行 例 糖尿 療 糖尿 利 行 利 酶 數 路 酶 量

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1 行 類 行 年 年 行 參 理 論 利 年 年

2 行 例 糖尿 療 糖尿 利 行 利 酶 數 路 酶 量

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4 行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 成果報告 期中進度報告 以細胞及動物模式探討新育種苦瓜對脂質生合成之影響及其分子機 轉探討 計畫類別 : 個別型計畫 整合型計畫計畫編號 :NSC B 執行期間 :101 年 08 月 01 日至 102 年 07 月 31 日 執行機構及系所 : 中山醫學大學營養學系 計畫主持人 : 徐慶琳共同主持人 : 計畫參與人員 : 邱天惠 成果報告類型 ( 依經費核定清單規定繳交 ): 精簡報告 完整報告 本計畫除繳交成果報告外, 另須繳交以下出國心得報告 : 赴國外出差或研習心得報告 赴大陸地區出差或研習心得報告 出席國際學術會議心得報告 國際合作研究計畫國外研究報告 處理方式 : 除列管計畫及下列情形者外, 得立即公開查詢 涉及專利或其他智慧財產權, 一年 二年後可公開查詢 中華民國一百零二年九月十四日 1

5 摘要肥胖為世界盛行的疾病之一, 亦會造成許多慢性疾病的發生, 例如 : 心血管疾病 第二型糖尿病 高血壓與癌症等 山苦瓜已長期且廣泛的運用在治療第二型糖尿病與發炎反應上, 然而目前新育種苦瓜對 3T3-L1 細胞在肥胖之影響尚未釐清, 因此, 本實驗利用三種新育種苦瓜, 分別為蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33 之果肉與種子, 分別以水 甲醇 乙醇 丙酮與乙酸乙酯進行萃取, 利用 3T3-L1 細胞為實驗模式, 探討三種新育種苦瓜對 3T3-L1 細胞之脂質生合成之影響 由結果得知以蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞在胞內三酸甘油酯 甘油 -3- 磷酸去氫酶活性與脂肪細胞數目 ( 油紅染色 ) 上具有最佳之抑制效果 其可透過調控 MAPK 路徑之蛋白質表現 (p-erk 與 p-jnk), 抑制 3T3-L1 脂肪細胞分化相關基因 (PPAR SREBP-1c C/EBP 與 C/EBP), 以及抑制脂肪酸合成酶 (FAS) 之基因與蛋白表現量, 並提升脂肪酸分解與氧化之基因表現 (ATGL HSL ACO 與 CPT-1), 進而抑制脂肪細胞油滴堆積之作用 此外, 其亦可抑制 leptin 之基因表現, 並顯著增加 adiponectin 之基因與蛋白表現 綜合以上結果得知, 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 細胞具有抑制脂質生合成之作用 關鍵字 : 3T3-L1 細胞 新育種苦瓜 細胞週期 脂質生合成 ABSTRACT The prevalence of obesity is increasing worldwide and is considered a risk factor associated with cardiovascular, type 2 diabetes, hypertension, and cancer. Bitter melon was widely used as herbal medicine for anti-diabetes and anti-hypertension activities. However, the inhibitory effects of obesity in new variety selection of bitter melon remain unclear. Therefore, the aim of this study was investigate the effects of different solvents (water, methanol, ethanol, acetone, and ethyl acetate) extracts from the fruit and seed of Momordica charantia, Momordica charantia MDS72, and Momordica charantia ONS33 on inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells. The result indicated that water extract from the fruit of Momordica charantia (WEFMC) significantly decreased the intracellular triglyceride, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, and the number of adipocytes (oil red o staining) through regulate MAPK pathway protein expressions (p-erk and p-jnk), inhibit adipocytes differentiation related gene (PPAR, SREBP-1c, C/EBP, and C/EBP), lipogenesis related gene and protein expressions of FAS, and increase the lipolysis and fatty acid oxidation related gene expressions of ATGL, HSL, CPT-1, and ACO. In addition, WEFMC also suppress the gene expressions of leptin and promote gene and protein expressions of adiponectin. These results demonstrate that new variety selection of bitter melon can inhibit adipogenesis (WEFMC) in 3T3-L1 cells. Keywords : 3T3-L1 cells, bitter melon, cell cycle, adipogenesis 2

