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1 新型 快速 低成本 SPE 法检测乳制品中黄曲霉毒素解决方案 主讲 :Dikma 主办 : 食品伙伴网制作 : 鹤舞飞雪版权所有 : 食品伙伴网

2 目录 目录... 1 Foodspace 陈词... 2 课堂讲述... 4 一 黄曲霉毒素及其危害... 4 二 乳制品中黄曲霉毒素主要检测方法... 7 三 迪马科技 SPE 法检测黄曲霉毒素解决方案 在线问答 结束语

3 Foodspace 陈词 大家好, 食品大讲堂开课啦, 欢迎大家参与讨论 本次大讲堂讲课为有奖课程, 欢迎大家参与! 本次我们请到论坛迪马科技的 Dikma 老师为我们讲课, 讲课题目为 : 新型 快速 低成本 SPE 法检测乳制品中黄曲霉毒素解决方案 讲课老师简介 : Dikma, 论坛中级会员, 迪马科技技术培训讲师 -- 陈治春, 分析化学硕士, 近几年一直从事 固相萃取等样品前处理技术的市场培训工作, 培训用户涉及出入境检验检疫 质检 疾控 环境 科研院所 食品药品等系统, 得到用户的广泛认可 曾进行的培训包括 : 蒙牛乳业固相萃取及 HPLC 技术培训 / 金锣集团固相萃取技术培训 / 哈尔滨工业大学国际持久性有机污染物会议应用技术讲座全国食品药品检验系统固相萃取技术培训 / 第二届全国食品检测技术及实验室管理交流会 2011 中国青岛国际食品安全检测技术及仪器设备展览会技术培训 / 北京疾病预防控制系统固相萃取技术及 HPLC 技术培训山东省疾控系统固相萃取技术培训 / 吉林省质检系统固相萃取技术培训 / 浙江省公安系统固相萃取技术培训浙江省农科院固相萃取技术培训 / 湖北省农检系统固相萃取技术培训 迪马科技公司简介 : 迪马科技是一家始终致力于研发科学 高效的化学分析产品 服务和解决方案的知名色谱消耗品制造商, 拥有雄厚的研发实力和多项国内外技术专利, 尤其在色谱柱生产技术上更处于世界领先地位, 液相色谱柱 气相毛细管柱和样品前处理等产品深受用户的信赖 至今我们已成功推向市场, 取得骄人成绩的主要产品有 : 高效液相色谱柱 Diamonsil( 钻石 ) 系列 PLATISIL( 铂金 ) 系列 ; Inspire 系列 ; Spursil 系列 ;Bio-Bond 系列 ;Leapsil 系列 ;Endeavorsil 系列高效液相色谱柱保护柱 EasyGuard 系列 ; 气相毛细管色谱柱 DM 系列 ;PA 系列 ; 样品前处理 SPE 小柱 ProElut 系列 ; 溶剂 Dikma Pure 系列 ; 标准品 xstandard 系列 ; 针头式过滤器 Promax 系列 2

4 本次课程大纲 : 1 黄曲霉毒素及其危害 2 乳制品中黄曲霉毒素检测主要方法 3 迪马科技 SPE 法检测黄曲霉毒素解决方案 本课程即将结束预设问题如下 : 1. 黄曲霉毒素目前有多少中检测方法? 2. 迪马科技黄曲霉毒素检测方法属于哪种方法? 这种方法的原理是什么? 3. 请用自己的语言描述迪马科技黄曲霉毒素检测专用萃取柱的优势? 3

5 课堂讲述 下面开始我们今天的讲座 : 今天我们主要的内容是关于黄曲霉毒素的简单介绍及其危害 : 一 黄曲霉毒素及其危害 黄曲霉毒素 (AFT) 是一类化学结构类似的化合物, 均为二氢呋喃香豆素的衍生物 黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillus flavus)) 寄生曲霉 (a.parasiticus)) 产生的次生代谢产物, 在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高 产生的黄曲霉毒素主要有 B1 B2 G1 G2 以及另外两种代谢产物 M1 M2 其中 M1 和 M2 是从牛奶中分离出来的 B1 B2 G1 G2 M1 和 M2 在分子结构上十分接近 1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织 (WHO) 的癌症研究机构划定为 1 类致癌物, 是一种毒性极强的剧毒物质. 黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用, 严重时可导致肝癌甚至死亡 在天然污染的食品中以黄曲霉毒素 B1 最为多见, 其毒性和致癌性也最强 黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1) CAS 号 : 分子式 :C17H12O6 黄曲霉毒素 B2(Aflatoxin B2) CAS 号 : 分子式 :C17H14O6 分子量 :

6 黄曲霉毒素 G1(Aflatoxin G1) CAS 号 : 分子式 :C17H12O7 分子量 : 黄曲霉毒素 G2(Aflatoxin G2) CAS 号 : 分子式 :C17H14O7 分子量 : 黄曲霉毒素 M1(Aflatoxin M1 ) CAS 号 : 分子式 :C17H12O7 分子量 : 黄曲霉毒素对人体的危害 1 引起急 慢性中毒 : 5

