实验部分材料单克隆抗体标准品 RM 8671 购自美国国家标准技术研究院 (NIST) 质谱级胰蛋白酶 /Lys-C 酶混合物购自 Promega 所有其他化学品均购自 Sigma-Aldrich AssayMAP C18 小柱来自安捷伦科技公司样品前处理 NIST mab 标准品 RM 867

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梁县梁
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1 用于单克隆抗体肽谱分析的一体化工作流程应用简报生物治疗药物和生物仿制药作者 David L. Wong 安捷伦科技有限公司 Santa Clara, CA, USA Jing Chen 安捷伦科技有限公司 Madison, WI, USA 前言单克隆抗体 (mab) 是制药行业中发展最快的一类药物 mab 作为蛋白质药物, 从初始表达到最终商业化经历了一个高度复杂的过程, 需要在每个步骤中对其进行仔细表征在用于 mab 表征的众多分析方法中, 肽谱分析是一项至关重要的技术, 它能够实现 mab 的一级结构确认, 还可以对翻译后修饰 (PTM)( 如脱酰氨基化氧化和糖基化 ) 进行鉴定和定量分析 1 使用 LC/MS/MS 方法进行的 mab 肽谱分析包括将纯化的 mab 酶裂解为肽段串联质谱分析以及数据解析样品前处理通常涉及多个步骤, 包括变性还原烷基化和酶解手动进行肽谱分析样品前处理的过程十分繁琐, 且易于受到可扩展性和重现性不佳的影响此应用简报展示了一个高通量工作流程, 能够同步进行样品消解和样品净化, 具有很高的重现性分析过程中使用 Agilent AssayMAP Bravo 液体处理自动化系统 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱与 Agilent 6550 Q-TOF 质谱联用系统 ( 用于灵敏而准确的谱图采集 ), 以及 Agilent MassHunter BioConfirm 软件 ( 用于数据自动分析 )

2 实验部分材料单克隆抗体标准品 RM 8671 购自美国国家标准技术研究院 (NIST) 质谱级胰蛋白酶 /Lys-C 酶混合物购自 Promega 所有其他化学品均购自 Sigma-Aldrich AssayMAP C18 小柱来自安捷伦科技公司样品前处理 NIST mab 标准品 RM 8671 使用 AssayMAP Bravo 平台进行变性还原烷基化酶解及脱盐处理将样品用去离子水稀释至和 0.5 µg/µl( 每个浓度重复 8 次 ) 后, 从每份样品中取 10 µl 转移到不透明的 96 孔 U 型底板上由蛋白质样品前处理工作台软件协调进行样品前处理溶液内酶解模块用于进行样品消解 : 向每份样品中加入 30 µl 的变性剂和还原剂 (8 M 胍,13.3 mm TCEP,pH 7.5) 将样品板密封, 并在台板外于 37 C 下温育 1 小时开封样品板后, 使用溶液内消解应用将 10 µl 烷基化试剂 (132 mm 碘乙酰胺 ) 从带盖的不透明 96 孔 U 型底板转移至每份样品中将样品混合盖上样品板盖, 在室温下避光温育 30 分钟然后将 210 µl 稀释剂 (50 mm Tris, ph 7.5) 加入到样品中, 随后加入 5 µl 用 50 mm 乙酸稀释的各种浓度的胰蛋白酶 /LysC 混合物 ( 酶 : 蛋白质 = 1:40) 将样品密封, 并在台板外于 37 C 下温育 2 小时再向样品中加入 5 µl 胰蛋白酶 /LysC 混合物, 然后将样品在台板外于 37 C 下继续温育 14 小时第二天, 使用 AssayMAP 试剂转移工具将 30 µl 10% TFA 转移到样品板中, 使样品酸化使用 C18 小柱通过肽段纯化应用对样品进行脱盐处理使用 100 µl 60% ACN 0.1% TFA 灌注小柱, 并用 50 µl 0.1% TFA 使其达到平衡, 以 5 µl/min 的流速向小柱中注入消解样品, 再使用 50 µl 的 0.1% TFA 对小柱进行清洗, 然后使用 15 µl 的 60% ACN 0.1% TFA 以 3 µl/min 的流速洗脱至 165 µl 0.1% FA 中, 使 ACN 的浓度降低至 5% 然后使用 LC/MS 系统对 0.5 µg 的每个样品进行分析 LC/MS 分析仪器液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统, 包括 : Agilent 1290 Infinity II 高速泵 G7120A Agilent 1290 Infinity II Multisampler G7167B Agilent 1290 Infinity II 柱温箱 G7116B 质谱系统配有安捷伦双喷射流离子源的 Agilent 6550 ifunnel Q-TOF 液质联用系统使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统联用配备双喷射流 ESI 离子源的 Agilent 6550 ifunnel Q-TOF 液质联用系统进行 LC/MS/MS 和 LC/MS 分析使用 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 ( mm, 2.7 µm) 实现液相色谱分离表 1 和表 2 汇总了所采用的 LC/MS/MS 参数 LC/MS 分析中采用了相同的液相色谱梯度和离子源参数以每秒五张谱图的采集速率采集质谱数据数据分析使用 Agilent MassHunter BioConfirm B.08 软件处理 LC/MS/MS 中采集的原始数据简言之, 首先使用分子特征提取器 (MFE) 对原始数据进行处理将发现肽段参数设为默认值, 而将 m/z 范围设为不受限, 另外将峰值过滤器的峰高设为大于 500 响应值在 NIST mab 序列中搜索结果, 序列中包括烷基化 (C) 的固定修饰以及氧化 (M) 脱酰氨基化 (NQ) 焦谷氨酸化 (Q) 和糖基化 (N) 各种常见形式的可变修饰质谱匹配的允许误差为 ±10 ppm, MS/MS 匹配的允许误差为 ±20 ppm 允许两处未发生酶裂解鉴定的所有肽段中至少包括 1 张 MS/MS 谱图手动检查低 BioScores 肽段的有效性 2