6 一 前言苦瓜 (Momordica charantia L.) 為一年生葫蘆科苦瓜屬蔓性攀緣草本植物, 廣泛的種植在亞洲 非洲與南美洲, 果實顏色由綠至深綠, 果型由橄欖型至長橢圓型 苦瓜含苦瓜素, 故帶有苦味 依據行政院農委會資料顯示, 山苦瓜具有許多營養成分, 例如 : 維生素 A 維生素 B1 維生素 B2 維生素 C 菸鹼酸 鈣 磷 鐵 蛋白質 纖維素 胡蘿蔔素與胺基酸 此外, 研究亦指出, 苦瓜富含生物鹼 (alkaloids) 固醇類葡萄醣苷 (steroidal glucosides) 酚類物質 (phenolics) 溶血磷脂醯膽鹼 (lysophosphatidylcholines, LPC) 共軛亞麻油酸異構體 (conjugated linolenic acid isomers) 與葫蘆烷型三萜類化合物 (cucurbitane-type triterpenoids) (Krawinkel and Keding, 2006; Chuang et al., 2006; Chang et al., 2011; Hsu et al., 2011) 許多文獻指出, 苦瓜能有效的增加胰島素敏感性 (Klomann et al., 2010) 降低發炎反應 (Lii et al., 2009; Cheng et al., 2012) 降血脂 (Matsui et al., 2013), 以及抑制癌細胞增生 (Li et al., 2012; Tabata et al., 2012) 研究亦指出, 苦瓜能藉由降低 PPAR SREBP 與 perilipin 之基因表現, 並增加脂解作用, 達到抑制人類初代脂肪細胞的分化 (Nerurkar et al., 2010) 肥胖為世界盛行之疾病之一, 世界衛生組織 (World Health Organization) 評估, 有五億成年人與將近四千三百萬的小孩肥胖 肥胖的發病機制是許多因素間的交互作用所造成, 例如 : 遺傳 生活習慣 生理 心理與環境等, 其中環境因素又包含 : 文化 食物來源 教育程度與社會經濟地位等 (Moller and Kaufman, 2005) 肥胖會造成許多慢性疾病的發生, 例如 : 心血管疾病 第二型糖尿病 高血壓 胰島素阻抗與癌症等 (Farhat et al., 2010; Moura and Claro, 2012) 此外, 根據衛生福利部統計,2013 年最新公告之國人十大死因, 其中的惡性腫瘤 心臟疾病 腦血管疾病 糖尿病 高血壓與慢性肝病等, 皆與肥胖密切相關 因此, 如何治療肥胖, 同時改善其它慢性疾病之發生, 已成為現今關注之健康議題 基於以上, 本研究將以新育種苦瓜進行抗肥胖之探討, 並釐清其分子機制 本研究利用純化選種與田間試驗所取得之苦瓜, 分別為蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33, 將其果肉與種子, 分別以水 甲醇 乙醇 丙酮與乙酸乙酯進行萃取, 探討不同品系 部位與溶劑之苦瓜萃取物對 3T3-L1 細胞之脂質生合成之影響及其分子機制 二 研究目的隨著生活型態與飲食習慣之改變, 肥胖已成為全球重要的公共衛生議題之一 已知肥胖的形成原因很多, 例如 : 基因 生理 心理 疾病或環境因素等, 其皆會增加肥胖的發生率, 亦會導致許多慢性疾病的發生, 例如 : 心血管疾病 第二型糖尿病 高血壓 高血脂與癌症等 在 2012 年國人十大死因, 其中惡性腫瘤 心臟疾病 腦血管疾病 糖尿病 高血壓與腎臟疾病等, 皆與肥胖息息相關 ( 衛生福利部,2013), 由此可知, 肥胖已成為現今社會不容小覷之公共議題 常見的肥胖治療方式包含 : 減少飲食攝取與增加運動量, 但此方式需要長時間及意志力, 許多人因無法堅持到最後而宣告失敗 ; 而藥物治療及手術治療雖然有效, 但可能會帶給身體極大的副作用 因此, 如何以機能性食品增強減 3

7 重效果, 已成為研究探討的趨勢之一 過去研究指出, 天然食材中富含的酚類物質 三萜類與生物鹼等植物化學成分, 已知具有抗肥胖之能力 而苦瓜在過去文獻中, 已知具有增加胰島素敏感性 抗發炎與抗肥胖之作用, 但是針對本土性新育種苦瓜之材料探討目前仍缺乏相關研究, 因此本研究將以新育種苦瓜對 3T3-L1 細胞之細胞週期 脂質生合成之影響進行探討 本研究利用純化選種與田間試驗技術, 培育出蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33 等三種新育種苦瓜, 以 3T3-L1 細胞為試驗模式, 探討新育種苦瓜對 3T3-L1 分化後脂肪細胞之脂質生合成作用, 並釐清其分子作用機轉 三 文獻探討肥胖是二十一世紀社會所面臨的嚴重健康問題, 它被認為是全球性的流行病, 在世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 以及食品藥物管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 都將其列為重要的公共衛生議題 隨著生活型態的改變, 尤其是飲食習慣和社會經濟的改變, 肥胖的盛行率已逐年增加, 世界衛生組織 (WHO) 在 2008 年的統計資料顯示, 目前世界上約有 15 億的成年人口體重過重, 超過十分之一的人口有肥胖的問題, 預計 2023 年將有超過 23 億人會有體重過重的問題 (Mariela and Itamar, 2011) 肥胖不僅是外觀臃腫而已, 它被認為是一種慢性疾病, 其亦是造成代謝症候群 高血壓 心臟病等疾病的主因 造成肥胖的主要原因是長期體內能量的失衡, 導致多餘的能量以三酸甘油酯的形式儲存於脂肪組織, 過多的脂肪組織累積在體內因而造成肥胖, 其會對人體健康產生負面影響, 目前已知其是許多疾病的危害因子 造成熱量攝取及消耗失衡的原因是錯綜複雜的, 例如 : 遺傳因素 生理因素 心理疾病因素 生活因素和環境因素等 遺傳因素 : 肥胖基因會造成肥胖, 文獻指出父母皆肥胖, 則後代有 80% 機率是肥胖症患者 ; 而體重正常的父母其後代只有 10% 是肥胖症患者 (Kral and Rauh, 2010; Raj and Kumar, 2010) 此外, 亦有少數原因會造成肥胖, 例如 : 甲狀腺機能低落 憂鬱症 服用某些類固醇與抗憂鬱藥劑 相較於上述這些因素, 生活型態與環境因素才是造成肥胖的主要原因 生活型態與環境因素 : 因飲食習慣的改變 熱量攝取過多或是熱量消耗不足, 都可能是造成肥胖的原因 熱量攝取過多和肥胖的發生率是息息相關的, 飲食中如經常攝取高熱量食物, 例如 : 高油脂或含精緻糖等, 高熱量的食物, 容易造成體內過多的熱量堆積 (Caballero, 2007) 研究指出, 肥胖的人可能因攝取較高的熱量所致, 亦可能因活動不足而導致體內能量的消耗過低, 造成體內能量過度的累積, 最終導致肥胖的發生 (Raj and Kumar, 2010) 肥胖會衍生出許多相關疾病, 例如第二型糖尿病 動脈粥狀硬化 心血管疾病 非酒精性脂肪肝 高血壓 高血脂 哮喘 睡眠呼吸中止症與癌症等 (Finer, 2011) 研究指出, 肥胖所導致的致死率增加是與 BMI 有相關性, 當 BMI 在 之間因肥胖導致的死亡率最低, 然而隨著 BMI 的增加或減少, 死亡率都會隨之上升, 特別是 BMI 大於 32 以上則會使死亡率加倍 (Pischon et al., 2008) 以下分別針對肥胖相關之背景與研究目的進行敘述: (1) 肥胖症動物之誘導 4