7 黄曲霉毒素是剧毒物质, 其毒性相当于氰化钾的 10 倍, 砒霜的 68 倍 黄曲霉毒素属肝脏毒, 除抑制 DNA RNA 的合成外, 也抑制肝脏蛋白质的合成, 黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件, 国内外均有许多报导, 最典型的是印度的霉变玉米事件, 该事件直接导致了数十人丧生, 数百人患上不同类型的肝脏疾病 2 致癌性 : 黄曲霉毒素有极强的致癌性, 长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌 它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大 75 倍, 是目前公认的致癌性最强的物质之一 另据世界卫生组织报导, 黄曲霉毒素含量在 30 50ug/kg 时为低毒,50 100ug/kg 时为中毒, ug/kg 时为高毒, 1000ug/kg 以上为极毒 黄曲霉毒素的限量标准 1995 年, 世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为 15μg/kg; 美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量 ( 指 B1+B2+G1+G2 的总量 ) 不能超过 15μg/kg; 人类消费的牛奶中的含量不能超过 0.5μg/kg; 其他动物饲料中的含量不能超过 300μg/kg; 欧盟国家规定更加严格, 落花生和坚果及其加工产品和所有谷类食品及加工产品中黄曲霉毒素 B1 限量为 2.0μg/kg; 原奶 热处理奶及加工奶产品中 M1 限量为 0.050μg/kg; 婴儿食品 ( 包括婴幼儿奶 ) 中 M1 限量为 0.025μg/kg; 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量 食物名称 最高允许含量 /(μg/kg) 玉米花生 花生油 坚果和干果 ( 核桃杏仁 ) 20( 黄曲霉毒素 B1) 玉米, 花生仁制品 ( 按原料折算 ) 20( 黄曲霉毒素 B1) 大米 其他食用油 ( 香油, 菜籽油大豆油, 葵花油胡麻油, 茶油麻 10( 黄曲霉毒素 B1) 油, 玉米胚芽油米糠油, 棉籽油 ) 其他粮食 ( 麦类面粉, 薯干 ), 发酵食品 ( 酱油食用醋, 豆豉腐乳制品 ), 淀粉类制品 ( 糕点饼干, 面包裱花蛋糕 ) 牛乳及其制品 ( 消毒牛奶 新鲜生牛乳全脂牛奶粉 淡炼乳 甜炼乳 奶油 ), 黄油, 新鲜猪组织 ( 肝 肾 血 瘦肉 ) 5( 黄曲霉毒素 B1) 0.5( 黄曲霉毒素 M1) 乳品中黄曲霉毒素超标事件 2011 年 12 月 24 日国家质检总局公布了 10 月对涉及 21 个省市 128 家企业生产的 200 种液体乳产品展开的抽查结果, 涉及蛋白质 酸度 铅 无机砷 总汞 铬 黄曲霉毒素 M1 金黄色葡萄球菌 三聚氰胺等 18 个项目 质检总局发布的检测报告显示, 蒙牛乳业此批次超标产品由国家加工食品质量监督福州检验中心检出 被检测出黄曲霉毒素 M1 实测值为 1.2μg/kg, 国家规定的最高值为 0.5 6

8 μg/kg, 蒙牛该批次产品超标 140% 蒙牛该批次超标的产品为该集团眉山公司 2011 年 10 月 18 日生产的 250ML/ 盒包装的纯牛奶产品 公开资料显示, 黄曲霉毒素 M1 为已知的致癌物, 具有很强的致癌性 另一款福建长富乳品有限公司生产的长富纯牛奶 ( 精品奶 ) 也被检出黄曲霉毒素 M1 不 合格, 较标准超标 80% 2012 年 7 月 20 日, 广州市工商局在官网公布了近期对市面上乳制品及含乳食品的抽检结果 由湖南长沙亚华乳业有限公司生产的南山奶粉 5 个批次的婴幼儿奶粉均检出含有黄曲霉毒素 M1 值得注意的是, 知名品牌光明奶油 本土沙湾姜汁撞奶均在不合格之列, 爱馨多洋奶粉更是两月三登 黑榜 二 乳制品中黄曲霉毒素主要检测方法 测定黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法 (TLC) 高效液相色谱法 (HPLC) 酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 免疫亲和柱法 质谱法 (MS) 这些方法或多或少都具有如下不足之处 : (1) 在操作过程中, 需要使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物, 对操作人员造成巨大的沾污危险 ; (2) 操作过程烦琐 复杂 时间长, 劳动强度大 ; (3) 仪器设备昂贵 笨重 操作复杂, 难以实现现场快速分析 ; (4) 灵敏度较差, 重复性很难得到满意结果 ; 1 薄层层析法 薄层层析 (TLC) 是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术 自 1990 年它被列为 AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) 标准方法, 该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能 缺点 : 虽然简便, 但灵敏度差 2 液相色谱法 (LC) 液相色谱 (LC) 与薄层层析在许多方面具有相似性二者互相补充 通常用 TLC 进行前期的条件设定, 选择适宜的分离条件后再用 LC 进行黄曲霉毒素的定量测定 缺点 : 虽然灵敏度高, 但样品处理烦琐, 操作复杂, 仪器昂贵 3 酶联免疫法 (ELISA) 利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法也是最常用的黄曲霉毒素检测方法 7

9 1996 年,Nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术 由于该方法简便敏感, 特异可作为多种抗原或抗体的测定,20 世纪 70 年代后期该方法引入真菌毒素的检测中, 下 面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素 B1 原理 : 将已知抗原吸附在固态载体表面洗除末吸附抗原, 加入一定量抗体与待测样品 ( 含有抗原 ) 提取液的混合液竞争培养后, 在固相载体表面形成抗原抗体复合物. 洗除多余抗体成分然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物, 与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合再加入酶底物 在酶的催化作用下, 底物发生降解反应产生有色物质, 通过酶标检测仪测出酶底物的降解量从而推知被测样品中的抗原量 缺点 : 操作简单, 快速, 但灵敏度低且会出现假阳性, 重复性差, 试剂寿命短, 需要低温保存 4 免疫亲和柱 - 荧光分光光度法和免疫亲和柱 -HPLC 法 免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素 ( 如黄曲霉毒素 B1) 含量, 而且易出现假阳性结果难以控制 免疫亲和柱法 ( 包括荧光光度法和 HPLC 法 ) 却能达到既定量准确又快速简便的要求 黄曲霉毒素免疫亲和柱 - 荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段, 用荧光计紫外灯作为检测工具的快速分析方法 一个样品只需 10-15min, 比传统方法快几个小时甚至几天时间 ; 仪器设备轻便容易携带自动化程度高, 操作简单直接读出测试结果, 可以在小型实验或现场使用 黄曲霉毒素免疫亲和柱 - 高效液相色谱法比传统的 HPLC 法更加安全可靠, 灵敏度和准确度高 它采用单克隆抗体免疫技术可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来, 分离效率和回收率高 分析原理 : 试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇 / 水提取液经过过滤稀释后, 用免疫亲和柱净化以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来, 在淋洗液中加入溴溶液衍生以提高测定灵敏度, 然后用荧光分光光度计进行定量 也可以将甲醇 - 黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入 HPLC 中对黄曲霉毒素 B1,B2,G1,B2 分别进行定量分析 缺点 : 使用繁琐 价格昂贵 储存条件苛刻 保存期短等缺点 乳制品中黄曲霉毒素检测国标 1 GB 食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素 M1 和 B1 的测定 2 GB 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量 3 GB/T 食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 4 GB 食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1 的测定 5 GB/T 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 M2 的测定液相色谱 - 荧光检测法 8

