实验部分材料重组人 HER2 胞外区 (ECD) 购自 ACRO Biosystems( 美国特拉华州纽瓦克 ) EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 ( 美国纽约州格兰德岛 ) 大鼠血清购自 Bioreclamation

Size: px

Start display at page:

Download "实验部分材料重组人 HER2 胞外区 (ECD) 购自 ACRO Biosystems( 美国特拉华州纽瓦克 ) EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 ( 美国纽约州格兰德岛 ) 大鼠血清购自 Bioreclamation"

锻丁华
5 years ago
Views:

1 测定血清纯化所得的抗体药物偶联物的药物 / 抗体比率应用自动亲和纯化 LC/MS 分析和新型 DAR 计算软件应用简报作者 Jing Chen Michael Bovee 和 Steve Murphy 安捷伦科技公司前言抗体药物偶联物 (ADC) 是一类新兴生物治疗药物, 旨在通过将药物与单克隆抗体相连实现靶向给药与小分子药物不同,ADC 不是单分子实体, 而是一类异质性的抗体, 每种抗体所携带的药物数量以及经历的翻译后修饰都各不相同药物 / 抗体比率 (DAR) 是指 ADC 偶联的药物的平均数量 DAR 是 ADC 开发过程中需要优化和密切监测的关键质量属性, 因为它将影 1,2 响疗效和毒性 1,3 由于药物的释放, 在血液循环中 ADC 的 DAR 将随时间发生变化因此, 制定一套测定药代动力学 (PK) 研究样品中 ADC DAR 的稳定解决方案非常关键要确定 ADC DAR, 首先必须纯化血清中的 ADC, 然后使用 LC/MS 对其进行分析通常该工作流程中的样品前处理和数据分析环节需耗费大量人力, 因此易受变异性和人为误差影响本应用简报介绍了一种用于测定血清样品中 ADC DAR 的解决方案, 该方案采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对 ADC 进行自动亲和纯化 ; 将 Agilent 129 Infinity UHPLC 与 Agilent 655 Q-TOF 质谱仪联用, 用于采集准确的完整蛋白分子量数据 ; 并利用 Agilent MassHunter BioConfirm 和 DAR 计算器软件确定 ADC 质量和 DAR 该工作流程可节省人力降低变异性以及减少产生与 ADC DAR 测定相关的人为误差的可能性, 而且仅需很少的工作量即可扩展样品处理量

