4 基于比较基因组学的生物信息学方法, 针对鼠伤寒沙门氏菌 肠炎沙门氏菌等主要食源性沙门氏菌血清型, 发掘不同血清型的特异基因片段作为分子靶点, 通过特异性强的 PCR 检测方法, 建立能够用于沙门氏菌快速血清分型的分子方法 本项目获得国家授权 5 项,2 项国家实用新型专利, 申请国家 2 项 ;

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1 附件 年度全国质检系统科研成果评定申报公示表 成果名称 食源性致病微生物的快速高通量检测技术研究 推荐单位成果来源 ( 具体计划 基金的名称和编号 ) 浙江出入境检验检疫局国家质检总局科技计划项目 食源性病原微生物的高通量快速检测方法研究 (2007IK145) 国家质检总局科技计划项目 活菌内标的研制及其在单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测中的应用 (2011IK147) 近年来, 全球食品安全恶性事件频发, 食源性疾病发生率居高不下, 目前, 对食源性疾病的预防与控制已经引起了各国广泛关注, 食源性致病菌检测技术是食源性疾病预防与控制的关健技术环节 本项目由上述两个课题组成, 均由同一科研团队完成, 通过团队的共同努力, 从 2007 年到 2017 年的 10 年间, 用基因芯片技术 活菌内标 PCR 和环介导等温扩增技术 (LAMP) 多技术手段构建了全方位立体微生物检测体系, 满足了实际工作中高通量初筛 快速检测及血清分型的需求 经反复验证应用, 证明该检测平台通过多种技术手段, 建立了快速 灵敏 准确 高通量的食源性致病菌检测技术体系, 从而为进出口检验检疫 食源性致病菌预警系统的建立提供方法学依据 主要研究成果如下 : 1 采用可见光基因芯片技术, 对 12 种重要食源性致病菌 ( 志贺氏菌 耶 成果简介 尔森氏菌 沙门氏菌 腊样芽孢杆菌 空肠弯曲菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特菌 布鲁氏菌 变形杆菌 肠出血性大肠杆菌 O157:H7) 进行高通量平行检测 2 采用自主发掘的内控标准序列, 构建重组质粒, 再通过同源重组将该内标序列整合到单核细胞增生李斯特菌的染色体上, 构建活菌内控标准物质, 以全程指示检测过程 ( 从取样到 PCR 扩增全过程 ) 中出现的假阴性问题 建立基于活菌内控标准物质的单核细胞增生李斯特菌荧光定量 PCR 检测技术, 并开发相关检测产品 3 采用利用生物信息学和比较基因组学, 筛选到肠杆菌科致病菌 ( 包括志贺氏菌 耶尔森氏菌 沙门氏菌 变形杆菌 肠杆菌属 克雷伯氏菌属等肠道致病微生物 ) 的共有基因序列, 经 PCR 方法验证, 确定了后续用于环介导等温扩增技术 (LAMP) 的检测靶点, 根据靶点设计 3 对 LAMP 引物, 成功建立了肠杆菌科 LAMP 快速检测体系

2 4 基于比较基因组学的生物信息学方法, 针对鼠伤寒沙门氏菌 肠炎沙门氏菌等主要食源性沙门氏菌血清型, 发掘不同血清型的特异基因片段作为分子靶点, 通过特异性强的 PCR 检测方法, 建立能够用于沙门氏菌快速血清分型的分子方法 本项目获得国家授权 5 项,2 项国家实用新型专利, 申请国家 2 项 ; 制定国家标准 1 项 检验检疫行业标准 2 项 ; 发表科技论文 14 篇, 其中 SCI 论文 5 篇 活菌内标的研制及其在单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测中的应用 的研究成果达到国际先进水平 创新点 1: 建立了食源性致病菌的高通量快速检测方法研究 (1) 根据细菌 16S rdna 和 23S rdna 基因的保守区域设计通用引物, 利用两重 PCR 简化实验操作, 节约检测时间, 并能同时检测 12 种食源性致病菌 (( 志贺氏菌 耶尔森氏菌 沙门氏菌 腊样芽孢杆菌 空肠弯曲菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特菌 布鲁氏菌 变形杆菌 肠出血性大肠杆菌 O157:H7), 实现致病菌的快速高通量检测目标 采用可见光基因芯片技术, 可通过肉眼直接观察结果, 无需昂贵分析仪器, 且试剂费用低廉, 非常利于在基层机构推广使用 (2) 采用本项目中的可见光基因芯片检测方法与国标法 ( 常规生化培养方法 ) 进行比较,228 例实际样本检测结果显示, 两种方法结果的符合率达 96.5%, 且并无假阴性结果出现,10 例模拟样本的检测符合率达 100%, 数据表明本项目所建立的基因芯片方法完全可以对食品中的致病菌进行准确检测 (3) 检测时间 : 细菌生化鉴定是病原菌鉴定和诊断的金标准, 但是在相同条件下很难同时培养多种食源性致病菌, 而且生化方法至少需要 3 天才能确定致病菌类型, 而本基因芯片技术的整个操作过程仅需要 3 个小时左右, 大大节省了人力物力 (4) 成果输出 : 完成课题 1 项, 授权实用新型专利 2 项, 核心期刊论文 5 篇 创新点 2: 研制了活菌内标并应用于单核细胞增生李斯特菌的 PCR 定量检测 (1) 通过同源重组技术将人工合成的内控标准序列整合到单核细胞增生李斯特菌染色体上, 构建活菌内控标准物质 ( 以下简称活菌内标 ), 检测过程中活菌内标与目标菌共同经历具体收集 DNA 提取和 PCR 扩增过程, 通过活菌内标来反应试验中目标菌的 DNA 提取效率及 PCR 扩增效率, 从而实现目标菌的准确定量 (2) 活菌内标 PCR 方法弥补了现有扩增内标的不足, 提供了一种有效可广泛应用于微生物荧光定量 PCR 检测的技术路线 活菌内标和待检样品共同

