用传统的ELISA方法检测三聚氰胺（melamine）

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堀李
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1 用传统的 ELISA 方法检测三聚氰胺 (melamine) ERIC A. E. GARBER* Division of Bioanalytical Chemistry, Office of Regulatory Science, Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration, College Park, Maryland 20740, USA MS : Received 11 October 2007/Accepted 17 November 2007 摘要目前发生的多起三聚氰胺 (melamine) 掺假的事件, 迫切需要快速, 有效的检测方法监测食品中的三聚氰胺传统的 ELISA 方法为检测三聚氰胺 (melamine) 提供了快速, 有效的方法本文对几种商品化的 ELISA 试剂盒检测三聚氰胺中的 1,3,5- 三嗪进行评估目前, Abraxis 公司 (Abraxis, Warminster, Pa.) 的检测试剂盒可以检测 PBS 溶液中含量低至 9 ng/ml 的三聚氰胺 (melamine) 和宠物食品中 1 ug/ml 含量的三聚氰胺 Abraxis 公司的阿特拉津 atrazine ELISA 检测试剂盒则需要含量达 0.2 mg/ml 的三聚氰胺才产生高于背景标准偏差四倍的反应 Strategic Diagnostics 公司的 EnviroGard Triazine 试剂盒对 PBS 溶液中含量为 1.5 mg/ml 的三聚氰胺只产生高于背景标准偏差一倍的反应使用 105 mm 磷酸钠 /75 mm 氯化钠 /2.5% 脱脂奶 /0.05% 吐温 -20 (UD) 进行提取使检测灵敏度比制造商推荐的方法提高了五倍. 而 Abraxis 公司的三聚氰胺 ELISA 检测试剂盒, 对使用这两种方法提取宠物食品中污染的三聚氰胺得到相近的结果使用 UD 提取方法可分离出宠物食品中 74%± 4% 的三聚氰胺结论 : 相对于传统的繁琐耗时的检测方法, 最近上市的 Abraxis 公司的三聚氰胺 ELISA 检测试剂盒提供了一种简便实用的替代检测方法自从在宠物食品, 饲料和其他含蛋白质原料的如, 小麦谷蛋白, 水稻浓缩蛋白, 玉米麸等中发现三聚氰胺 (melamine) 以来, 迫切需要快速的检测方法, 从而能准确的检测食品中三聚氰胺三聚氰胺常被用于生产塑料涂料造纸防皱纺织品和化肥, 它也被用以制造阻燃剂 Newton and Utley 对将三聚氰胺作为属于非蛋白质含氮化合物添加到饲料中进行了研究虽然三聚氰胺能被消化, 大多数氮都从尿中排除而不能被胃吸收世界卫生组织将三聚氰胺列为不具有健康危险性的化合物美国国家食品药品监督管理局认可, 只要氯仿水溶性提取物不超过 0.5 毫克 / 平方英寸食物接触面积 (21 CFR ), 可以使用三聚氰胺甲醛树酯作为塑料包装表面涂饰三聚氰胺的三氨基结构对分析方法的建立既有优点也有缺点通过控制 ph 值和离子浓度, 可以调节三聚氰胺的色谱特性另外, 在酸性条件下, 三聚氰胺有很强的紫外吸收, 使利用检测紫外光吸收的方法成为可能但是, 因为食品中含有复杂的化学组成成分, 所以利用紫外或者酸性条件检测存在很多问题这些问题可以通过在酸化处理前先从食物中提取