2 实验部分材料重组人 HER2 胞外区 (ECD) 购自 ACRO Biosystems( 美国特拉华州纽瓦克 ) EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 ( 美国纽约州格兰德岛 ) 大鼠血清购自 BioreclamationIVT( 美国纽约州希克斯维尔 ) 采用安捷伦科技公司( 加利福尼亚州圣克拉拉市 ) 的 AssayMAP 链霉亲和素小柱 (SA-W) 其他所有化学品均购自 Sigma- Aldrich( 美国密苏里州圣路易斯 ) ADC 抗原的生物素化和固定化采用 EZ-Link Sulfo-NHS-LC 生物素试剂盒, 按照制造商提供的操作说明对 HER2 ECD 进行生物素化然后使用 Pierce 生物素定量试剂盒, 按照制造商提供的操作说明测定生物素与 HER2 ECD 的摩尔比, 所得结果为 9. 使用由固定化应用控制的 Agilent AssayMAP Bravo 在每个 AssayMAP SA-W 小柱上固定 2 µg 生物素化的 HER2 ECD 简而言之, 先使用 1% 甲酸对 SA-W 小柱 ( 微量色谱柱, 其中装填有约 5 µl 与链霉亲和素共价结合的填充树脂 ) 进行灌注和平衡, 然后采用固定化应用中 Prime, Equilibrate, and Internal Cartridge Wash 1 ( 灌注平衡和内部小柱清洗 1) 的默认设置, 使用 HEPES 缓冲液 (1 mm HEPES 15 mm NaCl, ph 7.4) 进行清洗取消固定化应用中的所有其他步骤使用 1% 甲酸进行灌注和平衡可排出小柱内夹带的空气, 同时还能严格地清洗小柱, 去除其中的链霉亲和素单体, 避免它们在最终洗脱步骤的低 ph 条件下从固相载体上解离通过清洗步骤, 我们得到了用于结合生物素化抗原的小柱接下来, 以 5 µl/min 的流速向每个 SA-W 小柱上样 1 µl 含 2 µg 生物素化抗原的 HEPES 缓冲液, 然后使用由固定化应用控制的 AssayMAP Bravo, 采用 HEPES 缓冲液执行一次清洗本实验采用了 Sample Load and Internal Cartridge Wash 1 ( 上样和内部小柱清洗 1) 的默认设置, 取消了固定化应用中的所有其他步骤接下来, 将 2 µg 生物素化的 ADC 抗原偶联到每个 SA-W 小柱上, 从而得到 ADC 亲和小柱 ADC 亲和纯化用去离子 (DI) 水将商购冻干 ADC 复溶至 1 mg/ml 后分装, 使用前置于 -8 C 下储存将 ADC 加入大鼠血清后进行连续稀释, 制备浓度分别为和.625 µg/ml 的 ADC 溶液将未加入 ADC 的大鼠血清作为对照在将上述样品上样至 ADC 亲和小柱之前, 用 HEPES 缓冲液按 1:1 的比例对其进行稀释亲和纯化步骤通过由亲和纯化应用控制的 AssayMAP Bravo 执行简而言之, 该过程是以 3 µl/min 的流速将 1 µl 含 ADC 的大鼠血清稀释液上样至各 ADC 亲和小柱 ( 每个 ADC 浓度 n = 4), 然后用四种清洗液 ( 各 5 µl, 分别为 : HEPES 缓冲液含 1 M NaCl 的 HEPES 缓冲液.3% 甲酸和水 ) 以 1 µl/min 的流速进行四次清洗最后, 用 15 µl 1% 甲酸将各小柱中纯化后的 ADC 洗脱至体积固定为 15 µl 的.5% 氢氧化铵溶液中, 以中和经纯化的 ADC LC/MS 分析使用配备安捷伦双喷射流 ESI 离子源的 Agilent ifunnel 精确质量 655 Q-TOF( 加利福尼亚州圣克拉拉市 ) 与 Agilent 129 Infinity UHPLC 系统 ( 加利福尼亚州圣克拉拉市 ) 联用进行 LC/MS 分析表 1 和表 2 列出了所采用的 LC/MS 参数从所有血清样品纯化所得的 ADC 中取 3 µl( 总样品体积的十分之一 ) 进样, 仅进行质谱分析 ; 另外, 分别从 ADC 浓度为和.625 µg/ml 的血清样品纯化所得的 ADC 中取 1 µl( 总样品体积的三分之一 ) 进样, 仅进行质谱分析进样 1 ng 商购 ADC (n = 4) 作为对照数据分析使用 Agilent MassHunter BioConfirm 软件分析原始数据文件提取 min 的谱图并计算其平均值, 然后进行解卷积处理接下来, 采用 Agilent MassHunter DAR 计算器和解卷积质谱图计算各载药量下的 ADC DAR 和 ADC 百分比表 3 列出了解卷积参数 2

3 表 1. 液相色谱参数参数 Agilent 129 Infinity UHPLC 系统色谱柱 Agilent PLRP-S 1Å 8 µm mm (PL ) 样品恒温 5 C 流动相 A.1% 甲酸的水溶液流动相 B.1% 甲酸的乙腈溶液梯度 ( 分段 ) 时间 (min) %B 停止时间 7.5 min 柱温 8 C 流速.4 ml/min 表 2. 质谱参数参数电离模式离子源 Agilent 655 Q-TOF 质谱仪正离子模式干燥气温度 225 C 干燥气流速安捷伦双喷射流离子源 14 L/min 鞘气温度 325 C 鞘气流速雾化器毛细管电压喷嘴碎裂电压 Oct RF Vpp 12 L/min 4 psi 45 V 15 V 25 V 75 V 采集参数 MS 模式高 (1 m/z) 质量范围, 扩展质量范围 (2 GHz), 仅 MS 模式, 质量范围 1 45 m/z 表 3. MassHunter BioConfirm 参数参数解卷积算法解卷积设置使用受限的 m/z 范围基线加合物同位素峰宽 Agilent MassHunter BioConfirm 解卷积 (MS): 蛋白质最大熵质量范围 : KDa 质谱精度 : 1. Da 2 45 m/z 扣除基线基线因子 3.5 质子自动 3

结果与讨论我们为血清样品中 ADC DAR 的测定成功开发出了一套解决方案该解决方案包括 : 在 AssayMAP Bravo 平台上使用 ADC 亲和小柱对血清中的 ADC 进行自动亲和纯化 ; 使用 129 Infinity UHPLC 和 655 Q-TOF 质谱仪采集完整 ADC 的质谱数据 ; 使用