10 6 GB/T 食品中黄曲霉毒素 B1 的测定 7 GB/T 食品中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 的测定 下面的涉及的内容的是迪马科技的固相萃取技术检测黄曲霉毒素, 那么我们就有必要先讲 解一下固相萃取技术 从整个样品分析流程我们可以看到, 固相萃取所起的作用是净化, 它与其他净化手段 ( 液液萃取 免疫亲和柱 凝胶渗透色谱 ) 一样, 目的都是 去除干扰物, 以便取得 : 更好的分离效果 更可靠的分析结果 更长的色谱柱寿命 更少的系统故障 富集痕量样品, 以便取得 : 更高的检测灵敏度 9

11 使样品与采用的分离与检测技术更匹配 溶剂强度的匹配 液质联机分析时消除离子抑制效应 固相萃取原理 固相萃取 (Solid Phase Extraction, 简称 SPE), 也称固相提取, 是一项结合了选择性保留 选择性洗脱等过程的分离技术 当复杂的样品溶液通过吸附剂时, 吸附剂会通过作用力选择性地保留目标化合物或者干扰物, 其他组分则透过吸附剂流出小柱, 然后用另一种洗脱能力较强的溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来, 从而实现对复杂样品的分离 纯化和富集 固相萃取一般分析操作步骤 活化 : 依次用强溶剂 弱溶剂 ( 缓冲溶液 ) 进行活化 ; 上样 : 用能够溶解样品的弱溶剂携带样品上柱, 既要保证样品分析物的有效溶解, 又要确保溶剂强度不至于把被分析化合物从柱上洗脱下来 ; 淋洗 : 用具有一定强度的混合溶剂淋洗去除干扰杂质, 确保杂质被洗脱, 而被分析化合物有效的保留在柱上 ; 10

12 洗脱 : 用较强的溶剂把被分析化合物从柱上替换洗脱下来 由于固相萃取过程是由目标物与吸附剂吸附剂之间的作用力产生和消失来实现样品的净化 的, 下面就简单说一下固相萃取过程涉及的作用力 1. 非极性相互作用力 定义 : 发生在吸附剂烃基和目标化合物烃基之间的作用力 ; 以非极性相互作用力来保留目标物的吸附剂也称反相吸附剂 典型的非极性相互作用吸附剂 :C18 C8 PH PLS; 能够在反相吸附剂上保留的化合物的特征 : 含有一定数量的碳链或苯环, 具有较低的水溶性 例如 : 牛奶中四环素类 氯霉素 糠氨酸 青霉素等 11

13 以四环素为例来说明 硅胶基质 C18 固相萃取柱为典型的反相萃取柱, 它是在硅胶上键合十八烷基得到的, 十八 烷基为长链的烃基, 具有很强的非极性 ( 既疏水性 ), 目标物为四环素, 分子结构中具有共同的氢化骈四苯环, 同样具有非极性, 因此二者之间非常容易产生非极性相互作用 在保留过程中, 使用极性溶剂体系 ( 比如说水 ) 使目标化合物与吸附剂之间通过非极性相互作用得到保留, 在洗脱过程中, 利用相似相容原理, 使用非极性溶剂体系破坏化合物与吸附剂之间的非极性相互作用力来实现洗脱目标化合物 2. 极性相互作用 定义 : 发生在目标化合物上的极性官能团与吸附剂上的极性官能团之间的作用力 ; 极性相互作用包括 : 氢键, 偶极距, 诱导偶极距,π-π 和其它多种相互作用力 ; 以极性相互作用力保留目标物的吸附剂也称正相吸附剂 典型的极性吸附剂 :Silica NH2 CN PSA; 能够在正相吸附剂上保留的化合物的特征 : 含有羟基 胺基, 羰基 巯基 双键以及带有杂原子的基团 12

14 例如正相吸附剂 NH2, 结构本身含有极性基团, 而目标物苯酚也含有极性基团 - 羟基, 二者在弱极性溶剂体系下发生极性相互作用使得目标物被吸附剂所保留, 其他成分则不被保留, 在洗脱时, 同样利用相似相容原理, 极性目标物更易溶于极性溶剂体系中, 从而使目标物脱离吸附剂被洗脱下来 3. 离子相互作用力 定义 : 发生在带电荷的目标化合物与带相反电荷的吸附剂之间的库伦力 ; 典型的离子交换吸附剂 : ProElut SCX,SAX,PXC,PXA,PWC,PWA ; 能够在离子交换吸附剂上保留的化合物的特征 : 含有能够阳离子化的伯胺 仲胺 叔胺 季铵等基团 ; 含有能够阴离子化的磺酸 羧酸 磷酸以及其它类似基团 例如 : 磺胺类 沙星类 三聚氰胺 甲醛等 固相萃取技术应用领域 食品领域 ( 农残, 兽残 ): 动物组织 内脏 饲料及植物样品 : 净化及浓缩 环境领域 : 水体 : 富集痕量污染物 13