8 脂肪之攝取已知與心血管疾病之發生有密切相關, 其中過量的膽固醇與飽和脂肪攝取已知與促進動脈粥狀硬化有關 (McNamara, 2000) Muller 等 (2003) 研究指出, 攝取高量的飽和脂肪與血清膽固醇濃度之升高有關, 其亦與冠心病死亡率有直接的相關性 在肥胖動物相關研究上, 目前可由高熱量飲食誘導 mice rat 與 hamster 之肥胖動物模式, 進行肥胖動物試驗之研究探討, 而常見作為高熱量高油脂飲食來源之油脂包括猪油 椰子油 玉米油 大豆油 牛油與酥油 (Hsu & Yen, 2008) 常見之實驗動物種類包括有 male C57BL/6J mice female C57BL/6J mice male New Zealand black mice Female KK-A y /Ta mice male Wistar rat male Sprague-Dawley rat 與 male Syrian golden hamsters 等, 其中小鼠以 male C57BL/6J mice 為較多研究者選擇之動物種類, 而大鼠部份則以 male Wistar rat 較多 給予動物之高熱量高油脂飲食之種類與比例上, 動物性油脂來源以猪油較廣為研究者使用, 其給予動物油脂之比例為 16-30% 之間 此外, 有部份研究者以併用二種油脂之方式來誘導動物肥胖, 例如 40% 酥油與大豆油或是 28% 牛油與猪油之混合油脂 基於此, 本研究計畫選擇以大鼠為實驗動物 (male Wistar rat), 而飼料配方則以 20% 之猪油作為高油脂來源, 換算猪油佔動物總熱量攝取之百分比為 36.2%, 此熱量之給予與 Wensaas 等 (2009) 所發表之文獻資料相似 (2) 肥胖之預防與控制肥胖可藉由降低熱量攝取 運動 藥物控制和手術等方式來達到改善 其中飲食控制和運動是最有效且安全的體重控制方式 利用手術方式治療肥胖的風險最大, 例如胃腸道改道手術 (Bariatric Surgury), 因潛藏有併發症發生的風險, 故未能廣泛應用於肥胖症患者 在藥物的使用方面 orlistat 為一種胃腸脂酶抑制劑 (gastrointestinal lipase inhibitor), 而 sibutramine 是一種單胺回收抑制劑 (monoamine-reuptake inhibitor), 其除了會造成血壓與脈搏速率增加的副作用, 更由於近年來的研究指出 sibutramine 對心血管疾病患者具有高度風險, 故 2010 年 Food and Drug Administration (FDA) 公告停止使用含有 sibutramine 之藥物 (Mariela and Itamar, 2011) 基於此, 如能從天然食材獲得具控制肥胖的有效成分, 不僅可以降低許多副作用的風險, 亦能達到改善肥胖之目的, 故利用補充或替代療法的方式來達到肥胖的控制, 將是未來保健營養的發展趨勢 (3) 苦瓜之簡介與機能性苦瓜 (Momordica charantia L.) 為葫蘆科苦瓜屬一年生之蔓性草本植物, 原產於熱帶地區, 為亞洲和非洲常見的蔬菜, 也常被用來當作草藥使用, 特別是在降低血糖方面有很好的成效 近年來有許多文獻指出, 苦瓜具有多種生理活性, 例如 : 降血糖 (Sirintorn, 2006) 降血脂 (Nerurkar et al., 2010) 抗發炎 (Lii et al., 2009) 和抗癌 (Kobori et al., 2008) 等功能 國內常見的苦瓜栽培品種有苦瓜 1 號 苦瓜 2 號 平米 玉珠 真珠 月華 農友 2 號 珍珠 粗米 東勢 溪湖 大米和鹿草 ( 杜和蕭,1990), 且農委會之後陸續選擇地方種山苦瓜和野生苦瓜利用雜交育種技術於 年間育成 花蓮 1 號 花蓮 2 號 花蓮 3 號 和 花蓮 4 號 之新苦瓜品種, 其果實所含之維他命 C 葉酸 菸鹼酸和膳食纖維等含量皆比市售白苦瓜高 ( 全,2008) 苦瓜除含有富豐的維 5

9 生素與礦物質外, 亦含有胡蘿蔔素 葉酸 泛酸 共軛次亞麻油酸與食物纖維 近年來亦有研究清楚釐清苦瓜含有 momorcharin momordicin charantin polypeptide-p 和 vincine 等植物化學成分 (Grover and Yadav, 2004; Krawinkel et al., 2006; Singh et al., 2011) 許多文獻指出, 苦瓜具有多種生理活性功能 Yibchok-Anun 等 (2006) 指出, 苦瓜降血糖的機制和其含有類似胰島素的物質有關 在動物實驗方面, 已有研究證實在 STZ 誘發的第一型糖尿病鼠中, 餵食苦瓜具有促進胰島素分泌的功能, 進而達到調控血糖之作用 Ojewole 等 (2006) 的研究指出, 餵食苦瓜水萃取物對 STZ 所誘發糖尿病鼠, 具有顯著降低血糖之作用 在降血脂的研究方面,Nerurkar 等 (2010) 指出, 苦瓜汁具有調節脂質相關基因的功能, 進而達到抑制脂肪細胞的分化, 且苦瓜汁具有降低脂肪細胞三酸甘油酯的含量以及油滴的生成 在抗發炎研究上,Lii 等 (2009) 指出, 在脂多醣 (lipopolysaccharrides, LPS) 所誘導 RAW264.7 巨噬細胞產生發炎反應之試驗模式下, 山苦瓜果肉的乙醇和乙酸乙酯萃取物具有明顯降低 NO 和 PGE 2 的分泌量 在抗癌的研究上, Kobori 等 (2008) 研究指出, 苦瓜萃取物對於 HL-60 leukemia 和 HT-29 colon carcinoma cell, 具有促進癌細胞凋亡的作用 基於此, 在本研究中, 將利用純化選種和田間試驗所篩選之新育種苦瓜, 以細胞及動物模式探討其在抑制脂質生合成之作用, 以及釐清其相關作用分子機轉 四 研究方法 ( 一 ) 實驗材料苦瓜來源由明道大學劉程煒老師提供, 本研究所使用材料共有三種新育種品系苦瓜, 利用純化選種與田間試驗培育出蘋果苦瓜 (Momordica charantia) 苦瓜明道選 72 (Momordica charantia MDS72) 與苦瓜沖繩選 33 (Momordica charantia ONS33) 苦瓜明道選 72 為數個野生種多方雜交後選拔出之優良後代, 苦瓜沖繩選 33 為琉球山苦瓜與台灣山苦瓜雜交後選拔出來之優良後代 ( 圖 1), 此三種苦瓜分別收集種子與果肉並將之冷凍乾燥, 再研磨製成苦瓜種子與果肉粉末 ( 圖 2) ( 二 ) 實驗方法 1. 不同品系 部位與溶劑之苦瓜萃取物製備分別秤取 4 克蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33 之苦瓜果肉與種子粉末於離心管中, 再加入 40 ml 之不同極性溶劑 ( 水 甲醇 乙醇 丙酮與乙酸乙酯 ), 以 parafilm 將管壁封好, 利用震盪萃取方式於室溫下震盪 24 小時, 經過濾後以減壓濃縮或冷凍乾燥 ( 針對水萃物 ) 方式, 進行濃縮與定量, 每一種溶劑進行三重複試驗, 並計算其萃取率 各萃取物之名稱為 : 苦瓜水萃取物 (water extract of bitter melon, WEBM) 苦瓜甲醇萃取物 (methanol extract of bitter melon, MEBM) 苦瓜乙醇萃取物 (ethanol extract of bitter melon, EEBM) 苦瓜丙酮萃取物 (acetone extract of bitter melon, AEBM) 苦瓜乙酸乙酯萃取物 (ethyl acetate extract of bitter melon, EAEBM) 2. 3T3-L1 前脂肪細胞 6

