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琨麓京
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1 微生物学通报 Microbiology China 生物实验室 Jul. 20, 204, 4(7): by Institute of Microbiology, CAS DOI: /j.microbiol.china 大肠杆菌 O57 显色培养基检测效果的评价卢勉飞蔡芷荷陈霖熙邱国建吴清平 (. 广东环凯微生物科技有限公司广东广州 50663) (2. 广东省微生物研究所广东广州 50070) 2* 杨宁摘要 : 目的评价显色培养基对大肠杆菌 O57:H7 (Escherichia coli O57:H7) 的检测效果方法本实验室研制的大肠杆菌 O57 显色培养基 (HKM), 与国外梅理埃科玛嘉及国内厂家的同类产品及传统培养基 CT-SMAC 作比较, 对相关菌株以及污染样品和实际样品进行对比测试结果实验室研制的 HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基与科玛嘉同类产品在特异性灵敏度及检测效果方面均无明显差异, 均优于梅里埃国内厂家产品及 CT-SMAC 结论 HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基具有高检出率及高特异性的特点, 具有较好的应用价值和前景关键词 : 显色培养基, 大肠杆菌 O57, 检测效果 Evaluation of the detecting effect for chromogenic Escherichia coli O57 medium LU Mian-Fei CAI Zhi-He CHEN Lin-Xi QIU Guo-Jian WU Qing-Ping 2* YANG Ning (. Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co., Ltd., Guangzhou, Guangdong 50663, China) (2. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 50070, China) Abstract: [Objective] To evaluate the efficacy of chromogenic medium for Escherichia coli O57:H7. [Methods] A new Escherichia coli O57 chromogenic medium (HKM) was compared with CHROMagar, BioMerieux, and CT-SMAC for detection of Escherichia coli O57 by reference strains, artificially contaminated samples and natural samples. [Results] The selectivity, highly specificity and detection efficiency of HKM were as same as that of CHROMagar, and were better than that of BioMerieux, and CT-SMAC. [Conclusion] The HKM E. coli O57 chromogenic medium has a good effect and invaluable in detecting E. coli O57:H7, because it has high specificity and selectivity. Keywords: Chromogenic medium, Escherichia coli O57, Detecting effect 基金项目 : 广东省重大科技专项项目 (No. 202A ); 广州市科技计划项目 (No ) * 通讯作者 :Tel: ; :wuqp203@63.com 收稿日期 : ; 接受日期 : ; 优先数字出版日期 (

2 卢勉飞等 : 大肠杆菌 O57 显色培养基检测效果的评价 457 大肠埃希氏菌俗称大肠杆菌, 而大肠杆菌 O57:H7 (Escherichia coli O57:H7, E. coli O57:H7) 是肠出血性大肠埃希菌 (EHEC) 众多血清型中非常重要的一组目前被认为是世界范围内引起腹泻暴发和流行的主要原因, 对该菌的控制已成为世界性问题 [-6] 大肠杆菌 O57:H7 检测方法的研究是目前比较热门的话题, 建立快速准确的检测方法是临床快速诊断的重要内容大肠杆菌 O57 传统的检测方法利用的是常规生化原理 [7], 由于 EHEC O57:H7 除不发酵或迟缓发酵山梨醇以及编码的 β- 葡萄糖醛酸苷酶无活性外, 其它常见的特征与大肠埃希氏菌基本相似, 