15 土壤 沉积物 : 去除杂质和富集痕量污染物 医药领域 : 血浆 血清 尿样, 内脏 : 净化及浓缩 其他更多. 使用离子交换吸附剂保留目标物时 : 首先需调整溶液 ph 值使目标物和吸附剂都带电荷, 以阳离子交换吸附剂 PXC 为例, 由于吸附剂本身的磺酸基团具有很强的解离性, 因此常态下基本都是以阴离子形式存在, 为使目标物三聚氰胺能够保留在吸附剂上, 需要调整溶液的 ph 值使三聚氰胺带正电荷, 在样品提取步骤或上样步骤中使用有机酸就是为了使三聚氰胺离子化带正电荷, 同时溶液中带正电荷的其他竞争离子浓度低也保证了三聚氰胺阳离子完全与吸附剂阴离子产生离子相互作用从而被保留 ; 洗脱时需使离子相互作用消失, 同样是调整溶液的 ph 值使目标物或吸附剂不带电荷, 在这个例子中, 磺酸基团解离性强, 无法通过调整 ph 值来使吸附剂不带电荷, 因此只能通过调整溶液的 ph 值使目标物三聚氰胺不带电荷, 在实际操作中, 洗脱的步骤常使用 5% 的氨水甲醇溶液, 这里氨水的作用就是调整溶液的 ph 值使三聚氰胺阳离子变为分子从而从阳离子将换吸附剂上脱离下来, 同时溶液中其他带正电荷的离子浓度加大, 占据原来三聚氰胺阳离子与磺酸阴离子的交换位点, 也会使三聚氰胺更快的脱离吸附剂从事实现洗脱 固相萃取柱类型 14

16 Dikma 公司自主开发了 ProElut SPE 系列产品 涵盖硅胶键合 有机聚合物以及其他吸附剂 三大类十六种固相萃取柱 1. ProElut 硅胶键合吸附剂 高纯硅胶键合有机硅烷得到带有功能基团的吸附剂 ; 封端处理, 吸附剂的性质由功能基团决定 ; 硅胶键合吸附剂 ph 范围 :2~7.5; 硅胶键合吸附剂呈现刚性 ; 硅胶颗粒 : 球形, 粒径均匀, 表面光滑 15

17 硅胶与不同的硅烷化试剂键合得到不同类型的吸附剂, 如硅胶键合硅烷化试剂中 R 基团为红 色部分基团得到反相吸附剂, 非极性相互作用, 键合蓝色部分基团为正相吸附剂, 极性相互作用, 键合黄色部分基团为离子交换吸附剂 2. ProElut 高分子聚合物吸附剂 高分子聚合物吸附剂与传统硅胶键合反相吸附剂比较 : 16

18 传统硅胶键合反相吸附剂 ( 如 C18) 高分子聚合物吸附剂 ( 如 PLS) 通用性 极性化合物保留较差 极性和弱极性化合物均可保留 稳定性 柱床容易干涸 具有水可润湿性柱床不容易干涸 ph 值适用范围 吸附容量 小 保留化合物多, 容量大比 C18 高 3-10 倍 3. 混合型离子交换吸附剂 将不同的离子基团分别键合到 PLS 的苯环上就得到了混合型离子交换吸附剂, 它们分别是 : PXC: 混合型阳离子交换吸附剂, 由 PLS 吸附剂键合磺酸基团得到, 兼具阳离子交换和反 相两种保留模式, 适用于碱性化合物的纯化 ; PXA: 混合型阴离子交换吸附剂, 由 PLS 吸附剂键合季胺基团得到, 兼具阴离子交换和反 相两种保留模式, 适用于酸性化合物的纯化 ; PWC: 混合型弱阳离子交换吸附剂, 由 PLS 吸附剂键合羧基得到, 兼具弱阳离子交换和反 相两种保留模式, 适用于强碱性化合物的纯化 ; PWA: 混合型弱阴离子交换吸附剂, 由 PLS 吸附剂键合哌嗪得到, 兼具弱阴离子交换和反 相两种保留模式, 适用于强酸性化合物的纯化 ; 17

19 4. 复合柱 ProElut CARB/NH2 ProElut CARB/PSA ProElut SAX/PSA 有等量的两种填料填装而成, 目前主要用于农残分析 三 迪马科技 SPE 法检测黄曲霉毒素解决方案 乳制品中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 的检测 1 适用范围 适用于牛奶 奶粉等乳制品中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 的检测 2 样品准备 / 提取 2.1 牛奶 原料乳等液态奶制品 18

20 (1) 称取 2 g 样品, 加入 2 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min; (2) 再加入 4 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min,4000rpm, 离心 5 min; (3) 取上清液 4 ml, 作为上样液待净化 2.2 奶粉等固体奶制品 (1) 称取 2 g 样品, 加入 5mL 水, 涡旋混合 2min, 样品与水充分混匀 ; (2) 加入 5 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min; (3) 再加入 10 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min,4000rpm, 离心 5 min; (4) 取上清液 5 ml, 作为上样液待净化 3 SPE 柱净化 ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱 1500 mg/12 ml(cat.#65904) (1) 活化 : 10 ml 乙腈, 流出液弃去 ; (2) 上样 : 将上样液加入柱中 ( 流速控制每滴 / 两秒 ), 接收流出液 ; (3) 洗脱 : (4) 重新溶解 : (5) 衍生 : 10 ml 乙腈洗脱 ( 流速控制每滴 / 两秒 ), 收集流出液 合并步骤 (2) (3) 流出液 ; 在 40 下用减压蒸馏将流出液浓缩至大约 2 ml, 向旋蒸瓶中加入 5 ml 无水乙醇, 继续减压蒸馏完全干燥 ; 依次加入 0.5 ml 正己烷和 0.5 ml 三氟乙酸, 旋好玻璃塞充分混匀衍生液,45 静置 10 min 然后挥干衍生液, 用 10% 乙腈水溶液定容至 0.5 ml 4 分析条件 色谱柱 : Diamonsil C18(2),250 mm 4.6 mm,5μm(cat.#99603) 流速 : 1.0 ml/min 检测器 : 荧光检测器,Ex:365 nm;em:435 nm 柱温 : 30 进样量 : 20 μl 流动相 : A: 水 ; B: 异丙醇 + 乙腈 =3+2 梯度设置 时间 /min A% B%