2 三聚氰胺来解决 Ishiwata 等尝试将三聚氰胺转化成热的酸性溶液 ( 极限浓度 LOQ,50 ng/ml) 并利用液相色谱进行检测另外的办法是将 C-18 液相色谱与电喷质谱连用来增加洗脱谱, 包括利用十三氟庚酸 (tridecafluoroheptanoic acid) 来产生离子对这种离子对检测方法的检测极限和溶解极限浓度分别为 0.01 和 0.1 mg/kg 还有一种方法是使用 C-18 液相色谱, 用含 20% 氢氧化铵的乙腈作为液相检测肉和蛋中三聚氰胺的含量检测的极限浓度为 0.02mg/kg 三甲基硅衍生法提供了另外一个替代方法来处理这三个氨基基团这一方法最初是由 FDA 的法医化学中心建立的, 宠物食品样品先用甲醇提取, 然后超声, 离心, 过滤, 干燥样品用二 ( 三甲基硅 ) 三氟乙酰胺进行硅烷化, 然后使用气相色谱 / 质谱进行检测, 检测的极限浓度为 10ug/ml 并且恢复率达到干燥宠物食品的 87 % 本文检验了几种商品化的酶联免疫吸附试剂盒, 作为一个有应用潜力的解决方案, 以满足需要高通量筛选的样品是否存在三聚氰胺此外, 除了商品化的酶联免疫吸附试剂盒, 两个测试三嗪的试剂盒 ( 即除草剂阿特拉津 ) 用来检查交叉反应所有这三个 ELISA 试剂盒都可以检测三聚氰胺然而, 只有专门制造酶联免疫吸附检测三聚氰胺的试剂盒的检测的极限浓度可以和报道的大多数方法媲美此外, 三聚氰胺酶联免疫吸附检测法并不需要制备大量的样品材料与方法三聚氰胺和磷酸盐缓冲液 ( PBS) 购自 Sigma 公司 ( 圣路易斯, 密苏里州 ) 狗食( 干和罐头炖牛肉 ) 购买自当地狗食罐头去掉肉块并将肉汁储存在 -20 C 该肉汁被用来作为试验材料, 蔬菜的影响忽略不计干狗食在检测前磨碎并存放在密闭容器中一个怀疑含有三聚氰胺的狗食调查样本做成浓汤进行检测. ELISA 测试试剂盒 Abraxis ( 威斯敏斯特, 宾夕法尼亚州 ) 三聚氰胺 ELISA 试剂盒 ( 产品目录 : 5005B ), Abraxis 阿特拉津 Atrazine ELISA 试剂盒 ( 产品目录 : ), 和 Strategic 诊断公司 ( 纽华克, 特拉华州 ) EnviroGard 三嗪 ELISA 试剂盒 ( 产品目录 : ) 决定检测其他供应商的这些阿特拉津和三嗪 ELISAs 类似物的产品是基于制造商报告的交叉反应性能 ( 无论是在提供的文件或口头上表明产生交叉反应的可能性 ) 没有审查 Beacon 分析系统公司 ( 缅因州, 波特兰 ) 生产的 ELISA 试剂盒是由于检测试剂盒生产商报告与三聚氰胺只有 % 的交叉反应本文首先根据制造商的建议使用 ELISA 试剂盒随后对提高了灵敏度或消除不必要的步骤的变化也进行了评价研究发现, 制造商建议的使用三聚氰胺 ELISA 试剂盒之前, 宠物食品样品离心后要通过 G-6 玻璃过滤器过滤的步骤是不必要

3 所有这三个 ELISAs 使用有竞争力的设计, 因此当抗原存在于样品时显示出减弱的反应这表示为产生反应的百分比 ( % B/B0 ) 即定义为反应产生的样品 ( B) 与由一个没有三聚氰胺的对照样品产生反应的浓度 (B0 ) LOD 值被定义为产生反应大于 4 倍背景标准差的三聚氰胺的必要浓度结果三聚氰胺的检测采用 ELISA 检测试剂盒图 1 比较分析了使用用于检测三聚氰胺, 莠去津, 和三嗪的酶联免疫吸附试剂盒检测磷酸盐缓冲液中三聚氰胺的结果 Detection of melamine using ELISA test kits. Figure 1 compares the results obtained from the analysis of melamine in PBS using ELISA test kits for the detection of melamine, atrazine, and triazines. FIGURE 1. Detection of melamine in PBS using the Strategic Diagnostics, Inc., EnviroGard Triazaine assay ; Abraxis Atrazine ELISA and Abraxis Melamine ELISA The measured responses were plotted based on the concentration of melamine in the analytical sample. The samples analyzed using the Abraxis Atrazine ELISA were not diluted in half prior to placing 50ul into each well of the microtiter plate; thus, the concentrations of melamine and the solvent milieu were identical for all assays. The data points represent the average _ SD of three samples.

