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优志水
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1 第 19 卷第 4 期生命科学研究灾燥造援员 9 晕燥援 4 圆园 15 年 8 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Aug. 圆园 15 白藜芦醇对胰腺癌细胞增殖和凋亡影响的研究李伟 1, 罗霞 2, 马小倩 1* (1. 中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗中心, 中国湖南长沙 4113; 2. 湖南省肿瘤医院 / 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院中心实验室, 中国湖南长沙 4113) 摘要 : 为了研究白藜芦醇对人胰腺癌细胞增殖和存活的影响, 利用不同浓度白藜芦醇处理 PANC-1 和 BxPC-3 细胞, 通过 MTS 和软琼脂集落实验检测白藜芦醇对胰腺癌细胞的停泊依赖和停泊非依赖增殖的抑制遥同时, 采用免疫印迹的方法, 检测不同浓度白藜芦醇对胰腺癌细胞增殖相关信号通路的调控, 及不同时间点凋亡激活相关蛋白分子的表达遥结果发现白藜芦醇能剂量依赖性抑制 PANC-1 和 BxPC-3 细胞增殖, 并且这种增殖抑制作用与表皮生长因子受体 (epithelial growth factor receptor, EGFR) 及下游信号通路的抑制有关遥一定浓度的白藜芦醇能诱导胰腺癌细胞发生凋亡,caspase3 和 caspase7 被剪切活化遥通过检测 Bcl-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2) 促存活家族蛋白, 证实白藜芦醇能有效抑制 Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1, Mcl-1) 的表达, 并不改变 Bcl-2 和 Bcl-XL 的表达遥实验结果初步表明, 白藜芦醇抑制胰腺癌的增殖与存活与 EGFR 信号通路及促存活蛋白 Mcl-1 的表达下调有关遥关键词 : 胰腺癌 ; 白藜芦醇 ; 细胞增殖 ; 表皮生长因子受体 (EGFR); Mcl-1 中图分类号 :Q279 文献标识码 :A 文章编号 : (215) Study on the Effects of Resveratrol on Proliferation and Apoptosis of Pancreatic Cancer Cells LI Wei 1,LUO Xia 2,MA Xiao-qian 1* (1. Cell Transplantation and Gene Therapy Institute, the 3rd Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 4113, Hunan, China; 2. Department of Central Laboratory, the Affiliated CancerHospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Hunan Cancer Hospital, Changsha 4113, Hunan, China) Abstract: To investigate the effects of resveratrol on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cells, PANC-1 and BxPC-3 cells were treated with various concentrations of resveratrol for different time points, the proliferation was evaluated by MTS and soft agar assay. Meanwhile, the signaling transduction pathway after resveratrol treatment and the expression of the protein which involved in apoptosis were