3 表 1. 液相色谱参数参数值色谱柱 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱, mm,2.7 µm 柱温箱 4 C 溶剂 A 溶剂 B 0.1% 甲酸的水溶液 0.1% 甲酸的乙腈溶液梯度 0-15 min 内 B 由 5% 升至 40% min 内 B 由 40% 升至 90% min 内 B 为 90% 柱温 60 C 流速 0.4 ml/min 表 2. 质谱仪参数参数值干燥气温度 290 C 干燥气流速 13 L/min 雾化器压力 35 psig 鞘气温度 275 C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4000 V 喷嘴电压 2000 V 碎裂电压 175 V 四极杆 AMU 100 采集模式扩展动态范围 (2 GHz) 质量数范围 m/z 采集速率 5 质谱图 / 秒自动 MS/MS 范围 m/z 最小 MS/MS 采集速率 3 质谱图 / 秒分离峰宽中等 ( 约 4 m/z) 母离子 / 循环前 10 碰撞能量 3.6*(m/z)/ MS/MS 阈值 1000 响应值和 0.001% 动态排除开启 ; 重复 3 次然后排除 0.2 min 基于母离子丰度的扫描速度是目标值使用 MS/MS 累积时间限制是纯度严格性 100%, 截留率 30% 同位素模型肽母离子排序仅按丰度 ;+2 +3 > +3 3

结果与讨论采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台 Agilent 6550 Q-TOF LC/MS/MS

08 软件的一体化工作流程虽然肽谱分析是生物药物 mab 表征的常规方法, 但其样品前处理过程复杂,

平台可以自动完成肽谱分析的样品前处理操作, 加快了处理进程, 提高了结果的重现性 AssayMAP

自动化系统按照软件的指示进行基本步骤的操作, 例如 LC/MS 分析所需的样品变性还原烷基化酶解和纯化

使分析人员能够在样品接受前处理的同时分身执行其他任务样品前处理方法还可在不同实验室的 AssayMAP 系统之间转移,

4 结果与讨论采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台 Agilent 6550 Q-TOF LC/MS/MS 系统和 Agilent BioConfirm B.08 软件的一体化工作流程虽然肽谱分析是生物药物 mab 表征的常规方法, 但其样品前处理过程复杂, 且这对保证分析结果质量有至关重要的影响分析差异可能来自于技术技术人员或不同合作实验室之间的细微差异当需要比较不同月份或年份之间的不同批次药品时, 这种差异更具挑战性此外, 手动进行样品前处理很难针对克隆选择等高通量应用进行放大 Agilent AssayMAP Bravo 平台可以自动完成肽谱分析的样品前处理操作, 加快了处理进程, 提高了结果的重现性 AssayMAP 软件中简单易用的应用专为应对各种类型蛋白质的样品前处理工作流程 ( 包括溶液内消解和肽段纯化 ) 而设计自动化系统按照软件的指示进行基本步骤的操作, 例如 LC/MS 分析所需的样品变性还原烷基化酶解和纯化这种开放式自动化解决方案专为蛋白质样品前处理而设计, 这些机械步骤的自动化 ( 图 1 和图 2) 使分析人员能够在样品接受前处理的同时分身执行其他任务样品前处理方法还可在不同实验室的 AssayMAP 系统之间转移, 可提高不同机构间的结果重现性图 1. mab 肽谱分析的一体化工作流程, 依次为 Agilent AssayMAP Bravo 平台上的自动化样品前处理 Agilent 6550 Q-TOF LC/MS/MS 分析和 Agilent BioConfirm B.08 软件图 2. Agilent AssayMAP 肽段样品前处理工作流程用于肽谱分析和其他工作流程的消解纯化与选择性分馏 4