4 所有这三个 ELISA 都可用来检测三聚氰胺然而, 检测三嗪的试剂盒需要 1500ug/ 毫升的三聚氰胺才能产生高于背景一倍标准差的反应, 检测不足以定义一个 LOD 值 Atrazine 酶联免疫吸附试剂盒的反应产生显着不同背景的磷酸盐缓冲液样本含有大于 23 ug/ml 三聚氰胺的 LOD 值为 0.2mg/ml 不管磷酸盐缓冲液样品在分析之前是否稀释两倍, 分析得到的结果是相同的 ( 图 2 ) 这表明, 检测试剂盒制造商建议将样品稀释两倍的步骤可以省略省略稀释两倍的步骤提高了 LOD 值, 可用最初的样品中三聚氰胺的浓度表示 FIGURE 2. Analysis of melamine in PBS using the Abraxis Atrazine ELISA. Samples were analyzed either according to the test kit protocol, which included a twofold dilution prior to analysis, or omitting the additional dilution step. The data (average+sd, n=3) were plotted versus the final concentration of analyte in the well of the microtiter plate 三聚氰胺 ELISA 试验的灵敏度 >9ng/ml 含量, LOD 值使用 105 mm 磷酸钠 /75 mm 氯化钠 /2.5% 脱脂奶 /0.05% 吐温 -20 (UD), 肉汁从狗食, 和干狗食 9ng/ml,28 ng/ml, 9 ng/ml, 或者 9,25 ng/g 通过萃取的方法获得的材料, 见表 1 ) 该检测试剂盒标准的 LOD 值小于 20ng/ml ELISA 试剂盒检测三聚氰胺的偏离指数在三聚氰胺浓度 >750ng/ml 时, 3ug/ml 的三聚氰胺的 % B/B0 的 value 值为 10 %; 两个特点开始饱和因此,ELISA 试剂盒是标准的检测范围为含有 30ng/ml( >LOD )-750ng/m 三聚氰胺的样品

5 a LOD, lowest concentration of melamine that generated a response more than four times the standard deviation from the background (Bkgd 4D). b Concentration prior to (initial) and after (diluted) 40-fold dilution with PBS or UD. c Another series of analyses gave an average background response of (n= 6) corresponding to an LOD of 8 ng/ml. Test kit standards yielded backgrounds of , n= 3, and , corresponding to calculated LODs of 9 and 17 ng/ml. d UD, 105 mm sodium phosphate/75 mm NaCl/2.5% skim milk/0.1% Tween 20, ph 6.8. e 1.1 ug/ml (initial)/28 ng/ml (diluted) melamine in gravy gave a response of ; at 3.3 ug/ml (initial)/83 ng/ml (diluted), the response was f Extracted according to the manufacturer s recommended procedure, which entailed a 200-fold dilution of the initial sample. g Extrapolation based on the trendline y= (exp x), R2= , where x =% B/B0 and y=ug/g yielded an LOD of 9 ng/g. Of actual samples, one with a response <LOD had a response of 0.97, equivalent to an initial concentration of 10ug/g and diluted at 50 ng/g. h Extracted according to UD protocol, which entailed a 40-fold dilution with UD. All samples ran in triplicate unless specified otherwise 如图 3 所示,ELISA 试剂盒可以有效地检测上述两种从狗粮中提取的三聚氰胺酶第一种方法是 ELISA 试剂盒公司推荐的, 提取需要 60 % 甲醇, 涡旋式, 超声, 离心, 稀释到 10 % 甲醇, 最后稀释 200 倍具体步骤在材料和方法中有详细阐述第二种方法是用 1:40 的吐温 -20 (UD) 混合已经磨碎的样品, 无需进行进一步的处理如图 3A 所示, 用吐温 -20 (UD) 处理的比第一种方法处理的样品更灵敏不过从样品处理和准备的过程上分析 ( 如图 3B 所示 ), 第二种方法的灵敏度好完全是由于样品稀释 40 倍而不是 200 倍吐温 -20 (UD) 方法的另一个有点是操作简单, 节省人工和时间

6 FIGURE 3. Comparison of extraction protocols for the analysis of melamine spiked into dry dog food. Samples of dry dog food spiked with varying amounts of melamine were analyzed using the Melamine ELISA manufactured by Abraxis either according to the recommended protocol, which entailed extraction of the ground dog food with 60% methanol, vortexing, sonication, centrifugation, and dilution into 10% methanol or mixed with UD buffer. Figure 3A depicts the % B/B0 plotted based on the initial concentration of melamine spiked into the dog food, and Figure 3B depicts the same data plotted based on the concentration of melamine in the analytical sample added to the microtiter plate well. The data points represent the average +SD of three samples.