tested via immunoblotting. The results showed that resveratrol inhibited the proliferation of PANC-1 and BxPC-3 cells in adose-dependent manner. Moreover, the effects of resveratrol mediated proliferation inhibition of pancreatic cancer cells was related to the suppression of epithelial growth factor receptor (EGFR) signaling pathway. Additionally, acertain concentration of resveratrol can directly induce apoptosis in pancreatic can 原 cer cells, which result in the activation of caspase3/caspase7 and down-regulation of the expression of myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1). The primary data demonstrated that the suppression of EGFR signaling path 原 way and down-regulation of Mcl-1 expression are involved in resveratrol mediated proliferation inhibition in pancreatic cancer cells. Key words: pancreatic cancer; resveratrol; cell proliferation; epithelial growth factor receptor (EGFR); Mcl-1 (Life Science Research, 215, 19(4): 294 耀 298) 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ; ) 作者简介 : 李伟 (1984-), 男, 湖南澧县人, 助理研究员, 博士, 主要从事肿瘤的癌变机制的研究, weililx@126.com; * 通讯作者 : 马小倩 (1982-), 女, 湖南长沙人, 中南大学助理研究员, 博士, 主要从事肿瘤的信号转导通路以及免疫学研究,Tel: , mxq8933@hotmail.com

2 第 4 期李伟等 : 白藜芦醇对胰腺癌细胞增殖和凋亡影响的研究 295 来自食物的天然产物抗肿瘤活性研究已成为当今肿瘤化学预防的一大热点白藜芦醇 (resver 原 atrol) 是一种蒽醌萜类 ( 非黄酮 ) 多酚化合物, 于 194 年首次从毛叶藜芦的根部分离得到白藜芦醇具有广泛的生物学活性, 如抗菌免疫调节心血管和神经保护等近年来, 白藜芦醇被证实具有抗多种肿瘤 ( 如乳腺癌结肠癌前列腺癌白血 [1, 2] 病和食道癌等 ) 的作用因而备受关注虽然白藜芦醇能在体内外抑制多种肿瘤的增殖存活与转移, 但白藜芦醇抗多种肿瘤的分子机制及其潜在靶点还有待进一步研究 [3] 胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤近年来其发病率呈逐年上升趋势, 已成为我国常见的十大恶性肿瘤之一由于其早期诊断和治疗困难, 而且目前缺乏较好的治疗药物, 胰腺癌病人 5 年生存率不足 5% 目前对胰腺癌的治疗, 仍以外科手术切除为主, 结合放化疗等综合治疗, 但由于胰腺癌常常发现较晚而失去了手术根治的机会, 多器官转移与复发仍是胰腺癌患者高死亡率 [4, 5] 的主要原因之一目前, 对胰腺癌的病因认识尚不清楚, 除了遗传因素因素外, 其发病可能与 [6] 吸烟饮酒等不良的饮食食管及环境污染有关深入研究胰腺癌发病的分子机制, 寻找其有效的化学预防及治疗手段可能为降低胰腺癌的发病率及治愈率带来新的希望本研究以人胰腺癌细胞系 PANC-1 和 BxPC-3 为模型, 观察白藜芦醇对其增殖存活的影响, 并对白藜芦醇抗胰腺癌的分子机制进行初步探讨 1 材料与方法 1.1 细胞系人胰腺癌细胞系 