在传统改良山梨醇麦康凯琼脂培养基 (CT-SMAC) 中选择效果不明显, 不易识别, 而且当有其它的肠道菌群存在时会影响大肠杆菌 O57 的检出, 给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性随着现代科学技术的不断发展, 特别是免疫学生物化学分子生物学的不断发展, 不少快速简便特异敏感低耗且适用 E. coli O57:H7 的检测方法, 如 PCR 法金标试纸法免疫法乳胶凝集试验和 DNA 探针技术等快速检验方法, 已经得到不断扩大应用 [8-2] 然而这些方法需要较高的技术, 仪器试剂的成本较高, 而且酶联免疫吸附法乳胶凝集试验等会与大肠杆菌的多种血清型出现交叉反应相比以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术在当前能更好地与传统方法相接轨, 这种技术可以把检测计数和初步鉴别一次完成, 大幅度提高检测的速度和准确性, 检测成本较低, 因此其应用前景广阔 [3-7] 近年来, 国外商品化的显色培养基, 已被许多国家的政府和检测机构采用, 应用于食品临床和环境监测等领域, 给检测工作提供了很大方便, 但由于成本因素国内小企业及基层的卫生检验和监督机构较少使用进口产品我国在 2008 年修订了食品安全国家标准食品微生物学检验 - 大肠埃希氏菌 O57:H7/NM 的检验方法,O57 显色培养基首次进入我国的国家标准 [7] 与国际及国家标准接轨的良好应用环境, 必将会进一步促进显色检测技术在全国范围内得到更广泛的应用目前, 国内外已有不少应用显色培养基进行 E. coli O57:H7 分离的文献报道 [8-25] 为探讨显色法的实用价值, 本实验室研究试制了 HKM E. coli O57 显色培养基, 并用该培养基与国内外同类商品化产品测试了有一定代表性的菌株和食物样品材料与方法. 材料.. 菌株 :E. coli O57:H7 NCTC2900,E. coli O57:H7 CMCC(B)882364, E. coli O57:H7 FSCC(I)490,E. coli O57:H7 FSCC(I)4902, E. coli O57:H7 DTB2002,E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC8739,E. coli CMCC(B)4402,E. coli HK705, 产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes) CMCC(B)4503 阴沟肠杆菌(E. cloacae) CMCC(B)4530, 费氏柠檬酸杆菌 (Citrobacter freundii) ATCC8090, 亚利桑那沙门氏菌 (Salmonella arizona) CMCC(B)4700, 阪崎肠杆菌 (E. sakazakii) ATCC5329 DTB 2050, 普通变型杆菌 (Proteus vulgaris) CMCC(B)49027, 粪肠球菌 (Streptococcus faecalis) ATCC2922 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ATCC6538, 非 O 霍乱弧菌 (Vibrio cholerae non O )..2 培养基及试剂 :HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基 ( 简称 HKM) 由本实验室研制 ; 梅里埃大肠杆菌 O57 显色培养基 ( 简称梅里埃 /BioMerieux) 由法国梅里埃公司生产 ; 科玛嘉大肠杆菌 O57 显色培养基 ( 简称科玛嘉 /CHROMagar) 由法国科玛嘉公司生产 ; 国内厂家的大肠杆菌 O57 显色培养基由国内一家公司生产 ( 简称国内厂家 ) 营养琼脂改良山梨醇麦康凯琼脂培养基 (CT-SMAC) 改良 EC 肉汤 (mec) 由广东环凯微生物科技有限公司提供 MIDA+B 鉴定条由英国 Microgen 公司提供..3 样品 : 试验所用实际样品均采集于市内超市和

3 458 微生物学通报 Microbiol. China 204, Vol.4, No.7 市场, 猪肉 7 份, 鸡肉 8 份, 牛肉 5 份, 共 30 份..4 主要仪器 : 美国 SBI 公司 AP4000 全自动螺旋接种仪 ; 杭州迅数 HR3 菌落计数仪.2 方法.2. 