21 5 添加回收结果 5.1 牛奶中黄曲霉毒素添加回收结果 分析物 添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD(n*=4)/% 黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 G 黄曲霉毒素 G 黄曲霉毒素 M 奶粉中黄曲霉毒素添加回收结果 分析物 添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD(n*=4)/% 黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 G 黄曲霉毒素 G 黄曲霉毒素 M 黄曲霉毒素 HPLC 图 5.4 牛奶中黄曲霉毒素检测 HPLC 图 20

22 5.5 奶粉中黄曲霉毒素检测 HPLC 图 黑色 : 黄曲霉毒素标准溶液 1.0 ng/ml 色谱图 ; 蓝色 : 奶粉中黄曲霉毒素加标 2.0 μg/kg 色谱图 ; 粉色 : 奶粉未添加黄曲霉毒素色谱图 黄曲霉毒素检测相关产品信息 ( 现货 ): ( 参考 GB 乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1 的测定,GB/T 食品中黄 曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 的测定等标准 ) 货号名称规格 样品前处理 黄曲霉毒素检测专用固相萃取柱 ProElutTM AFT 1500mg/12mL, 20/pk ( 可用于黄曲霉毒素总量及黄曲霉毒素 M1 的测定 ) 82O-COIAC1005 黄曲霉毒素 M1 免疫亲和柱 3mL, 25/pk 82O-COIAC1001 黄曲霉毒素总量 (B1 B2 G1 G2) 免疫 亲和柱 1mL, 25/pk 21

23 82O-COIAC1004 黄曲霉毒素总量 (B1 B2 G1 G2) 免疫 亲和柱 3mL, 25/pk 管防交叉污染真空 SPE 萃取装置 12 位 ,3,6mL 柱管通用连接器 15/pk 4806 考克 ( 控制流量 ) 15/pk 真空 / 正压两用泵, 无油 1/pk 抽滤瓶套装 ( 包括硅橡胶管 2 米,2L 抽滤 瓶及橡胶塞 ) 1/pk 针头式过滤器 Nylon 13mm,0.22μm 100/pk 针头式过滤器 Nylon 13mm,0.45μm 100/pk 标准品 U-1EA 黄曲霉毒素混标 (B1,B2,G1,G2) U-1EA 黄曲霉毒素 M1[ ] U-1EA 黄曲霉毒素 B1[ ] U-1EA 黄曲霉毒素 B2[ ] U-1EA 黄曲霉毒素 G1[ ] U-1EA 黄曲霉毒素 G2[ ] 5 1mL in Methanol 1μg/mL 0.3μg/mL 1μg/mL 1mL 1mL (98:2) 1mL (98:2) 1mL (98:2) 1mL (98:2) 色谱柱及保护柱 反相高效液相色谱柱 Diamonsil C18(2) mm, 5μm 6201 EasyGuard C18 保护柱 mm 1/pk 2 个柱芯 +1 个柱套 UPLC 专用色谱柱 Endeavorsil C18 1.8μ, mm HPLC 溶剂 Ÿ 缓冲盐 Ÿ 离子对试剂 甲醇 HPLC 级 4L 乙腈 HPLC 级 4L 甲酸 HPLC 级 50mL 异丙醇 HPLC 级 4L 丙酮 HPLC 级 4L 正己烷 HPLC 级 4L 三氟乙酸 HPLC 级 50mL 通用色谱产品 52401B 瓶架 / 蓝色 ( 现货 ) 50 孔 22

24 52401A 瓶架 / 白色 ( 现货 ) 50 孔 5323 样品瓶 ( 棕色 / 螺纹 ) 2mL, 100/pk 5325 样品瓶盖 / 含垫 ( 已经组装 ) 100/pk H80465 HPLC 进样针 25μL 迪马科技黄曲霉毒素专用固相萃取柱检测乳制品中黄曲霉毒素 M1 样品准备 / 提取 牛奶 原料乳等液态奶制品 (1) 称取 5g 样品, 加入 5mL 乙腈, 涡旋混合 1min; (2) 再加入 10mL 乙腈, 涡旋混合 1 min,4000rpm, 离心 5min; (3) 取上清液 5mL, 作为上样液待净化 奶粉 乳酪等固体奶制品 (1) 称取 2g 样品, 加入 5mL 水, 涡旋混合 2min, 样品与水充分混匀 ; (2) 加入 5mL 乙腈, 涡旋混合 1 min; (3) 再加入 10mL 乙腈, 涡旋混合 1min,4000rpm, 离心 5min; (4) 取上清液 5mL, 作为上样液待净化 SPE 柱净化 ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱 1500mg/12mL(Cat# 65904) (1) 活化 : 10mL 乙腈, 流出液弃去 ; (2) 上样 : 将上样液加入柱中, 接收流出液 ; (3) 洗脱 : 10mL 乙腈洗脱, 收集流出液 合并步骤 (2) (3) 流出液 ; (4) 重新溶解 : 在 40 下用减压蒸馏将流出液浓缩至大约 2mL, 向旋蒸瓶中加入 5mL 无 水乙醇, 继续减压蒸馏近干, 用 10% 乙腈水定容至 0.5mL, 供 HPLC 分析 分析条件 色谱柱 : Diamonsil C18(2),250 mm 4.6 mm,5μm(cat# 99603) 流速 : 检测器 :* 1.0mL/min 荧光检测器,Ex:365 nm;em:435 nm 柱温 : 30 23

25 进样量 : 20 μl 流动相 : 乙腈 : 水 =25:75 牛奶中黄曲霉毒素 M1 添加回收结果 分析物添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD(n*=4)/% 黄曲霉毒素 M 黄曲霉毒素 M 奶粉中黄曲霉毒素 M1 添加回收结果 分析物添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD(n*=4)/% 黄曲霉毒素 M 黄曲霉毒素 M 乳酪中黄曲霉毒素 M1 添加回收结果 分析物添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD(n*=4)/% 黄曲霉毒素 M 黄曲霉毒素 M