PANC-1 和 BxPC-3 购自中南大学医学细胞中心 1.2 主要试剂 / 试剂盒和主要抗体和仪器 RPMI-164 和 DMEM 培养基, 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 和双抗生素 ( 青霉素和链霉素, P&S) 购自 Invitrogen 公司 ( 美国 ); p-egfr-tyr168 (#3777) p-erk1/2-thr22/tyr24 (#437) p-akt- Ser473(#46) Bcl-2(#287) Bcl-XL(#2764) Mcl- 1(#5453) cleaved-caspase3(#9664) 和 cleaved-cas 原 pase7 (#8438) 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司 ( 美国 ); (A5316) 抗体和白藜芦醇 ( 纯誖度 >97%) 购自 Sigma 公司 ( 美国 ) CellTiter 96 AQ ueous one solution cell proliferation assay kit 购自 Promega ( 美国 ), BCA 蛋白定量试剂盒购自 Pierce ( 美国 ), 酶标仪 EL * 8 型购自 Bio-Tek ( 美国 ); 电泳仪与转移仪购自 Bio-Rad ( 美国 ) 1.3 主要方法细胞培养 PANC-1 和 BxPC-3 细胞以含有 1% FBS 和 1% 双抗生素的 RPMI-164 培基常规培养, 每 1~2 d 换液, 细胞融合度达到 8% 时传代 HUVEC 细胞以含有 1% FBS 和 1% 双抗生素的 DMEM 培基常规培养, 每 1~2 d 换液, 细胞融合度达到 8% 时传代 MTS 实验取对数增殖期细胞按照 4/ 孔的密度接种于 96 孔板中次日, 加入不同浓度的白藜芦醇于 96 孔板中共培养细胞, 在加入白藜芦醇后的 24 h 48 h 誖和 72 h 时间点分别加入 2 滋 L 的 Cell Titer 96 AQ ueous One Solution 试剂 37 益,5% CO 2 的细胞培养箱中孵育 1.5h, 酶标仪 49nm 读取吸光度值停泊非依赖生长 ( 软琼脂集落形成 ) 实验 1) 准备 1.25% 琼脂凝胶和 2 伊 BME 并 46 益保温备用 2) 准备下层琼脂凝胶 (18 ml 体系 ): 其中含有 2 伊 BME (7 ml), L-Glutamine (2 ml), Gentam 原 icin (1 滋 L), 1 伊 PBS (18 ml), FBS (18 ml) 预热后加入 1.25% agar (72 ml) 将准备好的下层琼脂凝胶和不同浓度的白藜芦醇混匀后迅速加入六孔板中, 每孔 3mL, 超净台中静置 1h, 使其充分凝固 3) 制备细胞悬液取对数生长期细胞, 消化后计数, 用含 1%FBS 的 1 伊 BME 稀释成 3/mL 细胞悬液备用 4) 制备含有细胞悬液的上层凝胶取下层凝胶 2.4 ml ( 含不同浓度的白藜芦醇 ), 加入 1.2 ml 细胞悬液, 轻轻吹打混匀, 迅速加入含有下层凝胶的六孔板中, 每孔 1mL 待上层琼脂凝固后, 置于 37 益,5% CO 2 培养箱中培养, 静置 1~2 周用显微镜进行克隆统计细胞总蛋白的抽提及蛋白质浓度的测定和 Western blotting 分析白藜芦醇预处理细胞 24 h, 弃培基,1 伊 PBS 洗 3 次, 弃 PBS, 每孔加入 1 滋 LRIPA (25 mmol/l Tris HCl ph 7.6, 15 mmol/l NaCl, 1% NP-4, 1% sodium deoxycholate,.1% SDS) 细胞裂解液冰上裂解 5min, 将细胞裂解液转移至 EP 管中, 冰上

296 生命科学研究圆园 15 年 3 s 超声粉碎,4 益,13 r/min 离心 15 min, 转移上清至新的 EP 管中上清液中蛋白浓度用 BCA 蛋白定量试剂盒测定取 3 滋 g 蛋白在变性不连续 SDS-PAGE 电泳中分离并电转移至硝酸纤维膜含蛋白的硝酸纤维膜置于 5% 脱脂牛奶中室温封闭 2h, 再与特异性单克隆抗体 4 益孵育过夜,1 伊 PBST 洗涤 3 次, 每次