3 经历从增菌培养开始的检测全过程, 从取样开始就监测可能出现的假阴性结果, 监测增菌培养过程中影响目标菌生长的抑制因子, 实现检测过程中假阴性现象的全程监控 (3) 有了活菌内标作为指示假阴性的保证, 在实际检测过程中在保证检测可靠性的前提下, 可大大节约细菌增菌时间, 无需如传统方法一样动辄增菌 h, 实现快速检测目标 (4) 成果输出 : 完成课题 1 项, 授权 3 项, 完成行业标准 1 项, 核心期刊论文 1 篇,SCI 论文 1 篇 创新点 3: 建立了肠杆菌科的 LAMP 快速检测体系 (1) 肠杆菌科现已包括了大肠菌群中的细菌, 也包括了除大肠菌群外但有致病性的沙门氏菌属 志贺氏菌属 变形杆菌属 肠杆菌属和耶尔森菌属等菌属, 这几类菌有明显的致病性, 常引起食源性感染疾病, 所以检测肠杆菌科细菌比单纯检测大肠菌群更能真实地反映出食品加工中潜在的污染状况 目前食源性致病菌的 LAMP 检测主要集中在各个菌属或者是特定的血清型, 缺乏针对整个肠杆菌的检测基因 本项目利用生物信息学和比较基因组学, 筛选到了肠杆菌科致病菌的共有基因序列, 并以此序列设计 3 对引物, 建立并优化了肠杆菌科 LAMP 快速检测体系 (2) 成果输出 : 申请 2 项, 完成行业标准 1 项, 核心期刊论文 3 篇 创新点 4: 建立沙门氏菌快速血清分型的分子方法 (1) 基于比较基因组学的生物信息学方法, 针对鼠伤寒 肠炎沙门氏菌等主要食源性沙门氏菌血清型, 发掘不同血清型特异基因片段作为分子靶点, 建立特异性强的 PCR 检测方法, 建立能够用于沙门氏菌快速血清分型的分子方法 与通常需要 2-5 天传统血清学鉴定相比, 该方法利于对该菌进行及时溯源和实时监控 (2) 成果输出 : 授权 2 项, 核心期刊论文 3 篇,SCI 论文 2 篇 项目建立的微生物快速高通量检测技术适用于检验检疫 食品安全检测 细菌分类学研究和临床诊断的初筛辅助工具, 适用大样本量检测 具有我国 自主知识产权, 部分成果已获得国家专利, 方法特异性强, 灵敏度高, 简便, 成果推广 应用情况 适于推广应用 1. 在检验检疫系统和食品检测机构中广泛应用 项目组完成了 3 项标准 (2 项 SN 标准 1 项国标 ),7 项专利技术, 得到 检验检疫系统及相关单位的广泛应用 该成果 标准已在多家单位推广应用, 应用单位 ( 包括中国检科院 北京 张家港 河南 云南 宁波 舟山等检