制备了定制 AssayMAP 亲和小柱, 该操作采用由固定化应用 ( 专为定制亲和小柱而设计 ) 控制的 AssayMAP Bravo 执行每个小柱上固定 2 µg 抗原, 超过本应用简报中将要纯化的最大抗体摩尔量近四倍优化研究的结果表明, 在本应用简报所采用的流速条件下, 过量四倍摩尔量的抗原足以捕获目标 ADC(

ADC DAR 测定工作流程将商购 ADC 加入大鼠血清, 使其浓度达到 2 µg/ml, 然后使用 ADC 亲和小柱以及由亲和纯化应用控制的 AssayMAP Bravo 进行亲和纯化假定回收率为 1%, 对 1 ng 商购 ADC( 图 2A) 和 1 ng 血清样品亲和纯化 ADC( 图 2B) 进行

5 min 之间的小峰则代表大鼠血清中共纯化的蛋白, 其质量数范围集中在 15 m/z 左右通过微调过的液相色谱梯度可将这些残留的共纯化蛋白彻底分离, 因此它们不会对 ADC 离子化造成影响图 2C 和 2D 表明, 两种 ADC 在 ADC 洗脱窗口中得到的提取质谱图几乎完全相同经解卷积处理后, 在商购

4 结果与讨论我们为血清样品中 ADC DAR 的测定成功开发出了一套解决方案该解决方案包括 : 在 AssayMAP Bravo 平台上使用 ADC 亲和小柱对血清中的 ADC 进行自动亲和纯化 ; 使用 129 Infinity UHPLC 和 655 Q-TOF 质谱仪采集完整 ADC 的质谱数据 ; 使用 Agilent MassHunter BioConfirm 对质谱图进行解卷积处理, 以及使用 Agilent MassHunter DAR 计算器计算 DAR( 图 1) 该工作流程的第一个步骤是对血清中的 ADC 进行自动纯化为执行该步骤, 我们将生物素化的 ADC 抗原固定到 AssayMAP SA-W 小柱上, 制备了定制 AssayMAP 亲和小柱, 该操作采用由固定化应用 ( 专为定制亲和小柱而设计 ) 控制的 AssayMAP Bravo 执行每个小柱上固定 2 µg 抗原, 超过本应用简报中将要纯化的最大抗体摩尔量近四倍优化研究的结果表明, 在本应用简报所采用的流速条件下, 过量四倍摩尔量的抗原足以捕获目标 ADC( 相关数据未显示 ) 流速与摩尔量过量水平相关, 这两个参数均可根据具体实验设计更改应注意的是, 所用抗原量并非受 SA-W 容量限制 ( 针对本实验中的特定抗原, 容量约为 75 µg), 而应该以最大限度减少实验中的抗原消耗量为选择标准 SA-W SA-W LC/MS DAR 图 1. ADC DAR 测定工作流程将商购 ADC 加入大鼠血清, 使其浓度达到 2 µg/ml, 然后使用 ADC 亲和小柱以及由亲和纯化应用控制的 AssayMAP Bravo 进行亲和纯化假定回收率为 1%, 对 1 ng 商购 ADC( 图 2A) 和 1 ng 血清样品亲和纯化 ADC( 图 2B) 进行 LC/MS 分析, min 之间的主峰即代表洗脱的 ADC 在亲和纯化 ADC 的分析结果中,1 1.5 min 之间出现的其他小峰代表残留的盐类, min 之间的小峰则代表大鼠血清中共纯化的蛋白, 其质量数范围集中在 15 m/z 左右通过微调过的液相色谱梯度可将这些残留的共纯化蛋白彻底分离, 因此它们不会对 ADC 离子化造成影响图 2C 和 2D 表明, 两种 ADC 在 ADC 洗脱窗口中得到的提取质谱图几乎完全相同经解卷积处理后, 在商购 ADC( 图 2E) 和亲和纯化 ADC( 图 2F) 的解卷积质谱图中均可观察到七个峰组, 它们所代表的 DAR 值分别为 7, 其中每个峰组中有四个主峰, 代表不同糖型的 ADC( 即 GF/GF GF/G1F G1F/G1F 或 GF/G2F, 以及 G1F/G2F) 我们使用 MassHunter DAR 计算器, 利用七个峰组下的峰面积计算了 DAR 两种 ADC 计算所得的 DAR 值相似 (DAR = 3.5) 上述结果表明 AssayMAP Bravo 平台的自动 ADC 纯化功能可达到高回收率和高纯度 4