5 事实证明,Agilent 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS/MS 系统在蛋白质鉴定和详细肽谱分析中能够获得优异的质量准确度和高度灵敏的质谱结果 2 BioConfirm 软件能够在 MFE 多肽序列匹配和蛋白质序列覆盖映射等领域实现自动数据处理通常情况下, 已消解 mab 样品的 LC/MS/MS 分析中包含大量肽段, 很多肽段中又含有各种 PTM, 因此样品十分复杂采集质谱数据后, BioConfirm 肽谱分析工作流程将会进行 MFE 处理, 并利用高度复杂的数据生成化合物 ( 即肽段 ) 列表随后, 将此化合物列表与用户特定的 mab 序列进行匹配, 并生成一个序列覆盖映射图 3 示出了已用胰蛋白酶 /Lys-C 混合物消解的 NIST mab 的提取化合物色谱图 (ECC) 用所有已鉴定肽段在 NIST mab 轻链和重链中的相应序列号对其进行标记图 3. 通过 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱得到的来自胰蛋白酶 /Lys-C 消解 NIST mab 标准品 RM 8671 的肽段 ECC 轻链和重链分别被标记为 A 和 B 5

6 为得到高度可靠的肽段鉴定结果, 所有已匹配肽段的质谱质量数误差应 < 10 ppm, 并至少有一张确证 MS/MS 谱图图 4 显示了两个选定肽段碎片离子的 MS/MS 谱图 BioConfirm 评分算法考虑了以下因素 : b 碎片离子和 y 碎片离子的存在亚胺离子质量准确度 MS/MS 峰强度其他参数结合高质量 MS 和 MS/MS 数据有助于提高肽段匹配的可靠性, 并提供有关肽段修饰的大量信息 ( 图 5 和图 6) 图 4. 消解 NIST mab 所得肽段的代表性 MS/MS 谱图 A) 轻链肽段 B) 重链肽段 6

7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT 图 5. A) 翻译后修饰 ( 甲硫氨酸氧化 ) 分析天然肽段和 Met 氧化肽段 ( 轻链肽段 1-28) 的 MS/MS 谱图上图 : 天然肽段, 下图 :Met 4 位置氧化的肽段 ( 绿色框 ) B) 天然肽段 ( 蓝色 ) 和氧化肽段 ( 红色 ) 的叠加 ECC 和相对定量分析结果 ( 轻链肽段 1-28) 7

8 图 6. A) 翻译后修饰 ( 脱酰氨基化 ) 分析天然肽段和脱酰胺肽段的 MS/MS 谱图 ( 轻链 : ) 上图 : 天然肽段, 中图 :Asn 136 处的脱酰氨基化, 下图 :Asn 137 处的脱酰氨基化 B) 天然肽段和脱酰胺肽段的叠加 ECC 和相对定量分析结果 ( 轻链 : ) 插图: 异天冬氨酸 -136 和异天冬氨酸 -137 的放大图 8

本文还研究了 mab 蛋白序列覆盖率与消解样品量之间的关系表 3 总结了在不同样品浓度下制备的 NIST mab 消解物的蛋白质序列覆盖率在分析的所有 NIST mab 消解物 (n = 8) 中, 每个蛋白质浓度下的平均蛋白质序列覆盖率均高于 95% 图 7 显示了由 BioConfirm B.08 软件生成的典型肽谱分析结果, 其中包含蛋白质序列覆盖率表 3.