3 296 生命科学研究圆园 15 年 3 s 超声粉碎,4 益,13 r/min 离心 15 min, 转移上清至新的 EP 管中上清液中蛋白浓度用 BCA 蛋白定量试剂盒测定取 3 滋 g 蛋白在变性不连续 SDS-PAGE 电泳中分离并电转移至硝酸纤维膜含蛋白的硝酸纤维膜置于 5% 脱脂牛奶中室温封闭 2h, 再与特异性单克隆抗体 4 益孵育过夜,1 伊 PBST 洗涤 3 次, 每次 1 min 二抗室温孵育 1h, 1 伊 PBST 洗涤 3 次, 每次 1 min, 加入 ECL 化学发光底物,X 光片曝光显影定影统计学分析实验数据利用 SPSS 13. 统计软件包进行统计学分析, 统计不同时间不同组别间的比较采用多因素的方差分析, 实验组与对照组间的比较采用 t 检验 * 代表 P<.5, 说明两组之间具有显著性差异 2 结果 2.1 白藜芦醇抑制人胰腺癌细胞系的增殖首先, 我们采用 MTS 的实验方法检测不同浓度白藜芦醇对胰腺癌细胞系增殖的影响结果如图 1 所示,15 滋 mol/l 白藜芦醇对 PANC-1 ( 图 1A) 和 BxPC-3 ( 图 1B) 细胞的停泊依赖增殖没有抑制作用但随着白藜芦醇浓度的升高和处理时间的延长, 白藜芦醇开始对胰腺癌细胞系的增殖产生抑制效应 3 滋 mol/l 白藜芦醇在处理 PANC-1 和 BxPC-3 细胞 72 h 时, 对细胞的增殖抑制率达到约 3%, 3 滋 mol/l 白藜芦醇在处理这两株细胞至 72 h 时, 约降低其增殖能力的 5% (P<.5) 这一结果说明, 白藜芦醇能呈时间和剂量依赖性抑制人胰腺癌细胞系的增殖同时, 我们采用急性细胞毒性实验检测白藜芦醇对正常细胞的毒性作用, 利用人正常的血管内皮细胞 HU 原 VEC, 按照 1 伊 1 4 / 孔细胞数接种于 96 孔板中, 并给予不同浓度的白藜芦醇处理 24 h 和 48 h, MTS 检测细胞的增殖, 发现白藜芦醇不能显著抑制正常细胞的增殖 ( 图 1C) 利用克隆形成实验, 我们进一步检测了白藜芦醇对胰腺癌细胞软琼脂集落形成能力这一恶性表型的影响结果显示, 白藜芦醇剂量依赖性抑制了 PANC-1 ( 图 2A) 和 BxPC-3 ( 图 2B) 细胞的停泊非依赖生长 2.2 白藜芦醇抑制 EGFR 信号通路 Western blot 结果显示, 白藜芦醇处理后能明显抑制 PANC-1 和 BxPC-3 ( 图 3A) 细胞内 EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR) 信号通路的活化, 而且具有明显的剂量依赖性给予 PanC-1 细胞 3 滋 mol/l 白藜芦醇处理不同的时间点, 免疫印迹检测 EGFR 的磷酸化状态, 结果表明 ( 图 3B), 白藜芦醇能时间依赖性抑制胰腺癌细胞内 EGFR 的磷酸化活化白藜芦醇处理 2h 时, EGFR 的磷酸化活化抑制并不明显, 但 4h 时, 出现显著下调,8h 时, 下调更为明显说明白藜芦图 1 Fig.1 Untreated 15 滋 mol.l -1 resveratrol 3 滋 mol.l -1 resveratrol 6 滋 mol.l -1 resveratrol t/h Untreated 15 滋 mol.l -1 resveratrol 3 滋 mol.l -1 resveratrol 6 滋 mol.l -1 resveratrol 24 (C) 白藜芦醇对 PANC-1 和 BxPC-3 细胞的停泊依赖性增殖的影响 The effect of PANC-1 and BxPC-3 cells anchorage-dependent growth induced by resveratrol t/h h 48 h Resveratrol concentration/( 滋 mol.l -1 ) 图 2 白藜芦醇对 PANC-1 和 BxPC-3 细胞停泊非依赖生长的影响 Fig.2 The effect of PANC-1 and BxPC-3 cells anchorage-independent growth treated by resveratrol

第 4 期李伟等 : 白藜芦醇对胰腺癌细胞增殖和凋亡影响的研究 297 醇抑制 EGFR 信号通路有时间及剂量依赖性 Akt 和 ERK1/2 是 EGFR 下游与细胞生长和增殖密切相关的蛋白激酶, 我们发现,Akt 和 ERK1/2 的磷酸化水平也随着 EGFR 的磷酸化下调而剂量依赖性抑制,6 滋 mol/l 白藜芦醇处理细胞明显抑制了 Akt 和 ERK1/2 的活化