7 狗粮中三聚氰胺含量的分析研究样品为狗粮, 报告结果为三聚氰胺含量样品数量为能整除的样品, 检测方法 ELISA 采用试剂盒厂家推荐的和吐温 -20 (UD) 两种方法检测的三聚氰胺含量分别为 :1.2mg/ml(n=3) 和 1.1mg/ml(n=3) 两种方法的一致性和前( 面图 3) 中数据是吻合结果显示只有在 5 倍以上的稀释浓度才度结果产生明显的影响 FIGURE 4. Detection of melamine in PBS and dog food gravy., PBS spiked with melamine and diluted 40-fold with PBS; the dashed line depicts the trendline described by y = ln(x) (R2 =0.9973)., PBS spiked with melamine and diluted 40-fold with UD; the dashed line depicts the trendline described by y = ln(x) (R2 =0.9957)., Dog food gravy spiked with melamine and diluted 40-fold with UD; the dashed line depicts the trendline described by y= ln(x) (R2 = ). The abscissa reflects the concentration of melamine in the analytical sample following dilution. The data points represent the average+sd of three samples. 回收三聚氰胺图 4 比较了采用三聚氰胺酶联免疫法检测磷酸盐缓冲液中的三聚氰胺, 在磷酸盐缓冲液中然后用 UD 稀释 40 倍, 以及用 UD 稀释 40 倍狗食肉汁中的三聚氰胺回收率是根据样品在 ELISA 的线性区域范围内来计算的, ng/ml 与溶解于 PBS 缓冲液并用 UD 稀释的三聚氰胺样品相比,UD 稀释的肉汁中的三聚氰胺的检测率为 74 %+ 4 % ( n = 4 浓度, 平均每 3 个样本 ) 溶解于 PBS 缓冲液并用 UD 稀释的三聚氰胺样品与溶解于 PBS 缓冲液并用

8 PBS 缓冲液稀释的三聚氰胺相比, 回收率为 88 %+ 8 % ( n = 4 浓度, 平均每 3 个样品 ) 肉汁样品和 PBS 样品, 这两种样品溶液均用 UD 稀释 40 倍, 产生平行的曲线 ( 见图 4 ), 曲线趋势用方程式来描述为 y= ln(x) (R 2 =0.9983) 以及 y =0.1773ln(x) (R 2 = ), 其中 y 坐标为 % B/B0 和 x 坐标为 ug/ml 三聚氰胺重新整理这些方程式, 以便更好地说明产生的平行反应 y=2.7366exp( x)(r 2 =0.9983) 和 y=2.0266exp( x)(r 2 =0.9957), 其中 y 坐标为 ug/ml 三聚氰胺和 X 坐标为 %B/B0 与之相对应, 检测 PBS 中三聚氰胺的方程式为 y=1.7484exp ( x) (R 2 = ) 肉汁和 PBS 样品用 UD 稀释后的产生相同的斜率与 40 倍稀释后将基质的影响最小化相一致此外,PBS 溶液中三聚氰胺的非平行趋势反映出以 PBS 和 UD 作为溶剂的不同之处讨论所有三个酶联免疫吸附试验测试工具都能成功地检测三聚氰胺不同的三聚氰胺检测试剂盒的 LOD 值有所不同,LOD 可达 9 纳克 / 毫升所有这三个测试试剂盒都能够检测到含量 200 毫克 / 克的被三聚氰胺污染的用来制造宠物食品和动物饲料的小麦面筋 ( 3 ) 然而, 只有三聚氰胺 ELISA 试剂盒足以检测到低浓度的三聚氰胺, 优于其他的检测方法因此, Abraxis ELISA 检测三聚氰胺法提供了一个快速, 高通量的检测方法筛选样品中存在的三聚氰胺此外, 分析样品 9 纳克 / 毫升的 LOD 值意味着 ELISA 检测符合分析之前 40 倍 UD 在使用以免疫学为基础的生物检测方法时, 往往要考虑高浓度的分析样品所产生的影响因为抗体和其他抗原复合物的结合产生信号的数量级往往是低于目标分析物的数量级免疫分析采用的三明治设计不包括消除游离抗原的步骤, 除了减弱定量分析的能力, 游离抗原可能干扰抗原的检测除非信噪比足够大, 但若不足以产生高于背景的信号, 这也可能会导致假阴性所有这三个试剂盒使用具有竞争力的 ELISA 试验设计, 样品中的测试物 ( 即三聚氰胺 ) 与试剂盒中提供的标记的抗原竞争, 结合与捕获抗体因此, 所有三个试剂盒应该在高浓度的样品分析时显示出饱和反应而没有钩状效应使用数量级大于三嗪和莠去津 ELISA 试剂盒 LODs 的 108 μg / 毫升莠去津 ( 数据未显示 ) 和 3 毫克 / 毫升三聚氰胺作测试, 证实了这一点由于没有钩状效应, 所有这三个实验可以修订为一个单一的反应步骤, 包括样品和所有的试剂这种形式非常适合于高通量检测试验观察到磷酸盐缓冲液稀释与 UD 溶液稀释导致不同的斜率趋势表现为检测三聚氰胺时斜率为与和 , 这可以提供一种有用的测定方法的优化和不同食品样本的分析方法不同食品样本往往需要结合多种因素进行优化,( 即 ph 值, 离子强度,