5 A ण क़ (min) C E ዊ Բ (m/z) 38 F.8 1. DAR DAR = D DAR = ण क़ (min) ዊ Բ (m/z) B 1 8 DAR ਝओዊଉຕ (Da) ਝओዊଉຕ (Da) 图 2. 商购 ADC 以及亲和纯化获 ADC 的代表性总离子流色谱图 (TIC) 提取质谱图和解卷积质谱图 A) 商购 ADC 的 TIC B) 亲和纯化 ADC 的 TIC C) 商购 ADC 的提取质谱图 D) 亲和纯化 ADC 的提取质谱图 E) 商购 ADC 的解卷积质谱图示出了 DAR 计算结果 F) 亲和纯化 ADC 的解卷积质谱图示出了 DAR 计算结果 5

6 为评估该工作流程对 PK 研究的适用性, 我们将商购 ADC 加入大鼠血清并连续稀释至和.625 µg/ml, 然后按上述操作进行纯化另外, 将不含 ADC 的大鼠血清样品作为对照上样至各小柱的血清样品中所含的 ADC 量分别为和 ng 将每个纯化样品洗脱液的十分之一用于质谱分析进样, 对应的 ADC 上样量分别为和 ng( 假设回收率为 1%) 图 3 所示为 ADC 质量数范围内 (2 45 m/z) 的提取离子色谱图 (EIC) 对 min 之间的峰进行了积分, 并计算了各 ADC 浓度的变异系数 (CV) 在 ADC 浓度高于 5 µg/ml 的血清样品中, 纯化 ADC 的重现性非常出色, CV 均低于 1% 请注意, 对照组亲和纯化血清样品 ( 不含 ADC) 的 EIC 基本为直线, 这表明 ADC 洗脱窗口中不存在共纯化蛋白这种纯化特异性得益于 SA-W 小柱极低的非特异性结合性能 ADC 针对抗原的高度特异性以及经过微调的清洗条件该工作流程无需采用表面活性剂去除共纯化蛋白 EIC: m/z µg/ml CV = 3.44 % 1 µg/ml CV = 6.9 % 5 µg/ml CV = 8.61 % 2.5 µg/ml CV = 3.33 % 5 µg/ml CV = 5 %.625 µg/ml CV = % µg/ml CV = 7.54 % (min) 图 3. 不同血清浓度的亲和纯化 ADC 的提取离子色谱图 (EIC) 使用 ADC 亲和小柱和 Agilent AssayMAP Bravo 分别对 5 µl 含和 µg/ml ADC 的大鼠血清 ( 各浓度下 n = 4) 进行亲和纯化将纯化血清样品所得的 ADC 的十分之一用于各亲和纯化样品的质谱分析进样提取出 EIC (2 45 m/z) 对 min 之间的峰进行积分, 并计算各 ADC 浓度样品的变异系数 (CV) 图 4 所示为分析 ADC 浓度为和.625 µg/ml 的大鼠血清亲和纯化 ADC 样品得到的解卷积质谱图及其相应的 DAR 对于纯化 ADC 浓度为 2 1 和 5 µg/ml 的血清样品所得的 ADC, 我们采用的是 1% 的上样量, 由于信噪比 (S/N) 会随着所分析的 ADC 量下降而降低, 因此对于纯化 ADC 浓度为和.625 µg/ml 的血清样品所得的 ADC, 我们采用了 33% 的上样量这样可使得低 ADC 浓度的样品也能得到高质量的解卷积质谱图实验采用的所有 ADC 浓度条件均获得了一致的解卷积质谱图和 DAR( 图 4, 表 4) 对于纯化自 ADC 浓度为和 2.5 µg/ml 的血清样品的各 ADC 样品而言, 不同载药量 (D-D7) ADC 的百分比相当, 并且该百分比非常接近直接对商购 ADC 进行质谱分析所得结果但对于纯化自 ADC 浓度为 5 和.625 µg/ml 的血清样品的各 ADC 样品而言, 不同载药量 ADC 的百分比与商购 ADC 分析结果的一致性稍差 ( 表 4, 图 5) 因此, 为了提高谱图质量以及减少工作流程的检测 / 定量步骤所受的限制, 可适当提高执行 LC/MS 分析时的洗脱液进样百分比此外, 还可以在洗脱 ADC 之前进行去糖基化处理, 以简化谱图并改善信号上述结果表明, 本应用简报所展示工作流程能够在血清 ADC 浓度较低的条件下可重现地测定不同载药量的 ADC DAR 和 ADC 百分比 6

