), 而 48 h 后,miR-86 组细胞的

李乾, 等. mir-86 通过下调垂体瘤转化基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡 867 增殖能力均较 scramble 组明显下降 (P<0.05 或 P< 0.0) 2.4 过表达 mir-86 促进 HOS 及 U2-OS 细胞凋亡流式细胞术检测结果 ( 图 3) 显示,HOS 及 U2-OS 转染 mir-86 组细胞中早期凋亡细胞比例分别为 (6.9±2.)% 和 (22.

4 李乾, 等. mir-86 通过下调垂体瘤转化基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡 867 增殖能力均较 scramble 组明显下降 (P<0.05 或 P< 0.0) 2.4 过表达 mir-86 促进 HOS 及 U2-OS 细胞凋亡流式细胞术检测结果 ( 图 3) 显示,HOS 及 U2-OS 转染 mir-86 组细胞中早期凋亡细胞比例分别为 (6.9±2.)% 和 (22.6±2.9)%, 较对应的 scramble 组 [ 分别为 (0.4±.6)% 及 (4.±2.2)%] 均明显增加 ( 均 P< 0.05) 2.5 过表达 mir-86 抑制 HOS 及 U2-OS 细胞的侵袭 Transwell 小室侵袭实验检测结果 ( 图 4) 显示, 在趋化因子的作用下,HOS[(38±4) vs (2±2) 个,P< 0.0] 及 U2-OS[(47±2) vs (37±9) 个,P<0.0] 细胞过表达 mir-86 组穿透基质胶的细胞数均显著少于对应的 scramble 组 * P<0.05, ** P<0.0 vs NHOst cell group 图骨肉瘤细胞中 mir-86 表达显著低于成骨细胞 Fig. Expression of mir-86 in osteosarcoma cells were significantly lower than that in osteoblast * P<0.05, ** P<0.0 vs scramble group 图 2 转染 mir-86 抑制 HOS 及 U2-OS 细胞的增殖 Fig. 2 Transfection with mir-86 significantly inhibited the cell proliferation of HOS and U2-OS cells 图 3 转染 mir-86 mimics 促进 HOS 及 U2-OS 细胞凋亡 ; Fig.3 Transfection with mir-86 mimics significantly promoted the cell apoptosis of HOS and U2-OS cells 2.6 mir-86 对骨肉瘤中 PTTG 表达的影响 [5] PTTG 是新近研究发现的原癌基因, 研究发现 mir-86 能够与 PTTG 的 3-UTR 区靶向结合, 抑制 PTTG 的表达, 参与非小细胞肺癌细胞的恶性生物学表型的调控, 但是其在骨肉瘤中的作用尚不清楚检测过表达 mir-86 对骨肉瘤细胞中 PTTG 表达的影响, 结果 ( 图 5) 显示, 转染 mir-86 组 HOS 及 U2-OS 细胞中 PTTG 的蛋白及 mrna 表达水平均较对应 scramble 组明显下降

5 Transfection with mir-86 significantly suppressed the protein (right channel of Figrue A, Figure B) and mrna (left channel of Figrue A) level of HOS and U2-OS cells 3 讨论目前对于骨肉瘤发病机制的研究仍十分有限, 尽管多种