9 本文还研究了 mab 蛋白序列覆盖率与消解样品量之间的关系表 3 总结了在不同样品浓度下制备的 NIST mab 消解物的蛋白质序列覆盖率在分析的所有 NIST mab 消解物 (n = 8) 中, 每个蛋白质浓度下的平均蛋白质序列覆盖率均高于 95% 图 7 显示了由 BioConfirm B.08 软件生成的典型肽谱分析结果, 其中包含蛋白质序列覆盖率表 3. 不同样品浓度下酶解 NIST mab 的序列覆盖率总结消解的 NIST mab 消解物 ( 重复次数 ) 样品 (µg) 平均 % 96% 96% 95% 96% 96% 95% 97% 96% 50 96% 96% 97% 96% 96% 97% 96% 96% 96% 10 97% 97% 97% 97% 97% 97% 98% 98% 97% 05 97% 93% 97% 97% 94% 94% 97% 94% 95% 图 7. Agilent MassHunter BioConfirm 软件中代表性肽谱分析结果和蛋白质序列覆盖率的屏幕截图 9

10 翻译后修饰分析蛋白质的甲硫氨酸氧化和天冬酰胺的脱酰氨基化是具有生物学意义的两种最常见 PTM 甲硫氨酸 (Met) 是一种极易被活性含氧物质氧化的含硫氨基酸对 Met 氧化的表征在 mab 型治疗药物的开发过程中通常十分关键在肽谱分析结果中, 含 Met 4 的 NIST mab 轻链肽段 1-28 被鉴定为部分氧化图 5A 显示了天然肽段 ( 母离子位于 m/z 处,+3) 与 Met 氧化肽段 ( 母离子位于 m/z 处,+3) 的 MS/MS 谱图对比结果 b 4 -b 7 碎片离子 ( 绿色框 ) 中的主要差异 (+16 Da) 能够清楚区分出天然肽段和修饰形式, 并指出了修饰的具体位置此外, 质谱数据显示了每种肽段类型的相对数量, 其中氧化形式和天然形式分别占肽段总量的约 0.43% 和 99.57% ( 图 5B) 脱酰氨基化是另一种常见的 PTM 在这种情况下, 自发的非酶反应通过移除酰胺基团并使用羧基将其替换来修饰天冬酰胺或谷氨酰胺天冬酰胺通常转化为天冬氨酸 (Asp) 或异天冬氨酸 (Iso Asp) 脱酰胺率取决于一级结构蛋白质结构以及 ph 温度和离子强度等溶液性质 3 本分析采用 MS/MS 谱图在三个不同的保留时间处找到了三个脱酰胺形式的 NIST mab 轻链肽段图 6A 显示了天然肽段和脱酰胺肽段的 MS/MS 谱图, 其中 y 系列碎片在较大质量数范围内是主要离子, 而 b 系列碎片在较小质量数范围内是主要离子 y 6 -y 12 碎片离子 ( 橙色框 ) 均显示出一个 0.98 Da 的特征质量数偏移, 清楚地表明肽段的这个区域内存在脱酰氨基化现象此外, 由于 y 5 离子 ( 红色框 )( 中图 ) 与天然形式 ( 上图 ) 保持相同, 显然该肽段的脱酰氨基化发生在 Asn 136 而非 Asn 137 处相比之下, 下图中的 y 5 离子 ( 紫色框 ) 的质量数比天然序列高 0.98 Da, 证实了这一肽段群中的脱酰氨基化发生在 Asn 137 位置质谱数据的定量分析结果揭示了与该轻链肽段脱酰氨基化动力学有关的大量信息在样品中, 未修饰形式的天然肽段占样品的 97.17%, 三种脱酰胺异构体在样品中的比例各不相同 : 异天冬氨酸 -136 为 1.21% 异天冬氨酸 -137 为 0.25%, 而天冬氨酸 -136 则为 1.38% 结果列于图 6B 中值得注意的是, 这种位置特异性 PTM 信息每种修饰的相对定量结果对于治疗性药物 (mab) 的开发通常十分关键而此工作流程使这些信息十分易于获得肽谱分析工作流程十分复杂, 需要进行大量样品处理步骤以生成精确还原烷基化消解和脱盐的样品用于 LC/MS 测量, 因此这种类型的定量分析得益于通过 AssayMAP 液体处理系统轻松实现的高度重现的全自动样品处理流程 10