10 前脂肪細胞株 3T3-L1 (BCRC No ) 購自財團法人食品工業發展研究所, 生物資源保存及研究中心 ( 台灣, 新竹 ) 3. 3T3-L1 前脂肪細胞之培養將冷凍保存之 3T3-L1 前脂肪細胞株自液態氮桶取出後, 置於 37C 水浴迅速解凍, 將細胞種入 T75 flask 培養盤中, 加入適量之培養基 90% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 含有 4 mm L-glutamine 與 4.5 g/l glucose) 外加 1.5 g/l sodium bicarbonate 10% bovine calf serum 與 1% antibiotic, 於 37C 5% 二氧化碳培養箱培養, 平均每兩天更換一次培養液 4. 脂肪細胞之分化培養脂肪細胞分化培養參考 Hsu 和 Yen (2007) 之方法進行 3T3-L1 前脂肪細胞以 6 well 之培養盤培養至單層 (monolayer) 後細胞會形成 confluents, 而細胞數不會再增加, 以顯微鏡觀察時細胞約長至全滿 約兩天後即可加入分化 A 培養基 ( 分化 A 培養基包括 0.5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine 1 μm dexamathasone 1 μm insulin 1.5 g/l sodium bicarbonate 10% fetal bovine serum 與 1% antibiotic 溶於 high glucose DMEM) 培養四天, 接著再分別以分化 B 培養基 (1 μm insulin 1.5 g/l sodium bicarbonate 10% fetal bovine serum 與 1% antibiotic 溶於 high glucose DMEM) 培養四天之後, 換回原來之 culture medium (culture medium 包括 1.5 g/l sodium bicarbonate 10% bovine calf serum 與 1% antibiotic 溶於 high glucose DMEM), 分化過程每天更換一次培養液, 持續培養至分化第八天, 細胞即慢慢分化完成 隨著脂肪細胞的分化, 於顯微鏡下觀察, 細胞會由紡錘狀變為球狀, 細胞內會堆積許多圓亮的脂肪滴, 即可做為脂肪細胞實驗使用 5. 脂肪細胞胞內三酸甘油酯含量測定經分化培養完成之 3T3-L1 脂肪細胞, 以不同品系 部位與溶劑之苦瓜萃取物處理 48 小時 待加藥處理完成, 將細胞培養液移除並以 PBS 清洗兩次, 加入 lysis buffer (1% Triton X-100 in PBS) 刮下細胞後, 再以超音波破碎細胞, 此細胞液即可作為細胞內三酸甘油酯含量分析 胞內三酸甘油酯含量之測定分成三酸甘油酯與蛋白質含量測定兩部分 三酸甘油酯含量部分利用三酸甘油酯測定套組 (TG assay kit, Teco diagnostics, U.S.A.) 進行測定, 取 96 well plate 分別加入 2 μl 之細胞均質液與 200 μl 之 TG assay kit, 將其置於暗室反應 10 分鐘後, 於 520 nm 測定其吸光值 樣品吸光值除以標準液吸光值乘上標準液濃度, 即可得知樣品中三酸甘油酯濃度 細胞蛋白質含量部分利用 bio-rad protein dye 進行測定, 取 96 well plate 分別加入 10 μl 之細胞均質液與 200μL 之 5X bio-rad protein dye 於暗室反應 15 分鐘後, 利用全波長酵素免疫分析儀, 於 595 nm 作吸光值測定, 另外分別以不同濃度之 bovine serum albumin 所作出之標準曲線, 即可進行蛋白質含量之計算 6. 脂肪細胞胞內甘油 -3- 磷酸去氫酶 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPDH) 酵素活性分析 GPDH 酵素在肥胖上扮演重要角色, 其會使得甘油 -3- 磷酸轉換成三酸甘油酯 (Wise and Green, 1979) GPDH 酵素活性是使用市售 GPDH 活性分析套組 (B-Bridge International, Sunnyvale, CA, U.S.A.) 7