3 The change of EGFR signaling pathway in pan 鄄 creatic cancer cells induced by resveratrol 2.

pase3 和 caspase7 的剪切体活化, 而且随着处理时间延长,caspase3 和 caspase7 的剪切体表达更为明显而 PANC-1 细胞只有 3 滋 mol/l 白藜芦醇处理 48 h 才出现 caspase3 和 caspase7 剪切体的形成 ( 图 4A) 我们研究已经证实, 白藜芦醇并不能显著抑制正常血管内皮细胞的增殖,

4 第 4 期李伟等 : 白藜芦醇对胰腺癌细胞增殖和凋亡影响的研究 297 醇抑制 EGFR 信号通路有时间及剂量依赖性 Akt 和 ERK1/2 是 EGFR 下游与细胞生长和增殖密切相关的蛋白激酶, 我们发现,Akt 和 ERK1/2 的磷酸化水平也随着 EGFR 的磷酸化下调而剂量依赖性抑制,6 滋 mol/l 白藜芦醇处理细胞明显抑制了 Akt 和 ERK1/2 的活化这提示白藜芦醇对胰腺癌细胞的增殖抑制作用可能与受体酪氨酸激酶 EGFR 及其下游生长信号通路的抑制有关 PANC1 Bxpc p-egfr(y168) p-erk1/2 p-akt(s473) t/h p-egfr 图 3 白藜芦醇对胰腺癌细胞 EGFR 信号通路的影响 Fig.3 The change of EGFR signaling pathway in pan 鄄 creatic cancer cells induced by resveratrol 2.3 白藜芦醇促进凋亡相关分子的活化进一步实验我们检测了白藜芦醇对胰腺癌细胞凋亡的影响利用 3 滋 mol/l 白藜芦醇分别处理 PANC-1 和 BxPC3 细胞 12 h 24 h 和 48 h, Western blot 检测凋亡相关蛋白 caspase3 和 cas 原 pase7 的剪切体形成结果显示,BxPC-3 细胞对白藜芦醇更敏感, 在处理 12 h 时即开始出现 cas 原 pase3 和 caspase7 的剪切体活化, 而且随着处理时间延长,caspase3 和 caspase7 的剪切体表达更为明显而 PANC-1 细胞只有 3 滋 mol/l 白藜芦醇处理 48 h 才出现 caspase3 和 caspase7 剪切体的形成 ( 图 4A) 我们研究已经证实, 白藜芦醇并不能显著抑制正常血管内皮细胞的增殖, 因此在一定浓度的白藜芦醇对正常细胞的凋亡诱导应该并不明显, 通过免疫印迹我们发现, 给予 3 滋 mol/l 白藜芦醇处理细胞 HUVEC 和 Bxpc-3 细胞 48 h, 白藜芦醇能明显诱导 caspase-3 和 caspase-7 剪切体的形成, 但并不能促进 HUVEC 细胞内 cas 原 pase-3 和 caspase-7 的剪切活化 ( 图 4B) 这说明, 白藜芦醇能直接诱导胰腺癌细胞发生凋亡, 并且不会影响正常细胞生存 Resveratrol/h Cleaved-caspase7 Cleaved-caspase3 图 4 白藜芦醇对胰腺癌细胞 caspase3 和 caspase7 剪切体形成的影响 Fig.4 The effect of cleaved-caspase3 and cleaved-cas 鄄 pase7 expression in pancreatic cancer cells treated by resveratrol 2.4 白藜芦醇抑制胰腺癌细胞 Bcl-2 家族促存活蛋白的表达 3 3 FL-caspase3 Cleaved-caspase3 为了进一步研究白藜芦醇促进胰腺癌细胞凋亡的分子机制, 我们检测了白藜芦醇处理对胰腺癌细胞内 Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) 家族促细胞存活蛋白的表达 Western blot 结果表明, 虽然随着 3 滋 mol/l 白藜芦醇处理时间的延长, 依然不能明显改变 Bcl-2 和 Bcl-XL 的表达, 但是 Bcl-2 家族促细胞存活蛋白 Mcl-1 (myeloid cell leukemi 原 a-1) 的表达却被白藜芦醇抑制, 这一现象在 Bx 原 PC-3 细胞内尤为显著, 在白藜芦醇处理 BxPC-3 细胞 12 h 时,Mcl-1 的表达即开始下调, 这也与图 4 中 caspase3 和 caspase7 剪切体表达上调的结果一致,BxPC-3 细胞对白藜芦醇诱导的细胞凋亡更为敏感 ( 图 5) 这一结果提示, 白藜芦醇对胰腺癌细胞系凋亡的诱导可能与细胞内促存活蛋白的表达改变有关 Resveratrol/h Bcl-XL Bcl-2 Mcl-1 PANC Bxpc kd 17 kd 图 5 白藜芦醇对 Mcl-1 表达的影响 Fig.5 The effect of Mcl-1 expression induced by resveratrol kd FL-caspase7 19 kd 17 kd Cleaved-caspase7 PANC1 Bxpc kd 2 kd