26 25

27 26

28 黄曲霉毒素检测相关产品信息 ( 现货 ): 27

29 ( 参考 GB 乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1 的测定,GB/T 食品中黄 曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 的测定等标准 ) 货号名称规格 样品前处理 黄曲霉毒素检测专用固相萃取柱 ProElutTM AFT ( 可用于黄曲霉毒素总量及黄曲霉 毒素 M1 的测定 ) 1500mg/12mL, 20/pk 82O-COIAC1005 黄曲霉毒素 M1 免疫亲和柱 3mL, 25/pk 82O-COIAC O-COIAC1004 黄曲霉毒素总量 (B1 B2 G1 G2) 免疫亲和柱黄曲霉毒素总量 (B1 B2 G1 G2) 免疫亲和柱 1mL, 25/pk 3mL, 25/pk 管防交叉污染真空 SPE 萃取装置 12 位 ,3,6mL 柱管通用连接器 15/pk 4806 考克 ( 控制流量 ) 15/pk 真空 / 正压两用泵, 无油 1/pk 抽滤瓶套装 ( 包括硅橡胶管 2 米,2L 抽滤瓶及橡 胶塞 ) 1/pk 针头式过滤器 Nylon 13mm,0.22μm 100/pk 针头式过滤器 Nylon 13mm,0.45μm 100/pk 标准品 5 1mL in Methanol Aflatoxin B1, 1μg/mL U-1EA 黄曲霉毒素混标 (B1,B2,G1,G2) Aflatoxin B2, 0.3μg/mL Aflatoxin G1, 1μg/mL Aflatoxin G2, 0.3μg/mL U-1EA 黄曲霉毒素 M1[ ] 1mL, 10μg/mL in acetonitrile U-1EA 黄曲霉毒素 B1[ ] 1mL 3μg/mL in 28

30 benzene:acetonitrile (98:2) 1mL U-1EA U-1EA U-1EA 黄曲霉毒素 B2[ ] 黄曲霉毒素 G1[ ] 黄曲霉毒素 G2[ ] 色谱柱及保护柱反相高效液相色谱柱 Diamonsil C18(2) 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2) 1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2) 1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2) mm, 5μm 6201 EasyGuard C18 保护柱 mm 1/pk 2 个柱芯 +1 个柱套 UPLC 专用色谱柱 Endeavorsil C mm, 1.8μm HPLC 溶剂 Ÿ 缓冲盐 Ÿ 离子对试剂 甲醇 HPLC 级 4L 乙腈 HPLC 级 4L 甲酸 HPLC 级 50mL 异丙醇 HPLC 级 4L 丙酮 HPLC 级 4L 正己烷 HPLC 级 4L 三氟乙酸 HPLC 级 50mL 通用色谱产品 52401B 瓶架 / 蓝色 ( 现货 ) 50 孔 52401A 瓶架 / 白色 ( 现货 ) 50 孔 5323 样品瓶 ( 棕色 / 螺纹 ) 2mL, 100/pk 5325 样品瓶盖 / 含垫 ( 已经组装 ) 100/pk H80465 HPLC 进样针 25μL 固相萃取方法与同类方法比较 方法净化测定方法优势与不足 29

31 GB 食品安全国家标准食品中黄曲液液萃取霉毒素 M1 和 B1 的测定 GB/T 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 M2 免疫亲和柱的测定液相色谱 - 荧光检测法 薄层色谱法方法灵敏度 0.1~0.5 ug/kg 液相色谱 - 荧光检测法衍生液 : 过溴化溴化吡啶溶液检出限见表 优势 : 可同时进行定性 定量分析不足 : 前处理 繁琐, 重现性差, 回收 率结果无法保证 优势 : 专一性强, 回收 率结果稳定不足 : 价格 昂贵, 保存条件严格 第一法液相色谱 串联质谱法第 GB 食品第一 二 三法免疫二法高效液相色安全国家标准乳和乳制亲和柱第四法酶谱法第三法荧品中黄曲霉毒素 M1 的联免疫试剂盒光分光光度法第测定四法双流向酶联免疫法 免疫亲和柱, 专一性强, 回收率稳定, 但价格昂 贵, 保存条件严格酶联 免疫试剂盒 : 操作简单, 快速, 容易出现假阳性 迪马科技方法 ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱 高效液相色谱法 ( 也可采用其他国标推荐方法 ) 优势 : 回收率稳定, 重现性好, 价格便宜, 操作简单 在线问答 Q: 对这个话题一直比较感兴趣, 也有些自己的知道的东西, 大家切磋交流一下 黄曲霉毒素 M1 是由牛 羊等食用了被黄曲霉毒素 B1 污染的饲料后, 在体内经过羟基化产生的 主要存在于乳汁及肾 肝 乳腺中 动物肌肉中的霉菌毒素残留量较少, 而容易出现在动物制品中, 如奶等 蒙牛 南山等检出黄曲霉毒素后, 将原因归结为饲料霉变等 而易检出霉菌毒素的饲料原料包括 : 玉米 豆粕 花生粕等 现在很多畜牧业人士认为, 近几年气候的多变是导致霉菌毒素远高于以往的原因 A1: 把罪名归咎于气候是最没有说服力的, 气候多变, 管理跟上就是了, 再说气候也不能仅仅就影响一个批号的产品吧, 看看野老师提的问题 : 被曝光企业都是仅有一个批次产品牛乳中发现黄曲霉毒素 M1.. A2: 我觉得是因为根本无法解释原因, 但是必须有个交代, 所以, 蒙牛 南山等检出黄曲霉毒素后, 才将原因归结为饲料霉变等 实际上, 如果真是饲料的原因, 不可能仅有一两个批次产品出现问题的 A3: 我听畜牧业的网友说, 饲料霉变的可能性并不大, 奶牛口味很重, 霉变饲料基本不吃 因为我没去过养牛场, 所以也不敢肯定这种说法 饲料中没有规定黄曲霉毒素不得检出 饲料中黄曲霉毒素的卫生标准 GB , 奶牛精料补充料不大于 10 ( 每千克产品中,μg) 如您所说, 如真的是饲料问题, 确实不太可能只是一两个批次的 30