4 验检疫局, 绿城农科检测技术有限公司, 详见应用证明 ) 一致认为该成果 标准作为食源性致病菌快速检测的一种快速 灵敏 准确 高通量的模式, 推荐进一步推广应用 2. 知识产权多项本项目成果转化为自主知识产权, 申请 9 项, 其中授权 7 项, 其余 2 项已公示 3. 为进出口企业保驾护航项目组成员积极为出口企业提供转食品致病微生物检测技术, 帮助提高食品生产企业的技术水平, 同时可以替代进口产品并节约成本, 年, 浙江银河食品有限公司和浙江北极品水产有限公司共新增销售额 万元, 新增利润 669 万元, 新增税收 512 万元, 同时, 大大节省了人力, 物力及检测时间, 提高了检出率, 有力保障了消费者的健康和安全, 创造出较大的经济和社会效益 4. 大力提升实验室食品致病微生物检测能力浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心微生物实验室已开展 73 项微生项目检测, 产品种类涵盖食品 饲料 饮用水 水质 化妆品 一次性卫生用品和公共卫生品等七大类, 近三年扩项项目达 40 余项, 参加各项能力验证 14 项, 均获得满意结果 5. 项目培养高级工程师 2 名 曾获科技 奖励情况 无 1. 已授权专利 专利名称授权号类别发明人授权时间 专利目录 ( 已授权 或已公示 ) 基于基因置换技术的活菌内标的制备方法基于 DNA 随机改组技术的扩增内标制备方法 ZL ZL 史贤明 龙飞 施春雷 ; 朱欣娜 张忠明 史贤明 龙飞 施春雷 张忠明 鼠伤寒沙门氏菌 PCR 检测方法及其中的核酸和引物对 ZL 史贤明 刘斌 何晓华 施春雷 陈靖

5 食源性致病菌多 重扩增内标序列 及其制备方法 一种细菌培养示气管 一种菌块接种器 鼠伤寒沙门氏菌 及其血清变种的 多重 PCR 检测 方法 ZL ZL ZL ZL 实用新型 专利 实用新型专利 史贤明, 何晓华, 刘斌, 施春雷 李可 朱晓雨 顿玉慧 张瑾 程洁 方莹李可 方莹 黎昊雁 朱晓 雨 顿玉慧 程洁 史贤明 刘斌 何晓华 施春雷 已公示专利 专利名称公示号类别发明人公示时间 检测肠杆菌科食源性致病菌的 LAMP 方法 核酸及引物对用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量 PCR 方法及引物对 CN CN 李可 顿玉慧 方莹 杨兰花 陆金虎 卢力 李可 张晓峰 张明哲 朱晓雨 方莹 其他知识 产权目录 主要完成 人 排名 :1 姓名 : 李可技术职称 : 高级工程师工作单位 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心对本项目贡献 : 1 本人对创新点 和 4 均做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 55% 3 对创新点 1, 参加可见光基因芯片技术的研发 ; 对创新点 2, 主持完成单增李斯特菌活菌内标 PCR 课题, 主持输出两项行业标准 ; 对创新点 3, 参与建立肠杆菌科的 LAMP 检测方法 ; 对创新点 4, 建立沙门氏菌快速血清分型的分子方法, 包括多重 PCR 方法和 HRM( 高分辨率熔解曲线 ) 方法 授权专利 2 项, 申请专利 2 项, 发表核心期刊文章 4 篇 曾获科技奖励情况 : 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 浙江海港水域肠道致病菌的调查研究 ), 排名第三 ;

6 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 食品中四环素族胶体金免疫检测技术研究 ), 排名第二 年获浙江局 优秀科技论文奖 一等奖 二等奖和三等奖各 1 项 排名 :2 姓名 : 黎昊雁技术职称 : 高级工程师 主要完成人主要完成人 工作单位 : 浙江出入境检验检疫局对本项目贡献 : 1 本人对创新点 均做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 40% 3 对创新点 1, 主持可见光基因芯片技术的研发, 对 12 种重要食源性致病菌进行高通量平行检测 ; 对创新点 2, 参与了单增李斯特菌的风险评估和微生物检测质控标样的评定 ; 对创新点 3, 研究了超分支滚环扩增法检测病毒的方法 曾获科技奖励情况 : 年获浙江局 科技兴检奖 一等奖 ( 蜂王浆中有害物质残留检测方法研究 安全性评估及应对措施研究 ), 排名第三 ; 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 植物源产品及其深加工食品中外源基因检测方法的研究 ), 排名第四 排名 :3 姓名 : 施春雷技术职称 : 教授工作单位 : 上海交通大学农业与生物学院对本项目贡献 : 1 本人对创新点 2 4 均做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 40% 3 对创新点 2, 参与单增李斯特菌活菌内标的研制和活菌内标 PCR 方法的建立 ; 对创新点 4, 参与沙门氏菌快速血清分型的分子方法建立 曾获科技奖励情况 : 年获国家质检总局 科技兴检奖 二等奖 ( 犬猫科宠物 12 种重要致病微生物快速检测技术的开发与应用 ), 排名第七 ; 年获上海市浦东新区科技进步二等奖 ( 食品掺假及污染监测体系建立与风险评估 ), 排名第三 排名 :4 姓名 : 张晓峰 主要完成 人 技术职称 : 研究员工作单位 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心对本项目贡献 : 1 本人对创新点 1 4 做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 30%