5 298 生命科学研究圆园 15 年 3 讨论胰腺癌是目前人类肿瘤中预后最差的恶性肿瘤该病发病十分隐蔽, 其特异性症状不明显, 早期诊断十分困难, 多数患者在确诊时已处于晚期, 这也是胰腺癌高死亡率的重要原因之一胰腺癌好发于胰头部位, 约占 7% 左右, 胰体胰尾次之, 也有的头体尾部均有胰腺癌具有弥漫性病变或多中心性病变的病理特征, 而且, 由于其高侵润性和转移性, 使得胰腺癌患者获得根治性手术的机会大为 [7] 降低因此, 加大对胰腺癌发病机理的研究, 并以预防为主, 早期发现, 结合及时手术及综合治疗才可能为有效降低胰腺癌死亡率带来新的希望化学预防已成为近年来肿瘤预防的研究热点研究表明, 多种从食物来源的天然小分子化合物具有明显的抗肿瘤活性白藜芦醇是一种大量存在于葡萄 ( 红葡萄酒 ) 和花生内的多酚类化合物, 白藜芦醇除了能预防动脉粥样硬化等心血管疾病及抗炎抗氧化作用外, 其还能对多种肿瘤发挥明显抑制效果体内外实验业已证实, 白藜芦醇可以通过影响肿瘤细胞周期演进, 促进细胞凋亡, 抑制侵袭转移和血管新生而发挥其抗多种肿 [8, 9] 瘤的生物学效应快速增殖是恶性肿瘤的一大主要生物学特征已有的研究报道表明, 白藜芦醇可以通过下调细胞周期素 cyclin 的表达, 抑制细胞周期素依赖的蛋白激酶 CDK (cyclin-dependent kinases) 的活性或上调细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制子的 [1] 表达而干扰肿瘤细胞的周期行进我们的研究表明, 白藜芦醇能呈剂量依赖性和时间依赖性抑制人胰腺癌细胞 PANC-1 和 BxPC-3 的增殖而且软琼脂集落形成实验的结果也证实, 白藜芦醇剂量依赖性抑制这两种胰腺癌细胞的克隆形成能力受体酪氨酸激酶 EGFR 及其介导的下游信号通路常在多种上皮来源的肿瘤细胞中高表达或异常活化这一信号转导通路的异常是肿瘤细胞快速增殖及抗凋亡等一系列恶性表型的重要使动因 [11] 素我们研究结果发现, 不同浓度的白藜芦醇在处理胰腺癌细胞 24 h 后, 能有效下调 EGFR 及其下游增殖存活相关蛋白激酶 Akt 和 ERK1/2 的磷酸化, 而且, 这种抑制效应具有显著的剂量依赖性这一结果也进一步印证了前面 MTS 和软琼脂集落形成实验的结果, 提示白藜芦醇抗胰腺癌的活性可能与其介导的细胞增殖抑制相关细胞生长是增殖与凋亡平衡的动态过程细胞凋亡是目前研究最为透彻的细胞死亡方式之一, 其最终由胞内的效应 caspase 蛋白 (caspase3 和 caspase7) 执行生物学功能,caspase3 和 cas 原 pase7 剪切体的形成是其激活及细胞凋亡发生的标志之一 [12] 我们前期研究观察到高浓度白藜芦醇对胰腺癌细胞的增殖抑制非常显著, 这提示在白藜芦醇的诱导下, 胰腺癌细胞有发生凋亡的可能性我们的研究首次证实了白藜芦醇在体外不仅能明显促进胰腺癌细胞内 caspase3 剪切体的形成, 也能显著上调 caspase7 剪切体的表达水平这说明, 白藜芦醇除了能抑制胰腺癌细胞的增殖之外, 其还能一定程度上诱导凋亡的发生细胞凋亡信号的整合主要由 Bcl-2 家族蛋白及线粒体共同执行以 Bcl-2 Bcl-XL 和 Mcl-1 为代表的 Bcl-2 促细胞存活蛋白家族能促进肿瘤细胞对死亡信号通路的抑制和凋亡逃逸其中 Bcl-2 通过抑制线粒体细胞色素 C 的释放, 达到阻止细胞凋亡的级联反应过程 Bcl-XL 可以通过与 Bcl-2 家族促凋亡分子相互结合形成异二聚体, 抑制促凋亡蛋白分子功能的发挥, 或者是定位于线粒体外膜, 在外界压力刺激下维持线粒体的电势稳态从而发挥其抗凋亡功能 Mcl-1 定位于线粒体, 与促凋亡 Bcl-2 家族成员互作和拮抗, 抑制细胞毒性刺激诱导的细胞凋亡 [13,14] 细胞内 Bcl-2 家族促存活蛋白的表达下调是细胞发生凋亡前的常见分子事件我们的研究发现, 白藜芦醇处理虽然不能明显改变 Bcl-2 和 Bcl-XL 的蛋白表达水平, 但却剂量依赖性抑制了 Mcl-1 的表达已有的研究证明, 作为短寿命蛋白,Mcl-1 的表达受到多个转录因子的调控在食管癌中, 转录因子 NF- 资 B 的过度活化是肿瘤细胞中 Mcl-1 异常高表达的主要原因 [15] 而白藜芦醇抑制肿瘤细胞内转录因子 NF- 资 B 的转录活性是其抗肿瘤的机制之一在人胰腺癌中, 白藜芦醇促进 Mcl-1 的表达下调是否与白藜芦醇抑制的 NF- 资 B 转录活性有关还有待进一步研究证实本研究丰富了白藜芦醇的抗肿瘤生物学机制, 为白藜芦醇用于胰腺癌的化学预防与潜在的治疗可能提供了实验依据参考文献 (References): [1] LEE KW, BODE AM, DONG Zi-gang. Molecular targets of phytochemicals for cancer prevention[j]. Nature Reviews. Can 原 cer, 211, 11(3): ( 下转第 32 页 )