32 A4: 我说的是 : 现在很多畜牧业人士认为, 近几年气候的多变是导致霉菌毒素远高于以往的原因 指的是饲料中黄曲霉毒素 而不是说牛奶超标的原因归结到气候 当然, 管理肯定是没到位 比如, 即使天气不多变, 挺多饲料储存室的环境湿度非常大, 但很少有人细心地去管 Q: 南山是被检查到的半年内 5 个批次全部黄曲霉毒素超标, 不是只有一个批次 A: 饲料导致的黄曲霉毒素污染牛奶, 一般在一周内的全部产品 所以, 检验结果还是不太让我看得懂 Q: 对于牛奶中检出黄曲霉毒素 M1 的事情, 我始终有疑问! 就是, 乳牛食用了含有毒素的饲料, 牛乳排出黄曲霉毒素 M1 的持续期肯定比较长, 不可能是一过性的 我想问问老师 : 怎么解释所有被曝光企业都是仅有一个批次产品牛乳中发现黄曲霉毒素 M1 的现象? 我提出这个问题的前提是, 技术监督局抽查了有问题的批次产品的前后几个批次产品都没有问题 A: 个人理解, 不知道正确与否是否因为乳品生产企业每个批次的奶源都是不一样的, 可能某个批次的奶源是有受到黄曲霉毒素污染的, 而其余批次的是没有受到污染的追问 : 吃一次含有黄曲霉毒素的饲料, 排出毒素的持续时间大约为一周 奶牛每天都要挤奶两次, 这些固定的奶源不送给生产企业是不可能的 我只想提问 : 谁能解释现在的那些检验结果无法解释的饲料黄曲霉毒素污染一说? A: 其实饲料污染只是一种解释的理由, 你信就是真的 实际的问题还是质控不到位, 既然别人能检出来有超标, 为什么在乳品出厂的时候没有检出来呢? Q: 老师, 请问一下, 我们是用的是黄曲霉试剂盒, 然后用酶标仪检测, 不知这种方法是不是老师讲到的方法里的一种 不好意思一种没弄明白 A: 是的, 你这属于比较快速的方法, 但是定量的准确性有待考证 Q: 迪老师,B1 B2 G1 G2 M1 都看到了, 怎么没有 M2 呐 A: 黄曲霉毒素 M2 相对来说是检得少一些, 可能由于黄曲霉毒素 M1 的致癌性比较强, 是乳制品中需重点监控的 Q: 我不明白为什么一出奶粉的问题, 一般都是婴幼儿奶粉比较多捏? A1: 因为婴幼儿奶粉在奶粉市场中占有最大的比例, 同时国家对婴幼儿奶粉的监督检查力度也最大 A2: 我个人认为, 对于奶粉, 婴幼儿是奶粉的长期且最大的消费群体, 使用后的症状与现象最容易被观察注意到 ; 同时婴幼儿的体质与成人相比也是较弱的 ; 相比之下, 其他的什么脱脂奶粉 中老年奶粉等, 在我的生活圈子内, 暂时真的很少有人长期的食用 ; 个人观点, 期待与大家的探讨 A3: 婴幼儿饮用不适的症状还是容易被观察到的, 这个确实 可能真的是其他奶粉不是没有问题, 而是在消费者饮用后症状不明显, 或没有症状 追问 : 这个我知道, 我想知道的是为什么其他类奶粉 ( 比如中老年 ) 都没听有什么负面报道捏, 奶粉一出事情, 基本上就是婴幼儿奶粉, 难道其他类奶粉就很好嘛 31

33 A: 可能是中老年奶粉市场战友有率低, 相对来说质量事故发现得少 另外老年人本来健康 问题多一些, 吃奶粉吃出问题来了, 人们也不容易往奶粉上靠, 以后中本身身体状况的原因 Q: 老师能否详细讲解下检测的化学原理 A: 固相萃取 (Solide Phase Extraction,SPE) 是利用吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附, 与样品的基质和干扰化合物分离, 然后再用洗脱液洗脱, 达到分离或者富集目标化合物的目的 固相萃取实际上采用的是液相色谱的分离原理, 分离模式主要包括反相 正相 离子交换和吸 固相萃取所用的吸附剂与液相色谱常用的固定相相同, 只是在填料的形状和粒径上有所区别 追问 : 偶的意思是化学成分, 似乎涉及到快速检测的核心技术, 但是快速检测的依托以及检测精确程度是业内人士最关注的东西, 这个东西精确程度到底有多高, 可能群众不会关注这个问题, 俺想知道的是他的与色谱法 酶联免疫等方法的误差有多大 因为只要是快速检测方法, 目前都涉及到检测限度的问题, 这才是我们最关心的, 如果有相应文献支持是最好不过的! A: 这些特点, 我想应该是迪老师需要着重讲解的拉 Q: 什么类型的 SPE 啊, 上边只是说了些不疼不痒的东东 A: 这款固相萃取小柱是迪马科技专为黄曲霉毒素分析开发的, 具体的填料类型属于企业机密, 不方便透漏 这个固相萃取方法也是迪马科技自己开发的方法, 大家可以通过回收率等结果看到, 这个方法在检测黄曲霉毒素方面还是很不错的, 目前也有一些单位在尝试使用我们这个方法 Q: 请问老师, 这里提供的标准品试剂是否可以直接订购, 需不需要到公安备案什么的? 另外, 买回来之后储存有没有特别规定? 是否也需要像剧毒品一样管理?? A: 标准品是可以直接订购的, 迪马科技对于剧毒 易制毒的化学品也是不销售的关于标准品的保存问题, 这个在您订购时销售人员会和您明确说明是否需要低温或者避光等特殊条件存放的 Q: 我也来掺和了! 不知道 DIMA 的 spe 小柱是啥填料, 书上有两种方法净化, 一个是多功能净化柱, 一个是酶联免疫小柱, 感觉还是酶联免疫法净化的完全 DIMA 的 spe 小柱是啥填料, 相对于哪一类! A: 目前用于黄曲霉毒素分离纯化的产品有两类 : 一是免疫亲和柱 (IAC), 它是将特异性的 AFT 抗体与适当的固定相结合填柱而成, 特异性强, 灵敏度较高, 但价格也较高 ; 二是多功能净化柱 (MFC) 它是一种特殊的 SPE 柱, 以极性 非极性及离子交换等儿类基团组成填充剂, 可选择性吸附样液中的脂类 蛋白类等杂质, 黄曲霉毒素不被吸附而直接通过, 多功能净化柱的操作更为简便, 不需要进行活化 淋洗和洗脱操作只需直接上样,10 秒钟内即可完 迪马科技的固相萃取方法与第二种多功能净化柱比较接近 Q:3 SPE 柱净化 ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱 1500 mg/12 ml(cat.#65904) A: 到此才看到! 重点, 采用的何种!! 就是它 ProElutTM AFT! 32

