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骅睦令狐
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1 HPLC 同时测定中成药及保健品中添加的 16 种糖皮质激素欧贝丽 1, 赵佳丽 1, 邹燕 1, 冒婷婷 2 (1. 嘉兴市食品药品检验检测院, 浙江嘉兴 ;2. 嘉兴学院医学院, 浙江嘉兴 ) 摘要 : 目的建立一种准确高效的 HPLC 同时检测多类中成药及保健品中非法添加的 16 种糖皮质激素方法采用 Agilent Extend-C 18 (250 mm 4.6 mm,5 µm) 为色谱柱 ; 乙腈 -0.1 mol L 1 乙酸铵溶液为流动相, 梯度洗脱, 检测波长为 240 nm 结果 16 种糖皮质激素在 0.2~25 μg L 1 内线性良好 ; 各成分最低定量限浓度均 <0.05 ng ml 1 ; 回收率, 除了贴膏剂 (57.2%~83.8%), 其余剂型均获得满意结果 ( 78.5%) 结论本方法简单高效, 结果准确可靠, 通用性强, 可作为同时检测中成药及保健品中非法添加的 16 种常用糖皮质激素的有效方法关键词 : 高效液相色谱法 ; 糖皮质激素 ; 非法添加 ; 中成药 ; 保健品中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2016) DOI: /j.cnki.issn Simultaneous Determination of 16 Glucocorticoids Added in Chinese Patent Medicine and Health Products by HPLC OU Beili 1, ZHAO Jiali 1, ZOU Yan 1, MAO Tingting 2 (1.Jiaxing Institute for Food and Drug Control, Jiaxing , China; 2.Medical College of Jiaxing University, Jiaxing , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish an accurate, universal and efficient HPLC method for simultaneous determitation of 16 glucocorticoids illegally added in Chinese patent medicine and health products. METHODS HPLC method was performed on an Agilent Extend-C 18 (250 mm 4.6 mm, 5 µm) column with the mobile phase consisted of 0.1 mol L 1 ammonium acetate solution-acetonitrile in a gradient elution mode. The detector wavelength was set at 240 nm. RESULTS The linear range of 16 glucocorticoids were μg ml 1, which showed a good correlation. The recoveries were good except plaster( 78.5%), except the emplas trum with the recovery rate of 57.2% 83.3%, and the detection limits were all <0.05 ng ml 1. CONCLUSION The method is simple and efficient, accurate and universal. It can be used as an efficient method for determination of 16 commonly used glucocorticoids which are illegally added in Chinese patent medicine and health products. KEY WORDS: HPLC; glucocorticoids; illegally added; Chinese patent medicine; health products 糖皮质激素具有抗炎抗过敏抗休克免疫抑制等多种作用, 在临床各科均有广泛应用 [1-2] 外用可降低毛细血管的通透性减少渗出和细胞浸润, 用于皮肤病如湿疹银屑病等的治疗 ; 利用其消炎抗过敏作用, 用于治疗鼻炎哮喘气管炎等 ; 利用其免疫抑制作用, 用于治疗红斑狼疮类风湿关节炎等但是糖皮质激素的随意使用会导致代谢紊乱, 可表现为高血压高血脂糖尿病十二指肠溃疡甚至出血穿孔骨质疏松等严重不良反应 [3] 目前文献资料中有关糖皮质激素检测的方法多适用于一类制剂中的非法添加检测 [4-6], 笔者根据工作中的大量案例, 