11 進行分析 將分化培養完成之 3T3-L1 脂肪細胞, 以不同濃度之苦瓜萃取物處理 48 小時 待加藥處理完成, 將細胞培養液移除, 以 PBS 清洗兩次, 加入 enzyme extraction reagent, 利用超音波破碎儀, 將細胞完全破碎, 置入離心機 (12000 g 5 分鐘 4C) 離心 取 96 well plate 分別加入 100 L 之細胞均質液和 200 L substrate solution (DHAP NADH 和 lyophilized), 利用全波長酵素免疫分析儀於 340 nm 測定其吸光值 依下列公式計算 GPDH 活性 :GPDH activity (U/mL) = OD at 340 nm/min 脂肪細胞油紅 (Oil red O) 染色 Oil red o 染色是參考 Ramirez-Zacarias 等 (1992) 之方法, 並作些許修飾 Oil red o 試劑之配製是取 4.2 g oil red o 溶於 1200 ml 之 isopropanol, 將此溶液靜置隔夜後, 以 Whatman # 4 之濾紙 (Whatman International Ltd., Maidstone, England) 過濾之, 再加入 900mL 之去離子水, 於 4 之冷房攪拌隔夜, 最後以濾紙過濾兩次後, 於室溫中存放使用 分化之脂肪細胞在染色方法上, 先將培養於培養皿的細胞, 以 10% neutral buffered formalin 固定細胞 20 分鐘以上, 倒掉固定液後以 1 ml 之 100% propylene glycol 覆蓋 3 分鐘, 再除去 propylene glycol 溶液, 並加入 1mL 之 oil red o 試劑反應 60 分鐘, 移除 oil red o 試劑後, 加入 60% propylene glycol 溫和攪拌脫色, 以 ddh2o 沖洗後置於 37 烘箱乾燥 1 小時, 再加 入 200 L 之 isopropanol 至細胞中, 利用攪拌器攪拌萃取細胞之染劑, 此萃取液經定量後, 即可利用 分光光度計於 510nm 波長作測定 OROSM (oil red o-stained material) 所測定之脂肪細胞染色吸光值, 其會隨著脂肪細胞數目之增加而增加, 因此可作為計算每一細胞基準之細胞數量測定, 並可由控制組之脂肪細胞染色之吸光值計算出相對脂肪細胞數量 8. 蛋白質表現分析 (1) 聚丙烯醯胺膠體電泳法 (SDS-PAGE electrophoresis assay) 3T3-L1 脂肪細胞以不同時間點 (1 3 6 與 9 小時 ) 加入 50 g/ml 之苦瓜萃取物處理, 經 PBS 沖洗二次後, 加入 300 L 之 lysis buffer solution, 將細胞以刮刀刮下後, 置於冰浴中, 利用超音波破碎機進行細胞破碎, 取得細胞破碎液後, 以 bio-rad protein assay (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) 進行蛋白質濃度測試, 並使用 bovine serum albumin 作標準物之定量分析, 即可進行聚丙烯醯胺膠體電泳與西方轉漬法分析 (2) 聚丙烯醯胺膠片配製配製 1.5 mm 厚度的 SDS-PAGE 膠片, 分成上下兩層, 下層為 separating gel, 其 acrylamide 的百分比視分析蛋白質的分子量而定, 上層的 stacking gel 則含 5% acrylamide Resolving gel 與 stacking gel 之膠片配置上, 各個 reagent 之添加順序為 ddh 2 O resolving gel (0.5M Tris-HCl) 10% (w/v) SDS 30% degassed acrylamide/bis 20% APS 與 TEMED 配製好之 resolving gel 注入後用少許 isopropanol 壓平液面, 待 30 分鐘凝膠後, 傾斜玻璃片並用紙將 isopropanol 吸出, 加入配製好之 stacking gel 至滿出, 立即放入齒梳, 若有小氣泡需吸出, 以免膠體產生孔洞, 待 30 分鐘後可進行後續試驗分析使用 8

12 將蛋白質樣品回溫後, 加入等體積 (5X) protein loading dye, 於 100 C 沸水中加熱 10 分鐘後, 置於冰上快速冷凍, 存放於 -20C 冰箱備用 將配置好之 SDS-PAGE gel 組裝於電泳分析設備上, 內 外槽注入 running buffer, 垂直拿出齒梳 將每個樣品 (10 g/ml) 和標示標準分子量的 multimarker (1-2 L/lane) 依序注入膠體的孔槽中, 通以電壓 70 伏特約 15 分鐘, 待樣品通過 stacking gel 後, 將電壓調整為 140 伏特, 約電泳 60 分鐘 (3) 西方轉漬法 (western blot assay) 參照 Laemmli (1970) 的方法 電泳後將膠片移至轉印三明治夾板中, 依序將海綿 濾紙 膠片 PVDF membrane (Millipore) 濾紙與海綿固定, 將夾板一起浸泡於 transfer buffer (ph mm Tris-base 40 mm glycine 0.375% SDS 與 20% methanol) 採用 bio-rad mini protein 濕式轉漬設備, 以 400 ma 進行轉漬,1 小時後取出 PVDF membrane, 置於 5% 之脫脂牛奶中 脫脂奶粉溶於 PBST buffer (PBS 加入 0.1% Tween-20), 作為空白處抑制 (blocking), 於室溫下搖晃 1 小時, 接著以 PBST buffer, 清洗 5 分鐘 2 次, 加入一級抗體 (primary antibody), 於 4C 下作用隔夜, 再以 PBST 清洗 8 分鐘 3 次後, 加入二級抗體 (secondary antibody) 於室溫下作用 1 小時, 經 PBST 清洗 8 分鐘 3 次後, 以 ECL kit 進行呈色, 以冷光影像分析系統進行分析 9. 基因表現分析 (1) 細胞 RNA 萃取 3T3-L1 脂肪細胞於不同時間點 (1 3 與 6 小時 ) 加入 50 g/ml 之苦瓜萃取物, 使用 TRIzol 試劑抽取細胞之 RNA 萃取方法如下: 將培養於 10 cm dish 之細胞先以滅菌 PBS 沖洗兩次, 加入 1 ml TRIzol 溶液, 將細胞刮下, 以 pipette 反覆沖打細胞數次後, 將溶液置於滅菌之 eppendorf 中, 置於室溫 3 分鐘 再加入 0.2 ml 之 choloform 充分搖晃後, 置於室溫 3 分鐘, 再於 4 以 rpm 離心 15 分鐘使其分層 取上層上清液置於另一滅菌之 eppendorf 中, 加入等量之 isopropanol 混和均勻, 置於室溫 3 分鐘 再於 4 以 rpm 離心 10 分鐘後, 去除上清液, 並以 75% 乙醇 (300 μl) 清洗, 再於 4 以 7500 rpm 離心 5 分鐘 倒掉液體, 置於無菌操作台風乾 ( 約 10 分鐘 ), 之後將沉澱物加入 50 L 之 DEPC-H2O, 充分混和均勻使 RNA 完全溶解 (2) RNA 濃度測定 RNA 濃度測定, 是利用分光光度計測定樣品 260 nm 和 280 nm 波長之吸光值, 並利用公式計算樣品中 total RNA 含量 利用 DEPC-H2O 作為 blank, 並於 eppendorf 內加入 2 L 的 total RNA 與 998 L DEPC-H2O 混和均勻後測得吸光值, 計算 OD260/OD280 比值 ( 1.6 品質較佳 ), 隨後利用公式進行換算 Total RNA (g) = OD26040g/mL 稀釋倍數 (500)/1000 (3) 反轉錄反應 (reversr transcription) 每一樣品取 200 ng 之 RNA 溶液進行反轉錄反應製備 cdna cdna 之合成藥劑是使用 high-capacity 9