5 868 中国肿瘤生物治疗杂志, 207, 24(8) 图 4 转染 mir-86 抑制 HOS 及 U2-OS 细胞侵袭 ( 00) Fig. 4 Transfection with mir-86 significantly suppressed cell invasion of HOS and U2-OS cells( 00) 图 5 转染 mir-86 下调 HOS 及 U2-OS 细胞中 PTTG 的蛋白 ( 图 A 左, 图 B) 和 mrna( 图 A 右 ) 水平 Fig. 5 Transfection with mir-86 significantly suppressed the protein (right channel of Figrue A, Figure B) and mrna (left channel of Figrue A) level of HOS and U2-OS cells 3 讨论目前对于骨肉瘤发病机制的研究仍十分有限, 尽管多种 mirnas 参与了骨肉瘤的发生发展过程, 但是 mir-86 在骨肉瘤中的作用尚不清楚 mirna 是一类内源性可调控基因表达的非编码单链小 RNA 片段, 约由 8~24 个核苷酸构成其通过与靶基因 3 非翻译区 (3 untranslated region, 3 UTR) 特异的碱基配对结合, 引起靶基因 mrna 降解或者翻译抑制, 从而在转录后水平调控基因的表达 [6-7] 编码 mir-86 的基因位于锌指 RAN 结合蛋白 2(zinc finger RAN- binding domain containing 2, [8] ZRANB2) 基因的外显子区域, 具有高度保守性 mir-86 最早被发现参与肌肉组织分化过程, 通过抑制肌细胞生成素 (myogenin) 的表达,miR-86 抑制了肌细胞的分化 [9] 而最近 mir-86 在肿瘤组织中的作用正在逐渐被认识, 研究发现其在多种肿瘤组织中担当抑癌基因的功能, 如在前列腺癌中,miR-86 表达较对照正常组织明显下降, 并且其通过靶向调控 VEGF 表达抑制前列腺癌细胞荷瘤小鼠的生长 [0] ; 此外, 在胃癌细胞中, 过表达 mir-86 能够明显抑制细胞的增殖迁移及侵袭, 并且抑制 Twist 的表达 [] 本研究检测了 mir-86 在骨肉瘤细胞中的表达, 结果表明相对于成骨细胞 NHOst,miR-86 在骨肉瘤细胞中呈现低表达, 提示其可能担当抑癌基因的功能通过瞬时转染 mir-86 的人工合成片段, 提高其在骨肉瘤细胞 HOS 及 U2-OS 中的表达通过转染 mir- 86 人工合成片段,HOS 及 U2-OS 细胞中 mir-86 的表达均明显升高, 表明转染成功通过进一步的生物学功能实验分析发现, 转染 mir-86 组细胞增殖及侵袭能力减弱凋亡比例增加, 表明恢复 mir-86 将抑制骨肉瘤细胞增殖及侵袭, 促进其发生凋亡, 进一步提示 mir-86 在骨肉瘤中担当抑癌基因的功能为了解 mir-86 担当抑癌基因功能的机制, 运用靶基因预测网站 (TargetScan: org;mirdb: [2], 本课题组搜索了 mir-86 的潜在靶基因, 其中 PTTG 吸引了我们的注意 PTTG 是新近研究发现的原癌基因, 最早发现于垂体瘤组织中, 但是随着研究的深入发现其在多种正常组织及肿瘤组织中均表达 [3] 在骨肉瘤细胞中, 过表达 PTTG 能够诱导细胞发生 p53 依赖性及 p53 非依赖性的凋亡, 中止细胞周期的进程从而抑制细胞的生长 [8], 而 PTTG 在骨肉瘤细胞中担当原癌基因, 抑制其表达能够明显抑制骨肉瘤 [4] 细胞的增殖及侵袭研究证实 mir-86 能够与 PTTG 基因的 3 -UTR 区靶向结合, 抑制 PTTG 的表达, 参与非小细胞肺癌细胞的恶性生物学表型的调控 [5], 因此猜测其可能参与了 mir-86 在骨肉瘤中的抑癌功能本研究证实, 在骨肉瘤细胞中过表达