发现糖皮质激素常被添加于多类不同功效的中药制剂及保健品, 因此建立一个同时检测多类制剂中 16 种糖皮质激素的方法, 可显著提高非标检测工作的效率本实验方法采用普通液相方法, 在基层药检机构较为普及, 利于基层药检部门有效开展非法添加的检测工作, 为基层食品药品监督工作提供参考 1 仪器与试药 1.1 仪器 LC-20AD 型高效液相色谱仪 ( 日本 Shimadzu 公司, 高压二元泵 DAD 检测器,Labsolutions 数据处理系统 );BP211D 型电子天平 ( 北京赛多利斯 ); DS-5510 DT 型超声提取仪 ( 上海生析超声仪器有限公司 ) 1.2 药品与试剂对照品地塞米松磷酸钠 ( 批号 : , 纯度 :100%) 泼尼松龙( 批号 : , 纯度 :99.4%) 氢化可的松( 批号 : , 纯度 :100%) 倍他米松( 批号 : , 纯度 :99.3%) 地塞米松( 批号 : , 纯度 :99.7%) 曲安奈德( 批号 : , 作者简介 : 欧贝丽, 女, 硕士, 主管药师 Tel: (0573) obily@163.com 1178 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No.9 中国现代应用药学 2016 年 9 月第 33 卷第 9 期

2 纯度 :98.8%) 醋酸泼尼松龙( 批号 : , 纯度 :99.2%) 醋酸氢化可的松( 批号 : , 纯度 :100%) 醋酸泼尼松( 批号 : , 纯度 :99.7%) 醋酸可的松( 批号 : , 纯度 :99.2%) 醋酸地塞米松( 批号 : , 纯度 :100%) 醋酸曲安奈德( 批号 : , 纯度 :97.8%) 醋酸氟轻松( 批号 : , 纯度 :99.6%) 丙酸氯倍他索( 批号 : , 纯度 :99.5%) 二丙酸倍他米松( 批号 : , 纯度 :99.3%) 丙酸倍氯米松( 批号 : , 纯度 :100%) 均购自中国食品药品检定研究院供试品均为各县市区食品药品监督管理局提供的市场监督抽检样品乙腈 ( 德国 Merck 公司 ) 乙酸铵( 美国 Tedia 公司 ) 均为色谱纯 ; 其余试剂为分析纯, 水为超纯水 2 方法 2.1 HPLC 条件 Agilent Extend-C 18 (250 mm 4.6 mm,5 µm) 色谱柱流动相 : 以 0.1 mol L 1 乙酸铵溶液为流动相 A, 以乙腈为流动相 B, 进行梯度洗脱,A: 0~1 min,20% 28%;1~8 min,28% 30%,8~ 12 min,30%;12~14 min,30% 50%;14~20 min, 50%;20~23 min,50% 90%;23~28 min,90%; 28~ 29 min,90% 20%;29~35 min,20% 柱温: 30 流速:1.0 ml min 1 进样量:10 μl 检测波长 :240 nm 波长扫描范围:200~400 nm 2.2 对照品溶液的制备精密称取 1.2 项下对照品各 10 mg, 分别置于 10 ml 量瓶中, 加甲醇超声溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品贮备液 2.3 供试品溶液的制备取片剂样品丸剂样品胶囊剂及粉末样品的内容物置于研钵中研细混匀, 称取一次服用量, 置于 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声提取 15 min, 放冷, 用甲醇定容, 摇匀经滤纸滤过, 续滤液作为供试品贮备液口服液或者液体涂剂可精密量取适量置量瓶中, 加甲醇适量, 超声提取 15 min, 放冷, 用甲醇定容, 经滤纸过滤, 取续滤液作为供试品贮备液亲水性基质软膏剂 ( 溶于甲醇 ), 取试样适量 ( 外用激素的剂量较小可适当加大取样量 ), 置 50 ml 量瓶中加甲醇适量, 超声提取 15 min, 放冷, 用甲醇定容, 摇匀经滤纸滤过, 续滤液作为供试品贮备液 ; 疏水性软膏试样 ( 不溶于甲醇 ), 参考文 [7] 献取适量, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇至刻度, 水浴加热至软膏融化, 振摇提取 15 min, 置冰浴中, 水相层溶液作为供试品贮备液贴膏剂, 参照以往的工作经验 [8], 取供试品适量, 剪成碎片后置于样品瓶中, 加入乙醚 15 ml, 多次超声并洗涤至基质从衬布上脱落并崩解, 取出衬布和残渣多次洗涤, 将提取液和洗涤液合并, 置于热水浴蒸发至约 5 ml 后全部转移至 50 ml 量瓶, 用甲醇定容, 溶液经离心后取上清液作为供试品贮备液取上述各贮备液适量, 用初始流动相稀释至标曲浓度范围内, 混匀后经 0.45 μm 滤膜过滤, 续滤液作为供试品溶液 3 结果 3.1 方法的专属性由于中成药及保健品的大部分辅料及中药成分极性较大, 在 C 18 柱上的保留较弱, 在本实验色谱条件下 16 种化合物的保留时间均在 6.9 min 之后, 因此不易被其他成分干扰取浓度为 5.0 μg ml 1 的混合对照品溶液, 按 2.1 项下色谱条件测定, 结果见图 1 16 