13 cdna reverse transcription kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A) 進行, 而參與反轉錄反應試劑為 :RT random primers dntp mix RT buffer Nuclease-free H2O 與 MultiScribeTM reverse transcriptase 反轉錄反應條件為 25 反應 10 分鐘,37 反應 120 分鐘,85 反應 5 分鐘, 最後回到 4 即可 此 cdna 再利用 Applied Biosystems 公司提供之標準方法, 進行 real-time RT-PCR/SYBR Green 操作流程 (4) 即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (real-time RT-PCR) 即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之基因引子請參閱表 1 此方法使用 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A) 進行, 其實驗流程如下 : 反應溶液在 25 μl 之混和溶液中進行, 其反應試劑為 :2X Power SYBR Green PCR Master Mix 300 nm forward primer 300 nm reverse primer RNA template 再以 DDH2O 補足至 25μL, 分裝到專用的試管內, 每個樣品皆做三重複, 使用 real-time RT-PCR system 儀器進行分析, 在儀器之設定上將樣本的 detector 設定為 SYBR Green, 然後進行 real-time RT-PCR 反應 反應條件 :95 反應 10 分鐘, 再以 95 反應 15 秒與 60 反應 1 分鐘之條件進行 40 cycles 分析 SYBR Green 黏合在增幅產物所得之螢光訊號, 以該系統之軟體進行數據之分析 10. 統計分析實驗數據使用 SPSS 電腦統計軟體進行分析 變異數分析則以 Student's t-test 進行分析,p < 0.05 為具有顯著性差異 五 結果與討論 ( 一 ) 不同品系 部位與溶劑之苦瓜萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之胞內三酸甘油酯含量之影響造成肥胖之原因被認為是體內能量失衡, 進而以三酸甘油酯之形式累積於脂肪細胞中 因此, 三酸甘油酯常被作為脂質堆積之指標 (Zeng et al., 2012) 表 為不同品系 部位與溶劑之苦瓜萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之胞內三酸甘油酯含量之影響 表 2 為蘋果苦瓜果肉與種子萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之胞內三酸甘油酯含量之影響, 結果得知, 蘋果苦瓜種子甲醇萃取物 (MESMC) 在濃度 50 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 77.3%, 乙醇萃取物 (EESMC) 在濃度 100 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 82.1%, 而水 (WESMC) 丙酮 (AESMC) 與乙酸乙酯萃取物 (EAESMC) 並無抑制胞內三酸甘油酯含量之能力 ; 蘋果苦瓜果肉之水萃取物 (WEFMC) 在濃度 與 250 g/ml 時, 可分別降低胞內三酸甘油酯含量至 65.7% 48.6% 與 41.2%, 其中, 蘋果苦瓜果肉水萃取物抑制胞內三酸甘油酯之 IC50 為 95.9 g/ml, 而甲醇 (MEFMC) 乙醇 (EEFMC) 丙酮 (AEFMC) 與乙酸乙酯萃取物 (EAEFMC) 並不具有抑制胞內三酸甘油酯含量之作用 苦瓜明道選 72 萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之胞內三酸甘油酯含量之影響, 由表 3 得知, 苦瓜明道選 72 種子之水 (WESMCMDS72) 與乙醇萃取物 (EESMCMDS72) 在濃度 100 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 71.0% 與 60.9%, 甲醇 (MESMCMDS72) 丙酮 (AESMCMDS72) 與乙酸乙酯萃取 10