7 3 对创新点 1, 参与可见光基因芯片技术的研发 ; 对创新点 4, 参与沙门氏菌快速血清分型的分子方法建立 曾获科技奖励情况 : 1 获国家质检总局科技兴检一等奖 1 项, 二等奖 1 项, 三等奖 1 项 ; 2 获浙江省科学技术奖二等奖 2 项, 三等奖 1 项 排名 :5 姓名 : 刘斌技术职称 : 副教授 主要完成 人 工作单位 : 西北农林科技大学食品科学与工程学院对本项目贡献 : 1 本人对创新点 1 4 做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 30% 3 对创新点 1, 参与可见光基因芯片技术的研发 ; 对创新点 4, 参与沙门氏菌 快速血清分型的分子方法建立 曾获科技奖励情况 : 排名 :6 姓名 : 方莹 技术职称 : 高级工程师 主要完成 人 工作单位 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心对本项目贡献 : 1 本人对创新点 2 4 做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 25% 3 对创新点 2, 参与单增李斯特菌活菌内标的研制 ; 对创新点 4, 参与沙门氏菌快速血清分型的分子方法建立 曾获科技奖励情况 : 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 食品中四环素族胶体金免疫检测技术研究 ), 排名第一

8 排名 :7 姓名 : 顿玉慧技术职称 : 高级工程师工作单位 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心对本项目贡献 : 1 本人对创新点 2 3 做出贡献 2 本研发投入工作量占本人工作量的 20% 主要完成 3 对创新点 2, 参与单增李斯特菌活菌内标的研制 ; 对创新点 3, 建立肠杆菌人科的 LAMP 检测方法曾获科技奖励情况 : 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 浙江海港水域肠道致病菌的调查研究 ), 排名第一 ; 年获浙江局 科技兴检奖 三等奖 ( 食品中四环素族胶体金免疫检测技术研究 ), 排名第三 ; 年获浙江局 科技兴检 三等奖 ( 温州口岸蝇类携带致病菌情况的研究 ), 排名第四 排名 :1 单位名称 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心对本项目科技创新和推广应用情况的贡献 : 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心作为本项目的依托单位, 组织了主要完成本项目课题的申报 研究进度的监督及组织科技成果鉴定 ; 同时, 为本项目的单位实施提供了良好的实验条件和基金资助 作为依托单位共输出国家标准 1 项, 行业标准 3 项 ; 授权国家 5 项, 实用新型专利 2 项 项目成果在检验检疫系统 第三方实验室 食品生产企业等得到了广泛应用, 经济效益和社会效益显著 排名 :2 单位名称 : 上海交通大学主要完成对本项目科技创新和推广应用情况的贡献 : 单位针对食品中的致病菌, 率先研制具有我国自主知识产权的活菌内标荧光定量 PCR 检测技术及产品, 成功应用于单核细胞增生李斯特菌的准确检测 ; 参与沙门氏菌快速血清分型的分子方法建立 排名 :3 单位名称 : 西北农林科技大学主要完成对本项目科技创新和推广应用情况的贡献 : 单位协助浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心建立了食源性致病菌的 LMAP 检测方法, 并在生物信息学和引物设计验证方面提供了技术支持 注 : 项目公示表请转为 PDF 格式 表格内容须与推荐书内容一致

目录 附录 A 实验室结果统计汇总和评价... 1 附录 A1 菌落总数项目结果汇总和统计评价... 1 附录 A2 大肠菌群项目结果汇总和统计评价... 5 附录 A3 粪大肠菌群项目结果汇总和统计评价... 9 附录 A4 大肠杆菌项目结果汇总和统计评价 附录 A5 沙门氏菌项目结果

目录 附录 A 实验室结果统计汇总和评价... 1 附录 A1 菌落总数项目结果汇总和统计评价... 1 附录 A2 大肠菌群项目结果汇总和统计评价... 5 附录 A3 粪大肠菌群项目结果汇总和统计评价... 9 附录 A4 大肠杆菌项目结果汇总和统计评价 附录 A5 沙门氏菌项目结果 中国检验检疫科学研究院测试评价中心 CNAS PT0026 ACAS-PT030 食品微生物学能力验证计划 中期报告 2014 年 10 月 13 日 本报告是中国检科院测试评价中心 (ACAS) 组织的 ACAS-PT030 食品微生物能力验证计划的中期报告 该中期报告供实验室参考, 结果以最终的结果报告单和技术报告为准 本能力验证计划中定量检测项目按照 ISO13528 标准, 采用稳健统计技术,

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