个色谱峰之间的分离度均 >1.5, 各色谱峰的理论板数均 >20 000; 与此同时, 选取空白溶剂及各剂型的多个阴性样品, 进行空白试验, 部分色谱图见图 2, 空白色谱图均未对各色谱峰有干扰 3.2 线性关系取 2.2 项下对照品贮备液, 分别精密量取适量, 用 20% 甲醇 ( 含 0.1 mol L 1 乙酸铵 ) 溶液逐步稀释, 制成浓度分别为 0.2,0.5,2.5,5.0,10.0, 25.0 μg ml 1 的混合对照品溶液分别取 10 μl, 注入高效液相色谱仪测定以各组分浓度 (X, μg ml 1 ) 为横坐标, 峰面积 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线, 曲线方程及线性相关系数见表仪器精密度取 3.2 项下浓度为 5.0 μg ml 1 的混合对照溶液, 连续进样 6 次,16 种成分对应的峰面积的 RSD 均 <1.1%, 表明仪器精密度良好, 能满足分析要求 3.4 溶液稳定性取 3.2 项下浓度为 5.0 μg ml 1 的混合对照品溶液, 分别于 2,6,12,18,24 h 进样测定, 各色谱峰面积的 RSD 为 0.4%~1.8%, 表明对照品溶液在室温条件下 24 h 内稳定中国现代应用药学 2016 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No

3 图 1 16 种糖皮质激素的色谱图 a 地塞米松磷酸钠 ;b 泼尼松龙 ;c 氢化可的松 ;d 倍他米松 ;e 地塞米松 ;f 曲安奈德 ;g 醋酸泼尼松龙 ;h 醋酸氢化可的松 ;i 醋酸泼尼松 ;j 醋酸可的松 ;k 醋酸地塞米松 ;l 醋酸曲安奈德 ;m 醋酸氟轻松 ;n 丙酸氯倍他索 ;o 二丙酸倍他米松 ;p 丙酸倍氯米松 Fig. 1 Chromatograms of 16 glucocorticoids a dexamethasone sodium phosphate; b prednisolone; c hydrocortisone; d betamethasone; e dexamethasone; f triamcinolone acetonide; g prednisolone acetate; h hydrocortisone acetate; i prednisone acetate; j cortisone acetate; k dexamethasone acetate; l triamcinolone acetonide acetate; m fluocinolone acetonidem; n clobetasol propionate; o betamethasone dipropionate; p beclomethasone. 图 2 空白色谱图 a 空白溶剂 ;b 止痛风湿丸 ( 长春新安药业有限公司, 批号 : ); c 清热止痒洗剂 ( 云南优克制药公司, 批号 :150603);d 固本咳喘胶囊 ( 黑龙江省济仁药业有限公司, 批号 :140601) Fig. 2 Chromatograms of blank solvent and negative samples a blank solvent; b Zhitong Fengshi pills(changchun Xinan Pharmacy Co., Ltd.); c Qingre Zhiyang Xiji(Yunnan Youke Pharmacy Co.); d Guben Kechuan capsule(heilongjiang Province Jiren Pharmaceutical Co., Ltd.). 3.5 回收率取 2.2 项下对照品贮备液, 分别精密量取 5.0 ml, 同置于 100 ml 量瓶, 用初始流动相稀释至刻度, 制成浓度为 50 μg ml 1 的混合对照品溶液分别取阴性片剂胶囊剂口服液疏水性软膏贴膏剂试样各 3 份, 疏水性软膏剂取 1.0 g, 其余试样按一次服用 ( 使用 ) 剂量, 分别加上述混合对照品溶液 5.0 ml, 按 2.3 项下方法进行提取纯化按表 1 各化合物的线性方程获得各个化合物的浓度, 计算出 3 份样品的平均回收率结果除了贴膏剂的个别化合物未能获得较满意的回收率 (57.2%~83.8%) 外, 其余剂型各个化合物的回收率均 78.5%, 表明方法能满足片剂胶囊剂口服液疏水性软膏制剂中的非法添加物的准确测定, 基本能满足贴膏剂的定性检测不同剂型各化合物的回收率见表 1 表 1 16 种糖皮质激素的线性方程相关系数各剂型样品的回收率 Tab. 1 Linear equations, correlation coefficients, recoveries of different dosage forms for 16 gucocorticoids 回收率 /% 糖皮质激素标准曲线相关系数 r 2 片剂胶囊口服液软膏贴膏地塞米松磷酸钠 y = x 泼尼松龙 y = x 氢化可的松 y = x 倍他米松 y = x 地塞米松 y = x 曲安奈德 y = x 醋酸泼尼松龙 y = x 醋酸氢化可的松 y = x 醋酸泼尼松 y = x 醋酸可的松 y = x 醋酸地塞米松 y = x 醋酸曲安奈德 y = x 醋酸氟轻松 y = x 丙酸氯倍他索 y = x 二丙酸倍他米松 y = x 丙酸倍氯米松 y = x Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No.9 中国现代应用药学 2016 年 9 月第 33 卷第 9 期