培养基制备 : 各种培养基均按配制说明书制备成平板或斜面备用.2.2 特异性试验 : 将 24 株菌采用营养琼脂复苏, 37 C 培养 24 h 后, 分别划线接种 HKM 梅里埃科玛嘉国内厂家 4 种大肠杆菌 O57 显色培养基平板及 CT-SMAC 平板上,37 C 培养 8 24 h 观察不同细菌在平板上的菌落特征, 比较各种培养基对试验菌株的特异性.2.3 灵敏度试验 : 阳性菌 E. coli O57:H7 NCTC2900,E. coli O57:H7 CMCC(B) , E. coli O57:H7 FSCC(I)490,E. coli O57:H7 FSCC(I)4902 和 E. coli O57:H7 DTB2002 在营养琼脂复苏 24 h 后, 稀释到合适的浓度, 用螺旋接种法分别接种 HKM 梅里埃科玛嘉 3 种大肠杆菌 O57 显色培养基及 CT-SMAC 和营养琼脂, 37 C 培养 24 h, 计算菌落总数.2.4 人工污染样品试验 : 将 E. coli O57:H7 NCTC2900,E. coli O57:H7 FSCC(I)490 稀释到合适的浓度待用, 各取 25 ml 纯牛奶置于 225 ml 已灭菌的 mec 肉汤中, 分别添加不同浓度的 E. coli O57:H7 稀释液,4 C 培养 8 h 各取一环增菌液, 划线接种于不同显色培养基平板上, 37 C 培养 8 24 h, 观察记录菌落颜色和形态, 比较 4 种显色培养基对目标菌的检出情况表结果的判读表 Table Interpretation table of results 可疑菌株 E. coli O57:H7 Suspicious strains HKM 蓝绿色菌落 CHROMagar 品红色菌落 BioMerieux 蓝绿色菌落国内厂家紫红色菌落 CT-SMAC 无色菌落.2.5 天然污染样品试验 : 取 25 g 处理过的样品置于 225 ml mec 肉汤中,4 C 培养 8 h, 增菌液分别划线在 4 种显色培养基平板上,37 C 孵育 24 h, 挑取进行鉴定 ( 表 ) 2 结果与分析 2. 特异性试验培养基的特异性结果见表 2 在特异性显色方面,5 株 E. coli O57:H7 在 HKM 科玛嘉和 CT-SMAC 平板上均显示出了阳性的特征性色泽, 但在梅里埃和国内厂家的平板上,E. coli O57:H7 CMCC(B) DTB2002 和 FSCC(I)490 均不能显示阳性的特征性色泽 ; 而且, 其它非大肠杆菌 O57 的菌, 在 HKM 和科玛嘉平板 ( 除亚利桑那沙门氏菌外 ) 上均可以与大肠杆菌 O57 相区分, 但阪崎肠杆菌普通变型杆菌霍乱弧菌金黄色葡萄球菌和 E. coli HK705 在 CT-SMAC 上不可以与大肠杆菌 O57 相区分 ; 国内厂家以及梅里埃对其它非大肠杆菌 O57 的菌显色效果相当, 均存在部分假阳性菌, 不能区分两株阪崎肠杆菌和 E. coli HK705 表明 HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基与科玛嘉平板在特异性显色方面均无明显差异, 均优于 CT-SMAC 国内厂家及梅里埃产品 2.2 灵敏度试验培养基的灵敏度试验结果见表 3 在检测灵敏度方面, 对 5 株大肠杆菌 O57:H7 的检出率,HKM 与科玛嘉和营养琼脂相当, 均优于 CT-SMAC 与梅里埃 ; 在菌落大小方面,5 株大肠杆菌 O57:H7 在科玛嘉平板上均比较大, 大肠杆菌 O57:H7 CMCC(B) 和大肠杆菌 O57:H7 DTB 2002 在梅里埃平板上稍小,HKM 与营养琼脂无明显差异, 均大于 SMAC 表明 HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基与科玛嘉平板在检测灵敏度方面无明显差异, 均优于 CT-SMAC 及梅里埃产品 2.3 人工污染试验显色培养基对人工污染样品的检测结果见表 4 对纯牛奶中添加大肠杆菌 O57:H7 NCTC 2900,

4 卢勉飞等 : 大肠杆菌 O57 显色培养基检测效果的评价 459 表 2 培养基特异性的检测效果 Table 2 The specificity of test strains on media 菌株国内厂家 HKM CT-SMAC Strains BioMerieux CHROMagar E. coli O57:H7 NCTC2900 蓝绿色无色紫红色蓝绿色品红色 E. coli O57:H7 CMCC(B) 蓝绿色无色紫红色蓝绿色品红色 E. coli O57:H7 DTB2002 蓝绿色无色暗蓝 - 紫红暗紫红色品红色 E. coli O57:H7 FSCC(I)490 蓝绿色无色暗蓝 - 紫红紫罗兰边红心蓝 E. coli O57:H7 FSCC(I)4902 蓝绿色无色紫红色蓝绿色品红色亚利桑那沙门氏菌 Salmonella arizona 桃红色桃红色暗蓝色乳红色品红色阴沟肠杆菌 E. cloacae 桃红色黄绿色暗蓝色乳蓝色蓝绿色产气肠杆菌 E. aerogenes 桃红色黄绿色暗蓝色乳红色蓝绿色阪崎肠杆菌 ATCC5329 E. sakazakii ATCC5329 桃红色无色紫红色蓝绿色蓝绿色 E. sakazakii DTB2050 桃红色无色紫红色蓝绿色蓝绿色 E. coli HK705 深蓝色无色紫红色蓝绿色蓝绿色 E. coli ATCC8739 桃红色红色暗蓝色乳蓝色蓝绿色 E. coli CMCC(B)4402 桃红色红色暗蓝色乳红色蓝绿色 E. coli ATCC25922 