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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (9): 肿瘤靶向性沙门氏菌 VNP20009 抗肿瘤作用及其对肿瘤免疫微环境的影响 * 韩雨衡, 来兴欢, 乐子薇, 华子春 ( 南京大学生命科学学院, 医药生物技术国家重点实验室, 江苏南京 ) 摘要 : 沙门氏菌是一类兼性厌氧革兰阴性菌, 能够靶向肿瘤组织并生长繁殖, 表现出显著的抗肿瘤效果减毒沙门氏菌菌株 VNP20009 是在鼠伤寒沙门氏菌基础上敲除毒性基因得到, 有治疗效果好毒副作用低的优势肿瘤内免疫微环境是免疫抑制的, 使免疫细胞难以杀伤肿瘤细胞, 而 VNP20009 的抗肿瘤效应之一是通过提高机体的免疫反应水平以攻击肿瘤本研究使用 VNP20009 菌株治疗 B16F10 小鼠皮下黑色素瘤模型, 以探究 VNP20009 治疗肿瘤的机制结果发现, VNP20009 可以有效抑制肿瘤生长, 促使肿瘤细胞坏死与凋亡进一步研究发现, VNP20009 能够通过提高肿瘤内的免疫反应水平进而提高肿瘤内 CD8 + T 细胞与 CD11b + 单核巨噬细胞的比例, 诱导其产生肿瘤坏死因子 -α (TNF-α) 与干扰素 -γ (IFN-γ), 破坏肿瘤内免疫逃逸的环境, 产生抗肿瘤效果关键词 : 沙门氏菌 ; 肿瘤微环境 ; 黑色素瘤 ; 肿瘤浸润淋巴细胞 ; 单核细胞 ; T 淋巴细胞中图分类号 : R965 文献标识码 : A 文章编号 : (2016) Anti-tumor effect and impact on tumor immune microenvironment of tumor-targeted Salmonella VNP20009 HAN Yu-heng, LAI Xing-huan, LE Zi-wei, HUA Zi-chun * (The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing , China ) Abstract: Salmonella is a gram-negative bacterium that has an ability of tumor-targeting growth and proliferation. Attenuated Salmonella VNP20009 is a virulence genes-knockout bacterial strain based on Salmonella typhimurium, and it has an advantage of good therapeutic effect and low toxicity. One of the mechanisms of anti-tumor effect of VNP20009 is the induction of inflammatory reaction within tumor tissues. We used B16F10 melanoma model to investigate the mechanism of the anti-tumor effect of VNP VNP20009 treatment effectively inhibited tumor growth and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells. VNP20009 increased the accumulation or infiltration of CD8 + T cells and CD11b + monocytes within tumor tissue by raising the level of immune response and thus, induce the production of tumor necrosis factor- α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) to kill tumor cells by breaking the immuno-evasion barrier in the tumor microenvironment. Key words: Salmonella; tumor microenvironment; melanoma; tumor-infiltrating lymphocyte; monocyte; T-lymphocyte 沙门氏菌是一类兼性厌氧革兰阴性菌, 无芽孢收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 高等学校博士学科点专项科研基金 ( 优先发展领域 ) 资助项目 ( ). * 通讯作者 Tel / Fax: , huazc@nju.edu.cn DOI: /j 有菌毛与鞭毛无荚膜, 一般生存于动物肠道中沙门氏菌能够特异性地在实体瘤组织的乏氧区内生存繁殖, 从而引发免疫反应与肿瘤细胞增殖减慢坏死凋亡等一系列抗肿瘤效应为了降低其毒副作用, 研究人员敲除了 puri 和 msbb 基因得到减毒沙门氏菌菌株 VNP20009, 降低了毒性, 提高了肿瘤靶向性与肿