14 物 (EAESMCMDS72) 對胞內三酸甘油酯含量並無抑制之作用 ; 苦瓜明道選 72 果肉水萃取物 (WEFMCMDS72) 在濃度 50 g/ml 時, 顯著降低胞內三酸甘油酯含量至 83.9%, 甲醇萃取物 (MEFMCMDS72) 於濃度 250 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 64.2%, 而乙醇 (EEFMCMDS72) 丙酮 (AEFMCMDS72) 與乙酸乙酯萃取物 (EAEFMCMDS72) 並不具有抑制胞內三酸甘油酯之能力 表 4 為苦瓜沖繩選 33 萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之胞內三酸甘油酯含量之影響, 結果顯示, 苦瓜沖繩選 33 種子之乙酸乙酯萃取物 (EAESMCONS33) 在濃度 50 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 89.3%, 而水 (WESMCONS33) 甲醇 (MESMCONS33) 乙醇 (EESMCMDS72) 與丙酮萃取物 (AESMCONS33) 對胞內三酸甘油酯含量並無抑制作用 ; 苦瓜沖繩選 33 果肉之水 (WEFMCONS33) 與甲醇萃取物 (MEFMCONS33) 在濃度 100 g/ml 時, 可降低胞內三酸甘油酯含量至 60.2% 與 89.3%, 乙醇萃取物 (EEFMCONS33) 於濃度 250 g/ml 時, 顯著降低胞內三酸甘油酯含量至 89.3%, 而丙酮 (AEFMCONS33) 與乙酸乙酯萃取物 (EAEFMCONS33) 並無降低胞內三酸甘油酯含量之能力 綜合上述結果, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 具有最佳抑制胞內三酸甘油酯之能力, 故後續研究將針對蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC), 探討其對 3T3-L1 脂肪細胞油紅染色之影響 ( 二 ) 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之油紅 (oil red O) 染色之影響油紅染色 (OROSM) 為評估脂肪細胞數目的方法之一 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 3T3-L1 脂肪細胞之油紅 (oil red O) 染色之影響, 由圖 3 顯示, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 於濃度 與 250 g/ml 時, 皆可顯著抑制脂肪細胞數目 (p0.05), 其降低程度分別為 86.1% 85.1% 82.7% 85.8% 與 86.7% 結果得知, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 確實具有抑制脂肪細胞數目之作用 ( 三 ) 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞之 GPDH 酵素活性之影響甘油 -3- 磷酸去氫酶 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPDH) 為三酸甘油酯之關鍵合成酶 (Wise and Green, 1979) 圖 4 為蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 3T3-L1 脂肪細胞 GPDH 酵素活性之影響, 結果顯示, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 以 與 250 g/ml 之濃度處理 3T3-L1 脂肪細胞 48 小時後, 其降低能力分別為 87.1% 20.3% 30.6% 11.1% 與 14.4%, 且各濃度間皆具有顯著降低脂肪細胞胞內 GPDH 酵素活性之作用 (p0.05) ( 四 ) 蘋果苦瓜果肉水萃取物對調控脂肪細胞分化 脂質分解 脂肪酸氧化與脂質生合成相關訊息分子之影響圖 5 6 與 7 為蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對脂肪細胞分化 脂質生合成 脂質代謝與脂肪細胞激素相關基因表現之影響 在脂肪細胞分化相關基因表現上 ( 圖 5), 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 PPAR SREBP-1c C/EBP 和 C/EBP 皆具有抑制之作用,PPAR 在 1 與 6 小時皆能顯著被抑制 (p0.05), 且 1 小時之抑制作用最佳 (0.66);SREBP-1c C/EBP 與 C/EBP 在 1 至 6 小時皆能顯著被抑制 (p0.05), 且最佳抑制作用分別為 0.43 (3 小時 ) 0.40 (1 小時 ) 與 0.37 (6 小時 ) ATGL 11

15 HSL CPT-1 和 ACO 為脂質分解與脂肪酸氧化之相關基因, 由圖 6 得知, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 ATGL HSL CPT-1 與 ACO 等基因表現皆有提升之作用, 且其最佳提升作用分別為 2.06 (3 小時 ) 1.91 (3 小時 ) 1.99 (6 小時 ) 和 1.66 (3 小時 ) (p0.05) 圖 7 為調控脂質生合成與脂肪細胞激素之基因表現, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 FAS 之基因表現具有抑制之作用 FAS 在 1 至 6 小時皆能顯著抑制其基因表現 (p0.05), 且在 6 小時達最大抑制作用 (0.33); 在調控脂肪細胞激素相關基因表現上, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對 adiponectin 之基因表現在 1 與 6 小時皆具有顯著增加之作用 (p0.05), 且在 1 小時可顯著增加至 1.41; 而 leptin 則在 3 小時顯著被抑制, 其抑制效果為 0.62 (p0.05) PPAR C/EBP C/EBP 與 SREBP-1c 為脂肪細胞分化之重要因子 (Cristancho and Lazar, 2011) 過去研究指出,C/EBP 表現是在脂肪細胞分化的早期, 且會活化與脂肪細胞分化末期相關之 C/EBP 與 PPAR 轉錄作用 (MacDougald et al., 1995; Rosen et al., 2000) 而 SREBP-1c 會與 PPAR 共同作用, 促進脂肪細胞分化 (Kim and Spiegelman, 1996) SREBP-1c 除可調控脂肪細胞分化, 亦存在於肝臟與脂肪細胞中, 參與調節脂肪酸和膽固醇生合成, 為脂質代謝的重要調節子 (Izumi et al., 2009) FAS 與 ACC 是體內重要的脂肪酸合成酵素, 為 SREBP-1c 的下游標的基因 (Lee et al., 2010) 研究指出, 在高脂飲食誘導小鼠肥胖之試驗模式下,FAS 之表現會顯著較正常飲食小鼠為高 (Ho et al., 2012) ACC 為脂肪酸合成之速率限制酵素,Ejaz 等 (2009) 研究指出, 抑制高脂飲食所誘導肥胖小鼠體內 ACC 的表現, 確實能達到降低體重之目的 ( 五 ) 蘋果苦瓜果肉水萃取物對調控 MAPK 路徑與脂質生合成相關蛋白質表現之影響 MAPK 路徑在脂肪細胞分化扮演重要之角色,MAPK 家族包含了 ERK JNK 與 p38, 研究發現, ERK JNK 與 AMPK 的磷酸化, 會抑制脂肪細胞特定轉錄因子 C/EBP 家族與 PPAR 的表現 (Zhang et al.,2013) 此外,Hu 等 (1996a) 指出,ERK 的磷酸化會促進 PPAR 磷酸化, 使脂肪細胞的分化受到抑制 研究指出, 利用 JNK 特定抑制子 (SP600125) 抑制 JNK 之表現, 會顯著增加 C/EBP 與 PPAR 之表現, 並增加脂質堆積之情形 (Zhang et al.,2013) 圖 與 11 為蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 對調控 MAPK 路徑與脂質生合成相關蛋白質表現之影響 在 MAPK 路徑相關蛋白質表現上, 由圖 8 得知, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 在 6 小時皆能顯著提升 p-erk 之蛋白質表現量 (p0.05), 其提升作用為 1.12;p-JNK 在 6 與 9 小時皆具顯著提升作用 (p0.05), 且在 6 小時提升作用可達 1.16 ( 圖 9) 在脂質生合成相關蛋白質表現上, 圖 10 顯示, 蘋果苦瓜果肉水萃取物 (WEFMC) 在 1 至 9 小時皆能顯著增加 adiponectin 之蛋白表現量 (p0.05), 且在 3 小時可提升至 1.45; 而 FAS 之蛋白質表現於 3 至 9 小時皆具抑制作用 (p0.05), 且抑制作用在 3 小時可達 0.62 ( 圖 11) Adiponectin 為脂肪組織所分泌的胜肽荷爾蒙, 參與醣類與脂質代謝, 以維持能量平衡 (Yamauchi et al., 2002) Rakoff-Nahoum (2006) 指出,adiponectin 能藉由活化 AMPK 與 PPAR 代謝路徑, 增加脂肪酸氧化 促進肌肉攝入葡萄糖與抑制糖質新生, 進而增加胰島素敏感性 Izadi 等 (2011) 指出, 血脂異常會增加癌症的發生風險, 而 adiponectin 能增加體內高密度脂蛋白濃度, 並降低三酸甘油酯與低密度脂蛋白濃度, 進而降低癌症之 12