11 自动肽谱分析工作流程可生成高度重现的结果这种自动工作流程解决方案能够根据样品数量轻松放大或缩小实验规模, 因此我们在本研究中进行重复分析, 以便评估系统在两个层面上的精度和重现性第一个层面, 我们将同一个孔中的相同酶解 mab 样品进样至液质联用系统并重复测定八次, 来评估液质联用系统的定量重现性其次, 我们将在不同孔中经变性酶解和纯化后的八份 mab 样品分别进样至液质联用系统中, 然后对其进行分析在本次实验中, 所有定量测量均在 6550 Q-TOF LC/MS/MS 仪器的仅 MS 模式下进行利用 5 µg mab 制备样品的 EIC 对 28 种裂解完全的肽段进行定量分析以下分别显示了 LC/MS 重复进样 ( 图 8A 和图 8B) 和重复样品前处理 ( 图 8C 和图 8D) 的两种代表性肽段的叠加 EIC 在接受定量分析的 28 种肽段中,17 种肽段的 CV 小于 10%( 平均 6%), 7 种肽段的 CV 在 10% 和 20% 之间 ( 平均 15%), 4 种肽段的 CV 大于 20%( 图 8E) 这些结果与其他 AssayMAP 肽谱分析研究中报告的结果一致 4 虽然本研究中未详细说明, 采用 Protein A Protein G 或酶链亲和素亲和小柱的 AssayMAP 亲和纯化应用可将此工作流程的适用范围扩大至悬浮于生长培养基血浆或其他复杂基质中的样品图 8. 5 µg NIST mab 消解所得代表性肽段的 EIC A,B) 同一样品在 LC/MS 中的重复进样结果 (n = 8) C,D) 完整样品前处理的重复结果 (n = 8) E) %CV 小于 10% 10%-20% 以及大于 20% 的肽段数量饼图 11

12 结论安捷伦肽谱分析工作流程解决方案集先进的液体处理自动化系统高效色谱技术精确质量数 Q-TOF LC/MS 系统与强大的软件于一体, 自动处理并精简对 mab 生物制剂开发至关重要的复杂处理过程此工作流程采用 : Agilent AssayMAP Bravo 系统, 能够自动进行酶解和样品纯化, 具有优异的重现性 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱, 可实现出色的液相色谱分离, 快速分离有助于提高分析实验室的效率高度准确且灵敏的 Agilent 6550 Q-TOF LC/MS/MS 系统, 能够生成无偏差的肽谱分析数据, 可实现单克隆抗体蛋白质的全面序列覆盖 Agilent MassHunter BioConfirm 数据分析软件, 可执行自动数据提取序列匹配 PTM 鉴定和序列覆盖率计算参考文献 1. Greer, F. M. MS Analysis of BioPharmaceutical Products. Innovation in Pharmaceutical Technology 2001, High Resolution and Rapid Peptide Mapping of Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infinity UHPLC and an Agilent 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS System( 利用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 和 Agilent 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS 系统对单克隆抗体进行高分离度的快速肽谱分析 ), 安捷伦科技公司, 出版号 EN 3. Robinson, N. E. Protein Deamidation. PNAS 2002, 99(8), 自动化液质联用样品前处理 : 通过 Agilent AssayMAP Bravo 平台实现高通量溶液内酶解和肽段纯化, 安捷伦科技公司, 出版号 CHCN 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用于诊断目的本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 2 月 8 日, 中国出版 CHCN

实验部分试剂与化学品胰蛋白酶来自安捷伦科技公司 (Santa Clara, CA) Eppendorf 96 孔 PCR 板购自 Eppendorf (Hauppauge, NY), 其他所有化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) LC/MS 分析使用配备安捷伦双

实验部分试剂与化学品胰蛋白酶来自安捷伦科技公司 (Santa Clara, CA) Eppendorf 96 孔 PCR 板购自 Eppendorf (Hauppauge, NY), 其他所有化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) LC/MS 分析使用配备安捷伦双分析抗体 - 药物偶联物的药物结合位点利用自动化样品前处理与 LC/MS 分析应用简报作者 Jing Chen 安捷伦科技公司 3 Fourier Drive, Suite, Madison, WI 5377, USA Alex Zhu 安捷伦科技公司 85 Centerville Road, Wilmington, DE 988, USA 前言结合了单克隆抗体 (mab) 特异性与细胞毒性分子效能的抗体药物偶联物

实验部分材料 单克隆抗体标准品 RM 8671 购自美国国家标准技术研究院 (NIST) 质谱级胰蛋白酶 /Lys-C 酶混合物购自 Promega 所有其他化学品均购自 Sigma-Aldrich AssayMAP C18 小柱来自安捷伦科技公司 样品前处理 NIST mab 标准品 RM 867

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