34 过程中发现你蒸发的太干了, 有才! 衍生三氟乙酸怕水呵呵估计影响回收率! 并且挥干衍 生液也挥干? 氮吹吗, 这个不能高温就室温就行了, 如果超过 40 度, 回收会低 Q: 迪马老师! 我比较愚钝! 看完你讲的小柱, 有 3 类 16 种, 又讲了这么多作用力! 不过没看到你有关 ProElutTM AFT 的介绍, 它是免疫柱还是啥填料! 请详解, 能跟别的品牌比较就好了! 欢迎拍砖 A: 这个方法是迪马科技自己开发的, 没有看到其他公司有用固相萃取方法, 我们只是提供一种新的解决方案分析工作者选择合适自己的方法, 在回收率等方面我们也有很好的数据支持 因目前检测黄曲霉毒素不同的人会用不同的方法, 所以我们未对各种方法进行详细的比较 如果您做过黄曲霉毒素的分析, 相信您自己也可以比较出该方法与您的方法的优势与劣势 Q: 回想了一下!ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱应该就是类似多功能净化柱, 绝非免疫柱, 为什么? 可以从迪马老师的讲解中找到答案 : 样品处理 : 再加入 10 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min,4000rpm, 离心 5 min;(4) 取上清液 5 ml, 作为上样液待净化 这里面是纯乙腈, 取 5ml 就上样, 没有经过 PBS 缓冲盐调整 ph, 和降低乙腈含量, 如果是免疫小柱, 直接造成免疫小柱蛋白变性, 甚至溶解, 意味着破坏了免疫小柱, 提请测试的新手多加注意! 感谢迪马老师给我们带来新的测试方法! 能免费送一包测试小柱就更好了, 免疫柱 元一根, 这玩意有毒又耗钱, 打死也不做! 哎还是在检测, 不过有些东西真的有!!! A: 免费赠送, 这个真的可以有我们针对这次活动特别推出了 黄曲霉毒素检测专用 SPE 小柱免费试用申请表, 你只要完整填写表格就可以获得试用装一包, 如果发送您的试用心得还可以获得更大的奖励 亲爱的版友们, 行动起来吧! Q: 乳制品中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 的检测 1 适用范围适用于牛奶 奶粉等乳制品中黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2 M1 的检测 我是做食品中的, 还要肉酱制品! 迪马老师这个小柱适用吗??? A: 目前我们只用这款小柱开发了奶制品中黄曲霉毒素的检测解决方案, 其他基质还未尝试, 如要进行肉酱基质中黄曲霉毒素的检测, 可能前处理方面要进行一下调整, 如您感兴趣, 欢迎致电 迪马科技客服中心了解更多信息 Q: 来的迟, 问题学生! 呵呵请教迪马老师! 黄曲霉毒素本身有荧光, 参加百度 物质特点物化特性在紫外线下黄曲霉毒素 B1,B2 发蓝色荧光黄曲霉毒素 G1,G2 发绿色荧光. 黄曲, 为啥还要三氟乙酸衍生! A: 虽然黄曲霉毒素本身是有荧光的, 但是不衍生直接检测无法得到好的响应值, 达不到国标的检出限的要求, 因此需要衍生加入基团, 增强响应值 Q:SPE 方法比衍生法要节省多是时间? 有做过统计吗? A: 这个方法是当时蒙牛黄曲霉毒素 M1 超标时间出来时做的, 当时时间比较紧, 所以并没有与其他方法进行比较 33

35 因为样品提取及净化过程都非常简单, 所以整个方法从称样到完成分析一个小时之内应该是可以完成的 Q: 免疫亲和柱确实贵, 我们买来都没有怎么用过, 一直是用的试剂盒做的 A: 是的, 免疫亲和柱贵是普遍的反应, 我们的固相萃取方法比试剂盒还要便宜, 有兴趣可以申请试用装尝试一下 Q: 分析条件还缺了仪器型号 A: 仪器型号在这里不是重点, 我们应用实验室使用的是岛津的的高效液相色谱仪, 您使用其他品牌的仪器或者使用其他的检测方法都是可以的 Q: 请问老师,(1) 在新鲜马乳中如何能简便 快速的检测黄曲霉毒素的含量 (2) 新鲜马乳的黄曲霉毒素的含量标准是多少? 谢谢老师指导... A:1. 马乳也可以采用迪马科技检测牛乳的固相萃取高效液相色谱法 2. 个人意见 : 新鲜马乳的含量标准应该和牛乳差不多吧 结束语 本次大讲堂课程结束, 欢迎大家关注食品大讲堂, 关注迪马科技 感谢迪马科技, 感谢大家积极参与, 如果大家有什么问题欢迎继续发帖讨论 本次讲课获奖结果已经公布 : 34

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