2 1418 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (9): 瘤治疗效果 [1 6] 而使用 VNP20009 作为药物传递载体, 表达外源药用蛋白与干扰 RNA 等方法, 开展减毒沙门氏菌与药用蛋白干扰 RNA 的联合治疗, 能够表现出更好的抗肿瘤疗效 [7 10] 肿瘤内呈免疫逃逸的微环境肿瘤内部的低 ph 乏氧与肿瘤细胞分泌的抗炎因子共同构成了免疫抑制状态的肿瘤内免疫微环境, 使肿瘤内部的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力下降, 免疫系统不能有效呈递肿瘤抗原, 少量激活的免疫细胞在肿瘤微环境中活性也受到严重抑制 [11 13] 据推测 VNP20009 治疗肿瘤的机制之一可能是通过提高机体的免疫反应水平, 进而激发免疫系统消除肿瘤细胞, 该机制与肿瘤免疫微环境的改变息息相关为此, 本文通过观察 VNP20009 对小鼠黑色素瘤模型的治疗效果与瘤内浸润免疫细胞肿瘤组织细胞因子的变化, 探讨 VNP20009 治疗肿瘤的效果, 以及 VNP20009 对肿瘤免疫微环境的影响材料与方法实验材料减毒沙门氏菌 VNP20009 菌株 B16F10 黑色素瘤细胞购自 ATCC); 6~8 周龄雌性 C57/BL6 小鼠购自南京大学模式动物研究所实验动物合格证号 : ; 许可证号 : SCXK ( 苏 ) 实验试剂 DMEM 培养液胎牛血清 (FBS) 青霉素 / 链霉素溶液购自 Thermo Inventrogen 公司 ; Percoll 淋巴细胞分离液购自美国 GE 公司 ; HE 染色试剂盒购自南京建成生物科技有限公司 ; TUNEL 染色试剂盒购自诺唯赞公司 ; Fc 受体阻断剂 purified rat anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, Clone 2.4G2) 购自 BD 公司 ; 流式抗体 APC rat anti-mouse CD4 anti-cd4 (Clone RM4-5) FITC rat anti-mouse CD8a (Clone ) PE rat anti-mouse CD11b (Clone M1/70) 购自 BD 公司 ; 小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 (Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit) 与 IFN-γ ELISA 试剂盒 (Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit) 购自 R&D 公司磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) 购自维森特生物技术 ( 南京 ) 有限公司实验仪器台式常温离心机台式冷冻离心机购自 Eppendorf 公司 ; 荧光显微镜购自蔡司公司 ; 流式细胞仪购自 BD 公司 ; 多功能酶标仪购自瑞士 TECAN 公司 B16F10 小鼠黑色素瘤细胞的培养使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 完全培养基, 加入 100 u ml 1 青霉素与 100 u ml 1 链霉素, 置培养箱中 37 5% CO 2 中培养 VNP20009 菌株治疗 F10B16 黑色素瘤小鼠皮下原位肿瘤模型将快速生长的 F10B16 黑色素瘤细胞采用胰酶消化, PBS 洗 2 次后调细胞数为个 /ml, 在预先刮过毛发的小鼠右腋下皮下接种肿瘤细胞悬液 100 μl, 每只小鼠接种 F10B16 细胞个待小鼠肿瘤体积长至 150 mm 3 时, 将预先复苏好的 VNP20009 菌株培养到对数生长期, 用 PBS 洗涤 2 次后测量光密度 (OD), 根据 OD 值 (1 OD 的 VNP20009 = cfu ml 1 ) 稀释菌液至 cfu ml 1, 每只小鼠腹腔注射 100 μl, 即每只小鼠接种个细菌接种细菌后每两天使用游标卡尺测量肿瘤大小, 待 PBS 对照组肿瘤体积平均达到 6 000~ mm 3 时停止实验 HE 染色观察肿瘤组织病理切片将肿瘤组织完整取出, 用 4% 多聚甲醛溶液固定至少 24 h, 石蜡包埋并切片切片经 HE 染色后光镜下观察每张切片随机挑选 5 个视野用于统计坏死凋亡区面积, 取其平均值视为该切片的坏死凋亡区百分比, 以每张切片为单位进行统计 TUNEL 法染色观察肿瘤组织细胞凋亡情况石蜡切片经脱蜡复水后, 用蛋白酶 K 溶液孵育切片 20 min, PBS 洗 3 遍后, 使用 TUNEL 凋亡检测试剂盒进行切片 TUNEL 染色, 荧光显微镜下观察肿瘤组织细胞凋亡情况减毒沙门氏菌 VNP20009 在荷瘤小鼠体内的组织分布分析将 VNP20009 菌株复苏后, 转接到新鲜 LB 中培养至 OD = 0.8, r min 1 离心 5 min 收集细菌, 用无菌 PBS 洗涤 2 次取肿瘤体积为 150 mm 3 左右的 B16F10 黑色素瘤模型鼠, 每只小鼠腹腔注射细菌 cfu, 对照组注射 PBS, 正常饲养注射 3 天后处死小鼠, 无菌条件下取出小鼠肿瘤心肝脾肺和肾称重后用预冷的组织匀浆机 60 Hz 匀浆 180 s, 梯度稀释后涂 LB 平板, 37 培养 12~16 h 后计算菌落数瘤内免疫细胞亚群的分析肿瘤组织剪碎后放于含 300 U ml 1 胶原酶与 50 U ml 1 的含 20% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中, 消化 1.5 h 每 30 min 吹打消化液, 将大块组织吹散消化完全时将消化液过 75 μm 细胞筛以去除杂质, 于 g 离心 10 min 收集沉淀沉淀经 36% 与 63% percoll 密度梯度离心纯化, 收集两层 percoll 中间的免疫细胞层洗掉 percoll 后即为瘤内浸润免疫细胞细胞经 Fc

韩雨衡等: 肿瘤靶向性沙门氏菌 VNP20009 抗肿瘤作用及其对肿瘤免疫微环境的影响 1419 Block 工作液封闭后, 冰上孵育抗体 30 min, 采用流式机分析 (Fc Block 工作液: 含 10% FBS, 1 μg ml 1 Fc Block 的

IFN-γ 的含量数据处理采用 GraphPad 6 软件进行统计学分析, 组间数据的比较采用 t 检验, 以 P < 0.

PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group.

对照组显著减慢 (图 1) 通过肿瘤组织 HE 染色的病理切片观察肿瘤内部的情况 (图 2) 以及 TUNEL 染色观察肿瘤组织细胞坏死与凋亡情况 (图 3), 发现细菌治疗组的肿瘤组织内部的坏死凋亡区面积及坏死与凋亡比例均出现增加, 说明

stained by DAPI. n = 8, x ± s. *P < 0.05 部的浓度达到平均 8 108 cfu g 1, 而在脾肝中仅能达到 3.8 105 和 2.

3 韩雨衡等: 肿瘤靶向性沙门氏菌 VNP20009 抗肿瘤作用及其对肿瘤免疫微环境的影响 1419 Block 工作液封闭后, 冰上孵育抗体 30 min, 采用流式机分析 (Fc Block 工作液: 含 10% FBS, 1 μg ml 1 Fc Block 的 PBS) 肿瘤内细胞因子的测定剪碎肿瘤组织, 加入细胞裂解液后匀浆, 冰上放置 1 h 将组织匀浆混合物于 g 离心 10 min 收集上清, 并用 BCA 法测定上清中的蛋白浓度最后使用 ELISA 法测定上清中 TNF-α 与 IFN-γ 的含量数据处理采用 GraphPad 6 软件进行统计学分析, 组间数据的比较采用 t 检验, 以 P < 0.05 为差异有统计学意义结果 1 VNP20009 菌株的肿瘤治疗效果 Figure 2 Histochemical analysis of cell death by HE staining (A). PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group. The necrosis area is significantly increased in tumors treated with VNP20009, compared with the untreated control group (B). n = 5, x ± s. *P < 0.05 在 B16F10 黑色素瘤细胞制作的皮下瘤小鼠模型中, 通过肿瘤体积曲线与肿瘤重量来评价肿瘤治疗的效果在肿瘤治疗实验中, VNP20009 对肿瘤有明显治疗效果, 从肿瘤体积曲线与肿瘤重量上都可以发现注射 VNP20009 组的肿瘤生长较 PBS 对照组显著减慢 (图 1) 通过肿瘤组织 HE 染色的病理切片观察肿瘤内部的情况 (图 2) 以及 TUNEL 染色观察肿瘤组织细胞坏死与凋亡情况 (图 3), 发现细菌治疗组的肿瘤组织内部的坏死凋亡区面积及坏死与凋亡比例均出现增加, 说明 VNP20009 能够导致肿瘤细胞的坏死与凋亡 Figure 3 Apoptosis of tumor cells were stained by TUNEL (A) and quantitative analyses (B), cell nucleus was stained by DAPI. PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group. n = 8, x ± s. *P < 0.05 部的浓度达到平均 cfu g 1, 而在脾肝中仅能达到和 cfu g 1, 在心肾与肺中几乎没有细菌出现在肿瘤中的菌落密度是正常组织中最高脾脏的平均倍以上, 说明 VNP20009 有很好的 Figure 1 Anti-tumor efficacy of VNP20009 on B16F10 tumor model. PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group. A: VNP20009 treatment markedly inhibited melanoma growth; B: Tumor weight is reduced after treatment of VNP20009; C: Tumors from control and treatment groups. n = 10, x ± s. ** P < 0.01 肿瘤靶向性 (图 4) 3 VNP20009 对瘤内浸润淋巴细胞的影响肿瘤内部浸润淋巴细胞是机体抗肿瘤的主要因素之一, 通过观察肿瘤内部浸润淋巴细胞的亚群比例, 可以了解肿瘤内部免疫细胞对肿瘤细胞杀伤的程度实验数据显示, 注射过沙门氏菌的小鼠肿瘤内 2 VNP20009 能在肿瘤组织内靶向性生长部的 CD4+ CD8+T 细胞与 CD11b+单核细胞数量明显 VNP20009 菌株能够靶向肿瘤组织, 在肿瘤组织提高, 其中 CD4+T 细胞 CD8+T 细胞和 CD11b+单核内快速生长繁殖实验数据显示, VNP20009 在肿瘤内细胞分别是 PBS 对照组的与 2.7 倍 CD8+

1420 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (9): 1417 1422 Figure 4 Tissue distribution of VNP20009 measured by colony forming assay. n = 5, x ± s.

发挥杀伤肿瘤细胞的作用 ( 图 5) 4 VNP20009 对肿瘤组织内细胞因子的影响肿瘤组织内的细胞因子含量能在一定程度上反映肿瘤内免疫反应的类型与强度, 上述研究数据已经表明 : VNP20009 能显著提高肿瘤内 CD8 + T 细胞与 CD11b + 单核巨噬细胞的数量, 而 TNF-α 与 IFN-γ 是 CD8 + T 细胞与单核巨噬细胞分泌的主要细胞因子,

4 1420 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (9): Figure 4 Tissue distribution of VNP20009 measured by colony forming assay. n = 5, x ± s. VNP20009 can specially accumulate in solid tumor, and only little bacteria can be found in normal tissues T 细胞与 CD11b + 的单核巨噬细胞是执行肿瘤免疫杀伤的关键细胞, 说明 VNP20009 能通过提高肿瘤内 CD8 + T 细胞与 CD11b + 单核巨噬细胞的浸润水平而发挥杀伤肿瘤细胞的作用 ( 图 5) 4 VNP20009 对肿瘤组织内细胞因子的影响肿瘤组织内的细胞因子含量能在一定程度上反映肿瘤内免疫反应的类型与强度, 上述研究数据已经表明 : VNP20009 能显著提高肿瘤内 CD8 + T 细胞与 CD11b + 单核巨噬细胞的数量, 而 TNF-α 与 IFN-γ 是 CD8 + T 细胞与单核巨噬细胞分泌的主要细胞因子, 也是机体抗肿瘤免疫的重要细胞因子, 因而测定了 VNP20009 治疗后肿瘤组织内 TNF-α 与 IFN-γ 的含量实验结果显示, 注射 VNP20009 能显著提高肿瘤组织内 TNF-α 和 IFN-γ 的含量, 分别是 PBS 对照组的 10 倍与 46 倍证明 VNP20009 能通过提高 CD8 + T 细胞与单核巨噬细胞的活性增强其在肿瘤内部分泌细胞因子, 进而提高肿瘤内的免疫反应, 破坏肿瘤免疫微环境中的免疫逃逸效应, 而产生抗肿瘤效应 ( 图 6) Figure 6 Cytokines analysis. PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group. A: TNF-α in tumor tissues; B: IFN-γ in tumor tissues. n = 4, x ± s. ** P < 0.01 Figure 5 Analysis of tumor infiltrating immunocytes by flow cytometry. PBS: PBS control group, VNP: VNP20009 treatment group. A: Infiltrating CD4 + and CD8 + T cells in within tumor tissue. B: Infiltrating CD11b + monocytes within in tumor tissue. Quantitative analyses of CD4 + T cells (C), CD8 + T cells (D), CD11b + monocytes (E). n = 3, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 讨论肿瘤治疗药物的抗肿瘤疗效不佳, 其原因之一是药物在肿瘤内的浓度不高, 而为了药物在肿瘤内能达到合适浓度, 还会导致在正常组织中药物浓度过高产生严重不良反应, 这成为肿瘤治疗的难点之一, 而肿瘤靶向药物是解决这一问题的最佳方案 [14 16] 细菌可以靶向性抑制肿瘤的现象早在 100 年前已被发现, 随着目前肿瘤靶向药物的研究热潮, 靶向性治疗肿瘤的细菌疗法也被研究者所关注因为肿瘤内的乏氧与免疫抑制环境利于细菌生长, 减毒沙门氏菌 VNP20009 能靶向性地在肿瘤组织内生长繁殖, 通过竞争营养分泌毒素以及引起免疫反应等方式使肿瘤组织坏死凋亡本研究证明, VNP20009 治疗后, 肿瘤生长速度明显减缓, 肿瘤细胞大量死亡说明 VNP20009 有抑制肿瘤组织生长, 促使肿瘤细胞坏死凋亡的良好效果肿瘤微环境是肿瘤本身生长所处的内环境, 主要由肿瘤细胞和间质细胞成纤维细胞免疫细胞等基质细胞, 包含各种功能性分子与营养物质的细胞外基质与血管组成, 与其说肿瘤是一种均质的组织, 现在更倾向于认为其是一个特殊的器官, 是动态的

5 韩雨衡等 : 肿瘤靶向性沙门氏菌 VNP20009 抗肿瘤作用及其对肿瘤免疫微环境的影响 1421 时刻变化的和非均质的而肿瘤免疫微环境则是指包括免疫抑制性细胞与物质和抗肿瘤的免疫细胞与细胞因子等物质组成的肿瘤组织内的免疫环境肿瘤免疫微环境整体上是免疫抑制的, 不利于免疫杀伤细胞 [11 13, 执行肿瘤杀伤的功能 17 19] VNP20009 能提高肿瘤组织内部的免疫反应水平, 使肿瘤内 CD8 + T 细胞与单核巨噬细胞浸润增加, 进而使主要由 T 细胞分泌的 Th1 型细胞因子 IFN-γ 与 TNF-α 的含量明显提高 CD8 + T 细胞中细胞毒性 T 细胞 (CTL) 和单核巨噬细胞, 都是抗肿瘤免疫的效应细胞 CTL 可以直接通过分泌穿孔素颗粒酶和 FasL 杀伤肿瘤细胞, 单核巨噬细胞也可通过分泌 NO 或通过抗体依赖性的细胞介导的细胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 作用杀伤肿瘤细胞不仅如此, CTL 与单核巨噬细胞均可通过分泌细胞因子 ( 如 TNF-α IFN-γ) 激活免疫反应, 提高免疫细胞活性, [20, 杀灭肿瘤细胞 21] TNF-α 可以通过提高杀伤性 T [22, 细胞与 NK 细胞的抗肿瘤活性产生抗肿瘤效应 23], 高浓度的 TNF-α 还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡 [24] 而 IFN-γ 不仅可以使免疫反应向 Th1 型免疫反应极化, 使免疫反应向细胞免疫倾斜, 还可以激活杀伤性 T 细胞 NK 细胞与巨噬细胞等肿瘤杀伤细胞, 提高 [25, 对肿瘤细胞的杀伤抑制效应 26] 综上所述, VNP20009 能使肿瘤免疫微环境中执行细胞杀伤效应的 CD8 + T 细胞与单核巨噬细胞浸润增加, 肿瘤免疫微环境中的 TNF-α 与 IFN-γ 含量明显提高, 免疫反应向 Th1 型反应倾斜, 破坏肿瘤免疫微环境中的免疫逃逸效应, 使肿瘤杀伤细胞在肿瘤内的数量与活性明显提高, 实现抑制肿瘤生长, 杀灭肿瘤细胞的作用结果说明 VNP20009 可以通过激活机体的免疫反应, 提高机体本身肿瘤杀伤细胞的活性来杀伤肿瘤细胞, 抑制肿瘤生长, 有很好的抗肿瘤疗效 References [1] Hayashi K, Zhao M, Yamauchi K, et al. Cancer metastasis directly eradicated by targeted therapy with a modified Salmonella typhimurium [J]. J Cell Biochem, 2009, 106: [2] Zhao M, Yang M, Li XM, et al. Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium [J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2005, 102: [3] Zhang L, Gao L, Zhao L, et al. Intratumoral delivery and suppression of prostate tumor growth by attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium carrying plasmid-based small interfering RNAs [J]. Cancer Res, 2007, 67: [4] Zhao M, Geller J, Ma H, et al. Monotherapy with a tumortargeting mutant of Salmonella typhimurium cures orthotopic metastatic mouse models of human prostate cancer [J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2007, 104: [5] Clairmont C, Lee KC, Pike J, et al. Biodistribution and genetic stability of the novel antitumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhimurium [J]. J Infect Dis, 2000, 181: [6] Low KB, Ittensohn M, Le T, et al. Lipid A mutant Salmonella with suppressed virulence and TNF- α induction retain tumor-targeting in vivo [J]. Nat Biotechnol, 1999, 17: [7] Chen J, Wei D, Zhuang H, et al. Proteomic screening of anaerobically regulated promoters from Salmonella and its antitumor applications [J]. Mol Cell Proteomics, 2011, 10: [8] Ganai S, Arenas RB, Forbes NS. Tumour-targeted delivery of TRAIL using Salmonella typhimurium enhances breast cancer survival in mice [J]. Br J Cancer, 2009, 101: [9] Loeffler M, Le'Negrate G, Krajewska M, et al. Salmonella typhimurium engineered to produce CCL21 inhibit tumor growth [J]. Cancer Immunol Immunother, 2009, 58: [10] Cheng X, Zhang X, Cheng W, et al. Tumor-specific delivery of histidine-rich glycoprotein suppresses tumor growth and metastasis by anti-angiogenesis and vessel normalization [J]. Curr Gene Ther, 2014, 14: [11] Whiteside TL. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth [J]. Oncogene, 2008, 27: [12] Gajewski TF, Meng Y, Blank C, et al. Immune resistance orchestrated by the tumor microenvironment [J]. Immunol Rev, 2006, 213: [13] Shiao SL, Ganesan AP, Rugo HS, et al. Immune microenvironments in solid tumors: new targets for therapy [J]. Genes Dev, 2011, 25: [14] Zhen YS. Current situation and prospect of research on antitumor drug [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 1994, 29: 1 8. [15] He QY. Tumor heterogeneity and drug resistance of targeted antitumor agents [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2016, 51: [16] Gao HL, Jiang XG. The development of novel tumor targeting delivery strategy [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2016, 51: [17] Wang H, Chen L. Tumor microenviroment and hepatocellular carcinoma metastasis [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28

6 1422 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (9): Suppl 1: [18] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation [J]. Cell, 2011, 144: [19] Brown JM. Tumor microenvironment and the response to anticancer therapy [J]. Cancer Biol Ther, 2002, 1: [20] Hibbs JB Jr, Taintor RR, Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite [J]. Science, 1987, 235: [21] Chamoto K, Kosaka A, Tsuji T, et al. Critical role of the Th1/Tc1 circuit for the generation of tumor-specific CTL during tumor eradication in vivo by Th1-cell therapy [J]. Cancer Sci, 2003, 94: [22] Kashii Y, Giorda R, Herberman RB, et al. Constitutive expression and role of the TNF family ligands in apoptotic killing of tumor cells by human NK cells [J]. J Immunol, 1999, 163: [23] Prévost-Blondel A, Roth E, Rosenthal FM, et al. Crucial role of TNF-α in CD8 T cell-mediated elimination of 3LL-A9 Lewis lung carcinoma cells in vivo [J]. J Immunol, 2000, 164: [24] Colotta F, Peri G, Villa A, et al. Rapid killing of actinomycin D- treated tumor cells by human mononuclear cells. I. Effectors belong to the monocyte-macrophage lineage [J]. J Immunol, 1984, 132: [25] Boehm U, Klamp T, Groot M, et al. Cellular responses to interferon-γ [J]. Annu Rev Immunol, 1997, 15: [26] Cope A, Le Friec G, Cardone J, et al. The Th1 life cycle: molecular control of IFN-γ to IL-10 switching [J]. Trends Immunol, 2011, 32:

附件2：

附件2：中国实验动物学会团体标准实验动物肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范编制说明联系人 : 李舸联系电话 :15011983691 编制单位 : 广东省实验动物监测所时间 : 2016 年 10 月 25 日中国实验动物学会团体标准人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范编制说明 GB/T1.1 2009 1 2011A081401005 2013B040400007