9 介质,) 等等如何通过特定的溶剂效应改变它, 不同的斜率可提供参照决定哪些修改可以优化分析此外, 能够量化溶剂效应的不同可能有助于解决检测中遇到的问题, 并提供一个指标以备将来参考比较不同的试剂盒总之,Abraxis 三聚氰胺 ELISA 检测法证明是一种可靠, 敏感的方法来检测样品存在的三聚氰胺此外,Abraxis 三聚氰胺 ELISA 检测法提供了灵敏度可以媲美甚至更优于目前采用的繁琐的方法 ACKNOWLEDGMENTS Gratitude is expressed to Alex J. Krynitsky (FDA) and Jon W. Wong, Ph.D. (FDA), for providing analytical standards. Thanks are also expressed to Lynn L.-B. Rust, Ph.D. (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health), for support. REFERENCES 1. Branigin, B Tumult over pet food intensifies as another variety is recalled. Washington Post, March 31, p. A Canadian Food Inspection Agency Latest information (as of June 19, 2007): melamine and cyanuric acid contamination in animal feed. Available at: specif/vegproe.shtml. Accessed 12 August Castro, V. (moderator). 30 May Transcript of U.S. Food and Drug Administration press conference on the pet food recall. Available at: Accessed 4 August Chou, S.-S., D.-F. Hwang, and H.-F. Lee High performance liquid chromatographic determination of cyromazine and its derivative melamine in poultry, meats, and eggs. J. Food Drug Anal. 11: Dayan-Kenigsberg, J., A. Bertocchi, and E. A. E. Garber. Submitted for publication. 6. Garber, E. A. E., J. Dayan-Kenigsberg, and A. Bertocchi Elimination of wheat lectin-based false positives associated with lateral flow devices for detection of ricin and Staphylococcus enterotoxin B, abstr. 388, J04. FDA Science Forum, Washington, D.C., 18 April Ishiwata, H., T. Inoue, T. Yamazaki, and K. Yoshihira Liquid chromatographic determination of melamine in beverages. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70: Lang, L Gastroenterology and hepatology news, FDA issues statement on diethylene glycol and melamine food contamination. Gastroenterology 133: Newton, G. L., and P. R. Utley Melamine as a dietary nitrogen source for ruminants. J. Anim. Sci. 47: Roebuck, K Chemical used in plastics found in recalled pet food. Pittsburgh Tribune- Review, 30 March Available at :

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, GC/MS ph GC/MS I

S00017052 O O , GC/MS ph GC/MS I Abstract Drug abuse is a serious issue throughout the world. Amphetamine-type stimulants (ATS) are substances frequently used by drug abusers. There are significant needs