6 李乾, 等. mir-86 通过下调垂体瘤转化基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡 869 mir-86 将同时抑制 PTTG mrna 及蛋白的表达, 提示 PTTG 同时可能参与了 mir-86 介导的对骨肉瘤细胞的抑癌作用中综上所述,miR-86 能够抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭并促进细胞凋亡, 其作用机制可能与抑制 PTTG 表达相关这将为骨肉瘤的发病机制研究, 及基因治疗提供新的思路及理论依据 [ 参考文献 ] [] OLIVIERI F, CAPRI M, BONAFE M, et al. Circulating mirnas and mirna shuttles as biomarkers: perspective trajectories of healthy and unhealthy aging[j]. Mech Ageing Dev, 206, 6374(6): DOI: 0.06/j.mad [2] CAO Q, LI Y Y, HE W F, et al. Interplay between micrornas and the STAT3 signaling pathway in human cancers[j]. Physiol Genomics, 203, 45(24): DOI: 0.52/physiolgenomics [3] KIM H J, CHALMERS P N, MORRIS C D. Pediatric osteogenic sarcoma[j]. Curr Opin Pediatr, 200, 22(): DOI: 0.097/ MOP.0b03e f. [4] RAM R M, BORO A, FUCHS B. Involvement and clinical aspects of microrna in osteosarcoma[j/ol]. Int J Mol Sci, 206, 7(6): E877[ ] /. DOI: /ijms [5] LI H, YIN C, ZHANG B, et al. PTTG promotes migration and invasion of human non-small cell lung cancer cells and is modulated by mir- 86 [J]. Carcinogenesis, 203, 34(9): DOI: 0.093/carcin/bgt58. [6] MATSUDA A, YAN I K, FOYE C, et al. micrornas as paracrine signaling mediators in cancers and metabolic diseases [J/OL]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 206, 30 (5): [ ]. DOI:0.06/j. beem [7] NASSAR F J, NASR R, TALHOUK R. MicroRNAs as biomarkers for early breast cancer diagnosis, prognosis and therapy prediction [J/OL]. Pharmacol Ther, 207, 72 (4): 72-74[ ]. https: // 0.06/j.pharmthera [8] YU R, HEANEY A P, LU W, et al. Pituitary tumor transforming gene causes aneuploidy and p53- dependent and p53- independent apoptosis [J]. J Biol Chem, 2000, 275(47): [9] Antoniou A, Mastroyiannopoulos N P, Uney J B, et al. mir-86 inhibits muscle cell differentiation through myogenin regulation [J]. J Biol Chem, 204, 289(7): DOI: 0.074/jbc.C [0] TERZUOLI E, DONNINI S, FINETTI F, et al. Linking microsomal prostaglandin E Synthase-/PGE-2 pathway with mir-5a and -86 expression: novel mechanism of VEGF modulation in prostate cancer [J]. Oncotarget, 206, 7(28): DOI: /oncotarget.005. [] CAO C, SUN D, ZHANG L, et al. mir- 86 affects the proliferation, invasion and migration of human gastric cancer by inhibition of Twist [J]. Oncotarget, 206, 7(48): DOI: /oncotarget.382. [2] RIFFO A L, RIQUELME L, BREBI M P. Tools for sequence-based mirna target prediction: what to choose? [J/OL] Int J Mol Sci, 206, 7(2): E987[ ] DOI:0.3390/ijms72987 [3] HAJI M R, SABETKISH N, HESHMAT R, et al. Expression of the pituitary tumor transforming genes (PTTG) in pheochromocytoma as a potential marker for distinguishing benign versus malignant tumors [J/OL]. Acta Med Iran, 205, 53(4): [ ]. [4] 吴大鹏, 夏永华, 徐海斌, 等. 垂体肿瘤转化基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖细胞周期和细胞侵袭能力的影响及其分子机制 [J/ OL]. 中华病理学杂志, 204, 43(0): [ ]. CN. DOI: /cma.j.issn [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 本文编辑 ] 黄静怡文稿中数字用法的要求读者作者编者本刊严格执行国家标准出版物上数字用法的规定, 文稿中凡是可以使用阿拉伯数字且很得体的地方, 均应使用阿拉伯数字 () 公历世纪年代年月日和时间时刻必须使用阿拉伯数字, 如 20 世纪 90 年代 h 30 min 30 s 等 ; 年份不能用简称, 998 年不能写作 98 年 (2) 物理量量值必须使用阿拉伯数字 (3) 非物理量量词前面数字一般也应使用阿拉伯数字, 如 3 支 5 根等 (4) 数值范围的表达要求 :5 万至 0 万应写成 5 万 ~0 万, 不能写成 5~0 万 ;3 0 9 至应写成 ~5 0 9, 或 (3~5) 0 9, 不能写成 3~5 0 9 ;60% 至 70% 不能写成 60~70%, 应写成 60% ~70% ;25.5±0.5 mg 应写成 (25.5±0.5)mg (5) 带单位的量值相乘时, 每个数值后单位不能省略, 如 4 mm 2 mm 3 mm, 不能写成 mm 或 mm 3 ( 本刊编辑部 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot