174 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留标准与检测串联质谱仪 (tandem mass spectrometry,ms/ms) 正在迅速成为复杂基质样品中多残留目标化合物筛查分析的理想技术, 在食品安全分析中具有非常广泛的应用本文建立了固相萃取 - 气相

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1 标准与检测 DOI: /j.issn 食品研究与开发 Food Research And Development 2017 年 7 月第 38 卷第 13 期 173 SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留王吉祥, 牛之瑞, 冯雷, 白祥, 杜四淮, 谭建林, 张晓红 ( 云南省产品质量监督检验研究院, 云南昆明 ) 摘要 : 建立固相萃取 - 气相色谱 - 三重四极杆串联质谱法测定茶叶中 49 种农药残留的分析方法样品经乙腈均质提取, 经 ENVI-Carb+Florisil 固相萃取小柱进行净化后, 采用气相色谱 - 三重四极杆串联质谱法在多反应监测 (MRM) 模式下测定, 外标法定量 49 种农药成分在 10 μg/ L~100 μg/ L 范围内有良好的线性关系, 相关系数在 ~ 范围内 ;49 种农药成分在 3 个添加水平下 ( μg/l), 加标回收率范围为 %~ %,RSD (n=6) 为 1.13 %~11.05 %; 各农药成分的检出限均小于 1.06 μg/kg 该方法样品处理简单快速, 灵敏度和选择性高, 适用于日常检测工作关键词 : 茶叶 ; 气相色谱 - 三重四级杆串联质谱法 ; 农药残留 Determination of 49 Kinds of Pesticide Residues in Tea by SPE and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry WANG Ji-xiang, NIU Zhi-rui, FENG Lei, BAI Xiang, DU Si-huai, TAN Jian-lin, ZHANG Xiao-hong (Yunnan Product Quality Supervision and Testing Academy,Kunming , Yunnan, China) Abstract: To develop an analysis method based on solid -phase extraction and gas chromatography -triple quadrupole tandem mass spectrometry(spe-gc-ms/ms) or the determination of 49 kinds of pesticide residues in Tea. Samples were extracted with acetonitrile, and then purified through ENVI-Carb+Florisil solid phase extraction(spe)cartridge, the prepared samples were then analyzed by GC-MS/MS in MRM mode,and the external standard method was applied to quantify the pesticides. All the 49 pesticides showed good linearity in the range of 10 μg/ L to 100 μg/ L (R 2 = ),the average recoveries of all the pesticides were in the range of % to % at three spiked levels of 10,50,100 μg/ L,the RSD (n=6) were in the range of 1.13 % to11.05 %; and the limits of detection (LOD) were all below 1.06 μg/kg. The method is suitable for the multiresidues analysis of pesticides in Tea. Key words: tea; gas chromatography-tandem mass spectrometry(gc-ms/ms); pesticide residues 云南是我国古老的茶区, 茶产业是云南省的民生产业, 同时茶叶是我国主要的经济作物, 也是我国主要出口农产品之一近年来, 欧盟以及日本等发达国家对进口茶叶的农药残留检测项目不断增加, 对限量 [1-3] 标准的要求也日趋严格茶叶的安全卫生状况, 特别是农药残留问题, 始终是全世界关注的大问题, 其分析技术的提高同样受到了高度重视近年来, 对茶叶中农药残留的分析方法有不少报道, 色谱 - 质谱联用法以其准确灵敏等特点逐步成为作者简介 : 王吉祥 (1983 ), 男 ( 汉 ), 工程师, 硕士, 研究方向 : 农药残留检测茶叶中农药残留检测最常用的方法在近两年发布的茶叶中农药残留检测方法的国家标准中, 也主要采用了气相色谱 - 质谱法液相色谱 - 串联质谱法目前国标中尚无用气相色谱串联质谱法检测茶叶中多种农 [4-6] 药残留的分析方法茶叶中含有数百种化学成分, 基质相对复杂, 常 [7] 用的色谱方法易受基质干扰, 且易产生假阳性结果气相色谱 - 三重四级杆串联质谱的优势在于其具有极高的选择性极强的抗干扰能力高灵敏度和高通量离子传输效率及准确定量的特点, 这使得该技术在复杂基质背景下仍能完成目标化合物的准确鉴定采用多反应监测 (multiple reaction monitoring,mrm) 模式的

2 174 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留标准与检测串联质谱仪 (tandem mass spectrometry,ms/ms) 正在迅速成为复杂基质样品中多残留目标化合物筛查分析的理想技术, 在食品安全分析中具有非常广泛的应用本文建立了固相萃取 - 气相色谱 - 三重四极杆串联质谱法测定茶叶中 49 种农药残留该方法简便准确毛细管柱 ; 载气 : 氦气, 纯度 %; 进样口温度 : 250 ; 柱温 : 初始温度 50, 保持 1 min, 然后以 25 / min 程序升温到 125, 再以 10 /min 程序升温到 300, 保持 15 min; 柱流速 :1.69 ml/min; 进样量 : 1 μl; 进样方式 : 不分流进样,1 min 后开阀快速实用, 各项技术指标满足检测要求, 能够很好的应用于茶叶农药残留的测定质谱条件电子轰击电离源 (EI 源 ) 电压为 70 ev; 离子源温 1 材料与方法度 200 ; 接口温度 250 ; 溶剂延迟时间 1.5 min; 碰撞气 : 氩气 ( 纯度 %); 岛津 GC Solution 工作 1.1 材料试剂与仪器 GCMS-TQ8030 气相色谱 - 三重四级杆串联质谱站 49 种农药成分的保留时间及优化的 MRM 参数见表 1 仪 : 日本 Shimadzu 公司 ; GL-12B 高速离心机 : 上海安亭科学仪器厂 ;N-EVAP 氮吹仪 : 美国 Organomation 公 2 结果与讨论司 ; CPA225D 电子天平 : 德国 Sartorius 公司 ; 十二孔固相萃取装置 : 美国 Waters 公司 2.1 [10-15] 提取溶剂的选择茶叶中含有大量色素, 特别是普洱茶红茶中色 ENVI-Carb 固相萃取小柱 (3 ml) Florisil 固相萃取小柱 (6 ml): 美国 Supelco 公司 ; 丙酮乙腈正己烷 ( 均为色谱纯 ): 美国 Fisher Scientific 公司普洱茶绿茶红茶乌龙茶白茶由云南省产品质量监督检验研究院提供 49 种农药标准品均购自农业部环境保护科研监测所, 质量浓度为 100 μg/ml 标准溶液的配制 : 分别准确吸取 1.0 ml 上述标准品, 用正己烷定容至 10 ml, 配成 mg/l 的标准储备液根据实际需要, 梯度稀释成系列浓度的标准工作溶液素含量更高, 且同时检测的农药品种数量较多, 极性差异较大, 因而对样品提取溶剂的选择要求较高本文采用乙酸乙酯乙腈丙酮二氯甲烷作为提取溶剂进行试验, 结果发现, 二氯甲烷溶出的色素和油脂较少, 但不能充分提取所有农药 ; 丙酮和乙酸乙酯能充分提取出大多数农药, 同时也溶出大量的油脂和色素, 增加了净化步骤和难度 ; 乙睛作为极性较强的溶剂对大多数农药都能有效提取, 且油脂和色素溶出率低, 基质干扰小, 回收率理想, 乙腈与净化时的 SPE 柱相匹配, 无需浓缩可直接过柱, 操作简便因此本试验采用乙睛作为提取溶剂 1.2 试验方法 2.2 固相萃取柱的选择样品制备参照现行农药残留测定有关国家标准方法及国准确称取制好的茶叶粉末 5.0 g, 加入 20.0 ml 乙腈, 超声 30 min,5 000 r/min 离心 10 min, 吸取 2 ml 上清液, 低温氮吹至净干, 用 2.0 ml 正己烷丙酮 (2 1, 体积比 ) 溶解, 待净化将 ENVI-Carb 小柱用 2.0 ml 正己烷丙酮 (2 1, 体积比 ) 预淋洗, 条件化, 当溶剂液面到达柱吸附层表面时, 立即倒入上述待净化溶液, 用 10 ml 比色管接收洗脱液约 8 ml, 低温氮吹至约 1 ml, 用正己烷丙酮 [10-15] 内外相关文献, 本文比较了常用于农药残留的几种固相萃取柱 :ENVI-carb+NH 2 柱 ENVI-carb+PSA 柱和 ENVI-carb+Florisil 柱, 结果 ENVI-Carb+Florisil 柱的净化效果最好, 供试品溶液颜色最浅, 总离子流中干扰峰较少, 回收率最好, 基质效应也较低, 最终选用 ENVI-Carb/Florisil 固相萃取柱作为固相萃取净化方法本方法采用 ENVI-carb 固相萃取柱作为固相萃取净化方法见图 1 (9 1, 体积比 )2 ml 溶解, 待下一步净化然后将 Florisil 小柱用 2.0 ml 正己烷丙酮 (9 1, 2.3 质谱条件的优化本方法选择 MRM 下的 2 对离子对进行各农药的体积比 ) 预淋洗, 条件化, 当溶剂液面到达柱吸附层表面时, 立即倒入上述待净化溶液, 用 10 ml 比色管接收洗脱液约 8 ml, 低温氮吹至净干, 用正己烷定容至 [8-9] 0.5 ml, 待测分析, 其中 1 对离子对用于定量分析为了获得最佳的质谱条件以保证对分析物定量和定性的准确性, 对待测物的前级离子产物离子碰撞能量等一系列质谱参数进行了优化首先采用全扫描 (Full Scan) 方式色谱条件色谱柱 :Rtx-5MS(0.25 mm μm 30 m) 石英获取待测物的前级离子, 之后采用产物离子扫描方式 (Product Scan) 通过优化碰撞能量获得产物离子, 最后

标准与检测 140 120 100 80 60 40 20 0 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留 ENVI-carb+NH 2 柱 ENVI-carb+PSA 柱 ENVI-carb+Florisil 柱 175 敌敌畏治螟磷甲拌磷 α-666 乐果 β-666 γ-666 特丁硫磷无氯硝基苯二嗪农 δ-666

1 图 1 49 种农药三种净化方法的回收率 Recoveries of 49 pesticide residues obtained by three Purification methods 采用 MRM 模式对待测物进行定性和定量分析经过方法优化可以得到较为理想的质谱条件和分离效果每种农药的离子对和碰撞能, 优化后见表 1 图 2 为优化条件下 10 μg/ml

3 标准与检测王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留 ENVI-carb+NH 2 柱 ENVI-carb+PSA 柱 ENVI-carb+Florisil 柱 175 敌敌畏治螟磷甲拌磷 α-666 乐果 β-666 γ-666 特丁硫磷无氯硝基苯二嗪农 δ-666 百菌清乙烯菌核利甲基对硫磷杀螟硫磷马拉硫磷倍硫磷毒死蜱对硫磷三唑酮三氯杀螨醇水胺硫磷甲基异柳磷二甲戊乐灵氟虫腈腐霉利杀扑磷丙溴磷 p.p'-dde 虫螨腈 p.p'-ddd O.p'-DDT 三唑磷 p.p'-ddt 异菌脲联苯菊酯亚胺硫磷甲氰菊酯伏杀磷氯氟氰菊酯氯菊酯哒螨灵蝇毒磷氟氯氰菊酯氟氰戊菊酯氰戊菊酯氟胺氰菊酯溴氰菊酯烯酰吗啉 Fig.1 图 1 49 种农药三种净化方法的回收率 Recoveries of 49 pesticide residues obtained by three Purification methods 采用 MRM 模式对待测物进行定性和定量分析经过方法优化可以得到较为理想的质谱条件和分离效果每种农药的离子对和碰撞能, 优化后见表 1 图 2 为优化条件下 10 μg/ml 基质加标工作液的总离子流 ( TIC) 色谱图 ( ) 峰度保留时间 /min Fig.2 图 2 49 种农药的总离子流色谱图 Chromatogram of MRM for 49 pesticide residues Table 1 表 1 49 种农药成分的保留时间及优化的 MRM 参数 Retention time and optimized MRM conditions of 49 pesticides 编号农药名称保留时间 /min 定量离子对碰撞能量 /V 定性离子对碰撞能量 /V 定性离子对碰撞能量 /V 1 敌敌畏 > > > 治螟磷 > > > 甲拌磷 > > > α > > > 乐果 > > > β > > > γ > > > 特丁硫磷 > > > 无氯硝基苯 > > > 二嗪农 > > > δ > > > 百菌清 > > > 乙烯菌核利 > > > 甲基对硫磷 > > > 杀螟硫磷 > > > 马拉硫磷 > > >145 6

4 176 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留续表 1 49 种农药成分的保留时间及优化的 MRM 参数 Continue table 1 Retention time and optimized MRM conditions of 49 pesticides 标准与检测编号农药名称保留时间 /min 定量离子对碰撞能量 /V 定性离子对碰撞能量 /V 定性离子对碰撞能量 /V 17 倍硫磷 > > > 毒死蜱 > > > 对硫磷 > > > 三唑酮 > > > 三氯杀螨醇 > > > 水胺硫磷 > > > 甲基异柳磷 > > > 二甲戊乐灵 > > > 氟虫腈 > > > 腐霉利 > > > 杀扑磷 > > > 丙溴磷 > > > p.p -DDE > > > 虫螨腈 > > > p.p -DDD > > > O.p -DDT > > > 三唑磷 > > > p.p -DDT > > > 异菌脲 > > > 联苯菊酯 > > > 亚胺硫磷 > > > 甲氰菊酯 > > > 伏杀磷 > > > 氯氟氰菊酯 , > > > 氯菊酯 , > > > 哒螨灵 > > > 蝇毒磷 > > > 氟氯氰菊酯 ,20.756,20.840, > > > 氟氰戊菊酯 , > > > 氰戊菊酯 , > > > 氟胺氰菊酯 , > > > 溴氰菊酯 , > > > 烯酰吗啉 > > > 基质效应茶叶成分复杂, 对于农药残留的检测也有一定的影响, 有些可能有基质增强作用, 有些可能有基质减弱效应对于气质农药残留分析, 通常会出现基质增强效应, 具体表现为使用农药标准品定量时会出现某种农药的回收率低于或高于可接受范围为了避免药材本身带来的基质效应, 采取基质混合标准品溶液的方法消除和减弱基质效应, 同时利用选择离子定量检测也可以大大提高分析方法的选择性, 排除一些杂质的干扰, 最终获得较满意的试验结果 2.5 线性关系与检出限在质量浓度为 10 μg/l ~100 μg/l 范围内, 用基质配制成 5 个浓度的混合标准品系列溶液, 在所确定的色谱条件下进行测定, 分别对 49 种农药成分的峰面积对其浓度进行线性回归, 建立标准曲线, 以 S/N 3 确定每种农药成分的检出限结果表明 : 所测定的 49 种混合农药的质量浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系, 相关系数 (r 2 ) 均大于 0.99, 各农药成分的检出限均小于 1.06 μg/kg, 具体结果见表 2

5 标准与检测 Table 2 编号农药名称表 2 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留 49 种农药的线性方程线性相关系数检出限以及加标回收率和精密度 Linear equations,correlation coefficients(r 2 ),limits of detection, the average recoveries and the relative standard deviations(rsd) 加标量 10 μg/l 50 μg/l 100 μg/l RSD/% (n=6) for 49 pesticides RSD/% (n=6) RSD/% (n=6) 线性方程 177 相关系数 (R 2 ) 检出限 / (μg/kg) 1 敌敌畏 Y= X 治螟磷 Y= X 甲拌磷 Y= X α Y= X 乐果 Y= X β Y= X γ Y= X 特丁硫磷 Y= X 无氯硝基苯 Y= X 二嗪农 Y= X δ Y= X 百菌清 Y= X 乙烯菌核利 Y= X 甲基对硫磷 Y= X 杀螟硫磷 Y= X 马拉硫磷 Y= X 倍硫磷 Y= X 毒死蜱 Y= X 对硫磷 Y= X 三唑酮 Y= X 三氯杀螨醇 Y= X 水胺硫磷 Y= X 甲基异柳磷 Y= X 二甲戊乐灵 Y= X 氟虫腈 Y= X 腐霉利 Y= X 杀扑磷 Y= X 丙溴磷 Y= X p.p -DDE Y= X 虫螨腈 Y= X p.p -DDD Y= X O.p -DDT Y= X 三唑磷 Y= X p.p -DDT Y= X 异菌脲 Y= X 联苯菊酯 Y= X 亚胺硫磷 Y= X 甲氰菊酯 Y= X 伏杀磷 Y= X 氯氟氰菊酯 Y= X 氯菊酯 Y= X 哒螨灵 Y= X 蝇毒磷 Y= X 氟氯氰菊酯 Y= X 氟氰戊菊酯 Y= X 氰戊菊酯 Y= X 氟胺氰菊酯 Y= X 溴氰菊酯 Y= X 烯酰吗啉 Y= X

6 添加回收率和精密度将农药混合标准贮备液添加到茶叶提取物中, 分别制成质量浓度为 μg/kg 的加标样品溶液, 在同一分析条件下进行 6 次试验, 计算各浓度下平均回收率及 RSD 结果表明 :49 种农药成分在 3 个添加水平下 ( μg/l), 加标回收率范围为 %~ %,RSD(n=6) 为 1.13 %~11.05 %, 方法的回收率和相对标准偏差满足多农药残留检测中的准确度和精密度的要求, 测定结果见表方法适用性采用本方法对 100 个茶叶样品 ( 普洱茶 30 个红茶 20 个绿茶 20 个乌龙茶 15 个白茶 15 个 ) 进行了分析测定, 仅有联苯菊酯 1 种农药检出, 含量在 mg/kg~0.078 mg/kg 之间 ( 均为普洱茶 ),GB 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量规定茶叶中联苯菊酯的最大残留限量分别为 5 mg/kg, 检出的农药残留水平均显著低于国家最大残留限量标准 3 结论试验通过优化检测条件, 利用气相色谱三重四极杆质谱仪, 建立了对茶叶中 49 种农药同时进行分析的方法本方法条件下 49 种农药完全基线分离, 每种化合物选择特征离子的两个二级离子, 降低干扰, 提高了灵敏度, 特别对于复杂基质中假阳性结果进行排除 49 种农药成分在 10 μg/l~100 μg/l 范围内有良好的线性关系, 相关系数在 ~ 范围内 ;49 种农药成分在 3 个添加水平下 ( μg/l), 加标回收率范围为 %~ %,RSD(n=6) 为 1.13 %~ %; 各农药成分的检出限均小于 1.06 μg/kg 本分析方法获得了满意的分离效果和检测灵敏度, 回收率精密度, 满足农药多残留分析的要求, 检出限能满足欧盟及美国日本等国的限量要求, 该方法为茶叶中多农残测定提供了简便的前处理方法和检测手段参考文献 : 王吉祥, 等 : SPE-GC-MS/MS 法测定茶叶中 49 种农药残留标准与检测业出版社,2001: [2] 佚名. 日本食品中农业化学品肯定列表制度对我国茶叶出口的影响及应对措施 [J]. 农化市场十日讯, 2006(17): 11 [3] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2000: 75 [4] 施家威, 李继革, 王玉飞, 等. 固相萃取 - 气相色谱 / 三重四级杆串联质谱分析蔬菜中 42 种农药残留 [J]. 色谱,2010,28(12): [5] 沈伟健, 余可垚, 桂茜雯, 等. 分散固相萃取 - 气相色谱 - 串联质谱法测定蔬菜中 107 种农药的残留量 [J]. 色谱,2009,27(4): [6] 孙磊丽, 李晓玉, 隋涛. 气相色谱串联质谱测定菠菜中有机氯残留量 [J]. 广州化工,2010,38(11): [7] 易盛国, 侯雪, 韩梅, 等. 气相色谱 - 串联质谱法检测蔬菜农药残留基质效应与基质分类的研究 [J]. 西南农业学报, 2012,25(2): [8] 中华人民共和国农业部. NY/T 蔬菜和水果中有机磷有机氯拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法 [S]. 北京 : 中国农业出版社,2008 [9] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T 水果和蔬菜中 500 种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱 - 质谱法 [S]. 北京 : 中国标准出版社,2006 [10] 王连珠, 周昱, 陈泳, 等.QuEChERS 样品前处理 - 液相色谱 - 串联质谱法测定蔬菜中 66 种有机磷农药残留量方法评估 [J]. 色谱, 2012,30(2):146 [11] 宋淑玲, 李重九, 马晓东, 等. 蔬菜中残留农药的石墨化碳黑净化和气相色谱 - 质谱检测方法 [J]. 分析化学,2008,36(11):23 [12] LEHOTAY SJ,DE KOK A,HIEMSTRA M,et al.validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection[j].jaoac Int,2005,88(2) : 595 [13] ANASTASSIADES M,LEHOTAY SJ,STAJNBAHER D,et al.fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce[j].jaoac Int,2003,86(2): 412 [14] LEHOTAY S J, SON K A, KWON H. Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables[j]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217 (16): [15] WILKOWSKA A, BIZIUK M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS Methodology [J]. Food Chemistry, 2011,125(3): [1] 岳永德, 花日茂, 张承祥. 茶叶农药残留与控制 [M]. 北京 : 中国农收稿日期 :

GC-MS/MS 测定土壤中多农药残留摘要 : 建立了三重四极杆气质联用仪 GC-MS/MS 结合改良的 QuEChERS 方法同时检测土壤中 42 种农药残留的分析方法在 5.0~100 µg/l 浓度范围内, 各农药组分相关系数均在以上对 30 µg/l 的标准溶液连续 5

GC-MS/MS 测定土壤中多农药残留摘要 : 建立了三重四极杆气质联用仪 GC-MS/MS 结合改良的 QuEChERS 方法同时检测土壤中 42 种农药残留的分析方法在 5.0~100 µg/l 浓度范围内, 各农药组分相关系数均在以上对 30 µg/l 的标准溶液连续 5 GC-MS/MS 测定土壤中多农药残留摘要 : 建立了三重四极杆气质联用仪 GC-MS/MS 结合改良的 QuEChERS 方法同时检测土壤中 42 种农药残留的分析方法在 5.0~100 µg/l 浓度范围内, 各农药组分相关系数均在 0.996 以上对 30 µg/l 的标准溶液连续 5 针进样, 峰面积的 RSD% 均小于 5% 加标浓度为 60 µg/l,42 种农药的加标回收率在 94.4~128.1%