4 3.6 检测限和定量限将 3.2 项下浓度为 0.2 μg ml 1 的混合对照品溶液用初始流动相不断稀释, 以 S/N 3 时测得的各组分的浓度为检测限, 以 S/N 10 时测得的该组分的浓度为定量限结果 16 种化合物的检测限浓度均 0.02 ng ml 1, 定量限为 0.01~0.05 ng ml 1 取各药监部门抽检的此类样品, 按 2.3 项方法制备供试品溶液, 平行两份, 按 2.1 项下色谱条件进行检测, 比较阳性样品与对照品各化合物的保留时间和光谱相似度, 若两者一致, 将获得的各化合物的色谱峰面积代入表 1 的曲线方程, 计算出 2 份样品的平均浓度并换算成每单位含量, 个别阳性样品的检测结果见表 2 个别阳性样品的色谱图见图 3 表 2 阳性样品检测结果 Tab. 2 Results of samples added glucocorticoids 样品名称剂型编号光谱相似度糖皮质检出量激素名称 Ⅰ 无敌擦剂搽剂 99 地塞米松曲安奈德各 0.03 mg ml 1 Ⅱ 祖传中药粉末粉剂 99 醋酸泼尼松 1.5 mg g 1 Ⅲ 三十八味咳必克胶囊 98 醋酸泼尼松每粒 1.2 mg Ⅳ 清屑解痒胶囊胶囊 98 醋酸泼尼松每粒 0.8 mg Ⅴ 野山草酸麻肿痛消贴剂 96 醋酸泼尼松每贴 0.5 mg Ⅵ 疗癣卡西普软膏剂 98 丙酸氯倍他索 0.7 mg g 1 Ⅶ 神奇消喘丸丸剂 97 醋酸泼尼松每丸 1.3 mg Ⅷ 舒经活络肽片剂 98 醋酸泼尼松每片 0.4 mg 图 3 个别阳性样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of samples added glucocorticoids 4 讨论糖皮质激素为甾体类固醇, 是一类四环脂肪烃化合物, 亲脂性较强, 在 C 18 柱中的保留较强根据文献 [4,9-10], 大多采用乙腈 - 水系统作为流动相, 本实验分别考察了水 - 乙腈 0.1% 磷酸 - 乙腈系统 0.1 mol L 1 乙酸铵 - 乙腈系统, 结果发现水 - 乙腈系统和 0.1% 磷酸 - 乙腈系统中, 地塞米松磷酸钠峰形极差, 见图 4, 水 - 乙腈系统中加入乙酸铵后, 各个化合物的分离效果均有显著提高本实验考察了不同浓度的乙酸铵对分离效果的影响, 结果发现, 大部分化合物在 0.05 mol L 1 与 0.1 mol L 1 的乙酸铵 - 乙腈系统中的分离效果及色谱响应无明显差异但是, 倍他米松和地塞米松在 0.05 mol L 1 的乙酸铵 - 乙腈系统中不能达到基线分离, 随着乙酸铵浓度的增加, 这 2 个色谱峰的分离度也不断增加, 但是基线噪音和基线波动会随之加大, 见图 4, 因此, 本实验采用能使这 2 个色谱峰达到基线分离的 0.1 mol L 1 乙酸铵 - 乙腈系统作为流动相系统图 4 流动相对分离效果的影响 Fig. 4 The influence of different mobile phase 中国现代应用药学 2016 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No

5 [4,7,9-10] 色谱柱的选择参考相关文献多采用 C 18 柱进行分离, 本实验需要对 16 种糖皮质激素进行分离, 为了获得更好的柱效, 选用 25 cm 长柱进行分析对 Agilent 的 Eclipse plus C 18 SB C 18 Extend C 18 3 种不同型号的色谱柱进行了考察, 结果 Extend 柱的分离效果最佳,SB 柱其次,Eclipse plus 柱的柱效最差, 因此本实验选用 Extend C 18 柱分析检测波长的选择糖皮质激素具有甾体固醇结构, 大部分化合物的紫外最大吸收均在 240 nm 附近, 因此本实验采用 240 nm 作为定量检测的检测波长同时由于非法添加样品的成分复杂不一, 为了有效区别假阳性样品和其他非法添加的化合物, 采用 200~400 nm 波长进行全扫描, 可根据色谱峰的紫外吸收光谱图区别是否添加了糖皮质激素或者其他化学药物如样品 Ⅲ 中 ( 三十八味咳必克, 图 3), 检测出醋酸泼尼松的同时在 4.68 min 和 6.32 min 处还检测出有高浓度的化合物, 后根据质谱分子量信息, 得出该添加物为马来酸氯苯那敏本实验的色谱条件, 采用挥发性缓冲盐醋酸铵, 利于与质谱联用为了获得更好的疗效不法分子往往还会依据样品的不同功效, 添加除了糖皮质激素外的其他的化学药物, 如止咳平喘类样品还会添加氨茶碱等平喘药消炎止痛类样品添加双氯芬酸钠等止痛药, 若在液相色谱图中发现可疑色谱峰, 无需转换液相方法, 可直接联用质谱, 获得可疑化合物的分子量信息不同剂型制剂的回收率呈现一定的规律, 