桃红色红色暗蓝色乳蓝色蓝绿色费氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii 桃红色红色暗蓝色乳红色蓝绿色普通变型杆菌 Proteus vulgaris 无色无色无色无色无色非 O 霍乱弧菌 V. cholerae non O 桃红色无色紫红色黄绿色无色粪肠球菌 Streptococcus faecalis 红色桃红色暗蓝色乳红色蓝绿色金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 红色无色暗蓝色乳红色无色样品 Sample 表 3 E. coli O57:H7 在培养基上的灵敏度试验 Table 3 The sensitivity of E. coli O57:H7 on medium HKM BioMerieux CHROMagar CT-SMAC 营养琼脂 Nutrition agar E. coli O57:H7 NCTC E. coli O57:H7 CMCC(B) E. coli O57:H7 DTB E. coli O57:H7 FSCC(I) 不长不长 E. coli O57:H7 FSCC(I)

5 460 微生物学通报 Microbiol. China 204, Vol.4, No.7 Table 4 表 4 人工污染样品中的 E. coli O57:H7 检测 The detection of E. coli O57:H7 in artificeially contaminated samples 样品国内厂家 HKM BioMerieux CHROMagar Sample 纯牛奶 Pure milk 桃红色乳蓝色暗蓝色蓝绿色 E. coli O57:H7 FSCC(I)490 蓝绿色暗蓝蓝紫红边红心蓝 Pure milk +20 CFU E. coli O57:H7 FSCC(I)490 蓝绿色暗蓝蓝紫红边红心蓝 Pure milk +5 CFU E. coli O57:H7 FSCC(I)490 蓝绿色乳蓝色蓝紫红边红心蓝 E. coli O57:H7 NCTC2900 蓝绿色蓝绿色紫红色品红色 Pure milk +90 CFU E. coli O57:H7 NCTC2900 Pure milk +0 CFU E. coli O57:H7 NCTC2900 蓝绿色蓝绿色紫红色品红色蓝绿色蓝绿色紫红色品红色 4 种显色培养基均能达到 0 CFU 的检出限 ; 对纯牛奶中添加大肠杆菌 O57:H7 FSCC (I) 490, 在添加较高浓度的菌量 (20 CFU) 情况下 4 种显色培养基均能检出, 但在添加较低浓度的菌量 (5 CFU) 情况下,HKM 与国内厂家和科玛嘉均能检出, 而梅里埃不能检出, 可能与大肠杆菌 O57:H7 FSCC (I) 490 在梅里埃显色平板上的特征性不强有关表明 HKM 大肠杆菌 O57 显色培养基与科玛嘉和国内厂家平板对模拟样品的检测效果相当, 优于梅里埃产品 2.4 天然污染样品试验如表 5 所示, 在检测的 30 份肉类样品中, HKM 梅里埃和科玛嘉以及国内厂家平板上的检出率分别为 26.67% 33.33% 26.67% 和 26.67%, 但经生化鉴定确证后的符合率分别为 00% 80% 00% 和 00% 结果表明,HKM 科玛嘉以及国内厂家对的检出率及符合率均没有显著差异, 可以达到相同的检测限, 且均优于梅里埃产品样品 ( 数量 ) Sample (number) 牛肉 (5) Beef (5) 鸡肉 (8) Chicken (8) 猪肉 (7) Pig (7) 总计 Total 检出率 Detection rate (%) 符合率 Accord rate (%) Suspected 表 5 天然污染样品中的 E. coli O57:H7 检测 Table 5 The detetion of E. coli O57:H7 in natural samples HKM BioMerieux CHROMagar Suspected Suspected 国内厂家 Suspecte

6 卢勉飞等 : 大肠杆菌 O57 显色培养基检测效果的评价 46 3 讨论显色培养基是根据酶的特征设计的对微生物进行快速检测的一种分离培养基, 基本原理是 : 在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物, 该底物为人工合成, 由产色基团和微生物可代谢物质组成, 通常为无色, 但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色, 直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定, 具有快速简便和经济的特点 [3-7] 本实验的结果表明, 显色培养基具有较高的灵敏度和特异性, 与传统培养基相比较, 它可以大大减少由假阳性菌所产生的, 减少一系列后续的生化鉴定, 从而节省大量的人力和物力, 比较适用于大量样本的检验, 在 24 h 内可得到粗筛阳性结果 [3-7] 本文作者从事显色培养基多年的研究发现, 本研究也不例外, 显色培养基对酶的特异性是相对的, 正如 97% 的大肠埃希氏菌含有 β- 葡萄糖醛酸酶, 约 0% 的沙门氏菌属中也含有此酶一样, 某些肠毒性大肠埃希氏菌 (ETEC) 和致泻性大肠埃希氏菌 (EPEC) 与大肠杆菌 O57 相似, 都缺少 β- 葡萄糖醛酸酶, 导致这两种菌中的某些株在大肠杆菌 O57 显色培养基中表现出假阳性, 故显色培养基也具有一定的缺点 [4-5,8] 但由于本研究的配方中还含有一些抑菌剂, 可以抑制样品中杂菌 ( 如革兰氏阳性球菌变型杆菌其它非 O57 的大肠杆菌等 ) 的生长, 而且配方中还添加了其它细菌对应的酶的底物 ( 与梅里埃国内厂家原理不完全相同 ) 与生化物质如碳水化合物和酸碱指示剂中性红 ( 与科玛嘉同类产品原理不完全相同 ), 可以使具有与大肠杆菌 O57 相同特异性酶的其它细菌 ( 如 E. coli HK705 和阪崎肠杆菌等 ) 呈现出其它添加的底物或由于酸碱度变化而指示的色泽, 从而与大肠杆菌 O57:H7 相区分通过这些措施最大程度减低了显色培养基的假阳性率大肠杆菌 O57:H7 除具有特殊的血清型外, 还具有迟缓发酵或不发酵山梨醇的生化特征, 可作为鉴定本菌的重要依据但目前已经发现大肠杆菌 O57:H7 的一些菌株可发生变异, 变成发酵山梨醇的菌株 [6], 同样导致沿用 CT-SMAC 时出现假阴性的结果故检验中会出现假阳性及假阴性现象, 但这是任何选择性培养基都无法避免的问题与普通选择性培养基比较, 显色培养基的假阳性假阴性的机率相对要低得多由于本实验所涉及的样品种类和数量有限, 实际样品中可能还会出现各种各样不可预知的情况, 所以要评价大肠杆菌 O57 显色培养基的应用效果, 还需要大量样本加以验证从上述实验的灵敏度特异性比对结果来看, 不同厂家的同类培养基其灵敏度特异性也有高低不同, 主要与配方中所添加的混合酶所对应的底物及生化体系有关, 同时也与配方体系中所添加的不同抑菌剂及其浓度有关搭配得当, 可以提高培养基的灵敏度和特异性 ; 搭配不当, 可能会引起负面的效应, 如抑菌剂浓度过高导致目标菌生长受抑制等所以, 要进一步提高大肠杆菌 O57 显色培养基的特异性和灵敏度, 还需对这些显色培养基进行进一步改良, 或是选择更优的前处理增菌以及其它协助的办法, 如免疫磁珠捕获法等参考文献 [] Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens[j]. Emerging Infectious Disease, 20, 7(): 7-5. [2] Slutsker L, Ries AA, Greene KD, et al. Escherichia coli O57:H7 diarrhea in the United States: clinical and epidemiologic features[j]. Annals of Internal Medicine, 997, 26(7): [3] Gerber A, Karch H, Allerberger F, et al. Clinical course and the role of shiga toxinproducing Escherichia coli infection in the hemolytic-uremic syndrome in pediatric patients in Germany and Austria: a prospective study[j]. Journal of Infectious Diseases, 2002, 86(4): [4] Wagner M, Allerberger F, Manafi M, et al. Characterization of pathogenic Escherichia coli isolated from humans in Austria: phenotypes, toxin gene types and epidemiology[j]. Journal of Veterinary Medicine Series B, 2004, 5(6): [5] 孟宪梅. 食品的大肠杆菌 O57 污染检测及预防控制 [J]. 肉品卫生, 2004(): [6] 遇晓杰, 姜晓明, 袁玉兰, 等. 从市售蔬菜和熟肉制品

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Microsoft Word tb 卢勉飞.doc 微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn MAY 20, 2010, 37(5): 701 707 2010 by Institute of Microbiology, CAS 研究报告一种副溶血性弧菌显色培养基的应用卢勉飞 1 蔡芷荷 1 吴清平 2* 叶青华 1 (1. 广东环凯微生物科技有限公司广东广州 510070) (2. 广东省微生物研究所广东广州