7 A DAR 148 B DAR 148 C DAR (Da) = 2 µg/ml DAR = (Da) = 1 µg/ml DAR = 3.5 = 5 µg/ml DAR = (Da) D DAR E DAR F DAR (Da) (Da) = 2.5 µg/ml DAR = 3.5 = 5 µg/ml DAR = 3.5 =.625 µg/ml DAR = (Da) 图 4. 大鼠血清亲和纯化 ADC 样品的代表性解卷积质谱图和 DAR 使用 ADC 亲和小柱和 Agilent AssayMAP Bravo 分别对 5 µl 含和 µg/ml ADC 的大鼠血清 ( 各浓度下 n = 4) 进行亲和纯化对于纯化 ADC 浓度为 2 µg/ml (A) 1 µg/ml (B) 和 5 µg/ml (C) 的血清样品得到的 ADC, 取 1% 用于质谱分析进样 ; 对于纯化 ADC 浓度为 2.5 µg/ml (D) 5 µg/ml (E) 和.625 µg/ml (F) 的血清样品得到的 ADC, 取 33% 用于质谱分析进样 : 大鼠血清中 ADC 的浓度 7

8 表 4. 各载药量条件下的 DAR 和 ADC 百分比样品 DAR 各载药量下的 ADC 百分比 (%) DAR 商购 (n = 4) 3.5± ± ± 17.35± ± ± ± ± ±.77 亲和纯化自 ADC 浓度为 2 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 1 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 5 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 2.5 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 5 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 亲和纯化自 ADC 浓度为.625 µg/ml 的血清样品 (n = 4) 3.49±.2 2.4± ± ± ±5 2.17± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 14.41± ± ± ±.6 3.8± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± mg/ml 1 mg/ml 5 mg/ml 2.5 mg/ml 5 mg/ml.625 mg/ml ADC D D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 图 5. 各载药量下的 ADC 百分比 8

9 结论安捷伦为您提供了一套全面的 ADC DAR 测定解决方案, 包括使用 Agilent AssayMAP Bravo 进行自动亲和纯化 ; 使用 Agilent 129 Infinity UHPLC 和 Agilent 655 Q-TOF 采集 LC/MS 数据 ; 使用 Agilent MassHunter BioConfirm 软件进行解卷积处理, 以及使用 Agilent MassHunter DAR 计算器确定 DAR 该 ADC DAR 测定解决方案的优势在于 : 节省人力, 降低变异性并减少可能引入的人为误差提高血清 ADC 纯化操作的产率和纯度生成高分辨率的谱图轻松完成 DAR 计算参考文献 1. Perez, H. L.; et al. Antibody-drug conjugates: current status and future directions. Drug Discovery Today 214, 19(7), Beck, A.; et al. Cutting-edge mass spectrometry methods for the multi-level structural characterization of antibody-drug conjugates. Expert Reviews of Proteomics 216, 13:2, Xu, K.; et al. Characterization of intact antibody-drug conjugates from plasma/serum in vivo by affinity capture capillary liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry 211, 412,

10 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用于诊断目的本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 3 日, 中国印刷 CHCN

AssayMAP Bravo 自动化样品前处理平台与安捷伦 LC/MS 和 MassHunter/ BioConfirm/DAR 计算器软件相结合, 能够针对 ADC DAR 计算提供可重现的便捷解决方案本应用简报中采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对经 / 未经去糖基化的完

AssayMAP Bravo 自动化样品前处理平台与安捷伦 LC/MS 和 MassHunter/ BioConfirm/DAR 计算器软件相结合, 能够针对 ADC DAR 计算提供可重现的便捷解决方案本应用简报中采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对经 / 未经去糖基化的完抗体药物偶联物 (ADC) 的药物 / 抗体比率 (DAR) 计算利用自动化样品前处理和新型 DAR 计算器软件应用简报作者 Jing Chen 和 Steve Murphy 安捷伦科技公司前言抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物 ADC 的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连 ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织,

实验部分材料 重组人 HER2 胞外区 (ECD) 购自 ACRO Biosystems( 美国特拉华州纽瓦克 ) EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 ( 美国纽约州格兰德岛 ) 大鼠血清购自 Bioreclamation

实验部分材料重组人 HER2 胞外区 (ECD) 购自 ACRO Biosystems( 美国特拉华州纽瓦克 ) EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 ( 美国纽约州格兰德岛 ) 大鼠血清购自 Bioreclamation