液体涂剂和口服液的回收率较高, 胶囊和片剂的回收率其次, 软膏剂尤其是贴膏剂的回收率普遍较低, 这与不同剂型的基质干扰有关, 液体制剂的基质干扰相对较小, 软膏剂和贴膏剂的基质较复杂, 且不溶于甲醇, 虽经过 2.3 项下方法处理使基质溶解分散, 但处理过程中难免会造成被测成分的损失, 尤其是倍氯米松氯倍他索等极性较小的化合物的回收率明显小于极性较大的化合物根据笔者的实际工作, 针对目前市场上的中成药和保健食中非法添加糖皮质激素类化学药物的现状进行了分析和调查结果发现相对于中成药, 保健品非法添加问题更为突出, 而假冒中成药中非法添加的情况也比较严重, 这些问题样品主要集中在邮购网络微信买卖的样品添加的化学药物主要为价格低廉起效快临床常用的老药, 最常见为醋酸泼尼松和地塞米松本实验建立了临床最常见的 16 种糖皮质激素的液相检测方法, 根据不同剂型应用不同的预处理方法, 适用于多种类型的保健品及中药制剂的检测, 方法准确高效, 采用液相 - 二极管阵列紫外检测器检测, 从保留时间和紫外吸收特性 2 方面判断待测样品中是否掺入了化学药物实验使用的高效液相色谱仪, 操作的技术要求不高, 适用范围广, 易于普及, 利于基层药监部门及时打击非法添加行为 REFERENCES [1] MA Z J. The clinical application of glucocorticoids(gc) [J]. Chin Mod Med( 中国当代医药 ), 2011, 18(14): [2] ZHAO J. Investigation and analysis on the application of glucocorticoid in 267 case [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2011, 28(12): [3] 毛英. 糖皮质激素类药物的合理应用 [J]. 中国现代应用药学, 2000, 17(7): [4] ZHANG Y H, DONG H M. Simultaneous determination of ten glucocorticoids illegally added in antirheumatic traditional Chinese medicine by HPLC-DAD and ultra performance liquid chromatography column [J]. Shandong Chem Indust( 山东化工 ), 2015, 44(4): [5] CHEN F, CHEN Y, DONG P J. Simultaneous determination of eleven glucocorticoids in Chinese trandition medicines for bronchus by HPLC-MS [J]. Chin Tradit Pat Med( 中成药 ), 2014, 36(1): [6] WU X M, SHI D J, WANG M J, et al. Rapid analysis of analgesic and antipruritic illegally added in herb preparations [J]. Chin Tradit Pat Med( 中成药 ), 2014, 36(10): [7] PAN J. Rapid screening of adulteration of 17 kinds of glucocorticoids in herbal ointments by HPLC [J]. Chin Tradit Pat Med( 中成药 ), 2014, 36 (11): [8] ZHANG Z H, OU B L, XU H X, et al. UPLC-MS/MS detection of nine drugs added in health-care plasters [J]. Chin J Pharm Anal( 药物分析杂志 ), 2010, 10(30): [9] GAO W D. Determination of 8 glucocorticoids in anti-rheumatism Chinese Patent Drugs by HPLC [J]. Res Pract Chin Med( 现代中药研究与实践 ), 2015, 29(4): [10] GUO H, ZHANG Y H. Simultaneous determination of five glucocorticosteroids in antirheumatic traditional Chinese medicine by HPLC [J]. Liaoning J Tradit Chin Med( 辽宁中医杂志 ), 2015, 42(9): 收稿日期 : Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No.9 中国现代应用药学 2016 年 9 月第 33 卷第 9 期

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.