6 32 生命科学研究圆园 15 年感染效率, 这可能与弱碱性环境能够帮助慢病毒 [5] 克制细胞表面唾液酸对病毒的抵抗作用有关 Polybrene 是一种助感染试剂, 其工作原理是通过中和病毒与细胞之间电荷排斥力 ( 唾液酸抵抗力 ) [6] 来提高感染效率, 这与弱碱性 ph 的工作原理基本一致, 所以我们又对二者对感染效率的提高进行了对较, 并尝试了调节 ph 至弱碱性与 Poly 原 brene 联合应用来提高感染效率经实验发现病毒液 ph 在 8~9 附近的慢病毒感染效率最高, 加入 Polybrene 有助于不同 ph 下整体感染效率的提升, 并且加入 Polybrene 后仍然是 ph 在 8~9 的慢病毒感染效率最高我们的研究结果表明, 仅考虑 ph 因素, 调节慢病毒液至弱碱性同时使用 Polybrene 能够最大限度提升慢病毒感染效率参考文献 (References): [1] COCKRELL AS, KAFRI T, et al. Gene delivery by lentivirus vectors[j]. Molecular biotechnology, 27, 36(3): [2] SHI Q. Lentivirus-mediated platelet-derived factor 峪 gene therapy in murine haemophilia A[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 27, 5(2): [3] LEE JA. Lentiviral transfection with the PDGF-B gene im 原 proves diabetic wound healing[j]. Plastic and Reconstructive Surgery, 25, 116(2): [4] LOGAN AC. Factors influencing the titer and infectivity of lentiviral vectors[j]. Human Gene Therapy, 24, 15(1): [5] YANG JC. Effective prevention and treatment of Helicobacter pylori infection using a combination of catechins and sialic acid in AGS cells and BALB/c mice[j]. Journal of Nutrition, 28, 138(11): [6] DAVIS HE. Charged polymers modulate retrovirus transduc 原 tionviamembranechargeneutralizationandvirusaggregation[j]. Biophysical Journal, 24, 86(2): ( 上接第 298 页 ) [2] BODE AM, DONG Zi-gang. Cancer prevention research-then and now[j]. Nature Reviews. Cancer, 29, 9(7): [3] MCCARTHY N. Pancreatic cancer: spotlight on BRG1[J]. Na 原 ture Reviews. Cancer, 214, 14(4): 213. [4] MAKER AV, CARRARA S, JAMIESON NB, et al. Cyst fluid biomarkers for intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas: Acritical review from the international expert meet 原 ing on pancreatic branch-duct-intraductal papillary mucinous neoplasms[j].journal oftheamericancollegeofsurgeons,215, 22(2): [5] HIDALGO M, CASCINU S, KLEEFF J, et al. Addressing the challenges of pancreatic cancer: Future directions for improv 原 ing outcomes[j]. Pancreatology, 215, 15(1): [6] KLEIN AP. Identifying people at ahigh risk of developing pancreaticcancer[j].naturereviews.cancer,213,13(1): [7] BAPAT AA, HOSTETTER G, von HOFF DD, et al. Perineu 原 ral invasion and associated pain in pancreatic cancer[j]. Na 原 ture Reviews. Cancer, 211, 11(1): [8] NOVELLE MG, WAHL D, DIEGUEZ C, et al. Resveratrol supplementation, where are we now and where should we go[j] [9] SINGH CK, NDIAYE MA, AHMAD N, et al. Resveratrol and cancer: Challenges for clinical translation[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 214, 215,1852(6): [1] ATHAR M, BACK J H, KOPELOVICH L, et al. Multiple molecular targets of resveratrol: Anti-carcinogenic mechanisms[j]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 29, 486(2): [11] TEBBUTT N, PEDERSEN MW, JOHNS TG, et al. Targeting the ERBB family in cancer: couples therapy[j]. Nature Reviews. Cancer, 213, 13(1): [12] MOURATIDIS PX, COLSTON KW, DALGLEISH AG, et al. Doxycycline induces caspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cells[j]. International Journal of Cancer, 27, 12(4): [13] CORY S, ADAMS J M: The Bcl-2 family: regulators of the cellularlife-or-death switch[j]. Nature Reviews.Cancer, 22, 2 (9): [14] MAURER U, CHARVET C, WAGMAN AS, et al. Glycogen synthase kinase -3 regulates mitochondrial outer membrane permeabilization and apoptosis by destabilization of MCL-1[J]. Molecular Cell, 26, 21(6): [15] LIU Hai-dan, YANG Jin-fu, YUAN Yun-chang, et al. Regu 原 lation of Mcl-1 by constitutive activation of NF-kappaB con 原 tributes to cell viability in human esophageal squamous cell carcinoma cells[j]. BMC Cancer, 214, 14: 98.

124 激光生物学报第 25 卷 EGFRsignalingpathwayandglycolysis,aswelasdown regulationofbcl 2andMcl 1expresionareinvolvedinbutein mediatedproliferationinhibitionan

124 激光生物学报第 25 卷 EGFRsignalingpathwayandglycolysis,aswelasdown regulationofbcl 2andMcl 1expresionareinvolvedinbutein mediatedproliferationinhibitionan 第 25 卷第 2 期 2016 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.25No.2 Feb.2016 doi:10.3969/j.isn.1007 7146.2016.02.005 紫铆因对食管鳞癌细胞增殖和存活影响的初步研究李伟 a, 刘文斌 b c, 刘海丹 ( 中南大学 a. 湘雅三医院放射科 ;b. 湖南省肿瘤医院 / 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院病理科,