16 發生風險 六 參考文獻 衛生福利部 Caballero, B. (2007). The global epidemic of obesity: an overview. Epidemiologic Reviews 29, 1-5. Chang, C.I., Tseng, H.I., Liao, Y.W., Yen, C.H., Chen, T.M., Lin, C.C., Cheng, H.L. (2011). In vivo and in vitro studies to identify the hypoglycaemic constituents of Momordica charantia wild variant WB24. Food Chemistry 125, Cheng, H.L., Kuo, C.Y., Liao, Y.W., Lin, C.C. (2012). EMCD, a hypoglycemic triterpene isolated from Momordica charantia wild variant, attenuates TNF-α-induced inflammation in FL83B cells in an AMP-activated protein kinase-independent manner. European Journal of Pharmacology 689, Chuang, C.Y., Hsu, C., Chao, C.Y., Wein, Y.S., Kuo, Y.H., Huang, C.J. (2006). Fractionation and identification of 9c, 11t, 13t-conjugated linolenic acid as an activator of PPAR alpha in bitter gourd (Momordica charantia L.). Journal of Biomedical Science 13, Cristancho, A.G., Lazar, M.A. (2011). Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 12, Ejaz, A., Wu, D., Kwan, P., Meydani, M. (2009). Curcumin inhibits adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes and angiogenesis and obesity in C57/BL mice. The Journal of Nutrition 139, Farhat, T., Iannotti, R.J., Simons-Morton, B.G. (2010). Overweight, obesity, youth, and health-risk behaviors. American Journal of Preventive Medicine 38, Finer, N. (2011). Medical consequences of obesity. Medicine 39, Hsu, C. L., Yen, G. C. (2008). Phenolic compounds: Evidence for inhibitory effects against obesity and their underlying molecular signaling mechanisms. Molecular Nutrition & Food Research 52, Hsu, C., Hsieh, C.L., Kuo, Y.H., Huang, C.J. (2011). Isolation and identification of cucurbitane-type triterpenoids with partial agonist/antagonist potential for estrogen receptors from Momordica charantia. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59, Hsu, C.L., Yen, G.C. (2007). Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, Hu, E., Kim, J.B., Sarraf, P., Spiegelman, B.M. (1996a). Inhibition of adipogenesis through MAPkinase-mediated phosphorylation of PPAR gamma. Science 274, Izadi, V., Farabad, E., Azadbakht, L. (2012). Serum adiponectin level and different kinds of cancer: a review of recent evidence. ISRN oncology doi: /2012/ Izumi, M., Seki, T., Iwasaki, K., Sakamoto, K. (2009). Chinese herbal medicine Yi-Gan-San decreases the lipid accumulation in mouse 3T3-L1 adipocytes by modulating the activities of transcription factors SREBP-1c and FoxO1. The Tohoku Journal of Experimental Medicine 219, Kim, J.B., Spiegelman, B.M. (1996). ADD1/SREBP1 promotes adipocyte differentiation and gene expression linked to fatty acid metabolism. Genes & Development 10, Klomann, S.D., Mueller, A.S., Pallauf. J., Krawinkel, M.B. (2010). Antidiabetic effects of bitter gourd extracts in insulin-resistant db/db mice. The British Journal of Nutrition 104, Kral, T.V.E., Rauh, E.M. (2010). Eating behaviors of children in the context of their family environment. Physiology & Behavior 100, Krawinkel, M.B., Keding, G.B. (2006). Bitter gourd (Momordica charantia): A dietary approach to hyperglycemia. Nutrition Reviews 74, Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, Lee, I., Kim, J., Ryoo, I., Kim, Y., Choo, S., Yoo, I., Min, B., Na, M., Hattori, M., Bae, K. (2010). Lanostane triterpenes from Ganoderma lucidum suppress the adipogenesis in 3T3-L1 cells through down-regulation of SREBP-1c. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 20, Li, C.J., Tsang, S.F., Tsai, C.H., Tsai, H.Y., Chyuan, J.H., Hsu, H.Y. (2012). Momordica charantia Extract Induces Apoptosis in Human Cancer Cells through Caspase- and Mitochondria-Dependent Pathways. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. doi: /2012/ Lii, C.K., Chen, H.W., Yun, W.T., Liu, K.L. (2009). Suppressive effects of wild bitter gourd (Momordica charantia 13

17 Linn. var. abbreviata ser.) fruit extracts on inflammatory responses in RAW macrophages. Journal of Ethnopharmacology 122, MacDougald, O.A., Cornelius, P., Liu, R., Lane, M.D. (1995). Insulin Regulates Transcription of the C/EBP α, β, and δ genes in fully-differentiated 3T3-L1 Adipocytes. The Journal of Biological Chemistry 270, Mariela, G., Itamar, R. (2011). Present and Future: Pharmacologic Treatment of Obesity. Journal of Obesity, Article ID , doi: /2011/ Matsui S, Yamane T, Takita T, Oishi Y, Kobayashi-Hattori K. (2013). The hypocholesterolemic activity of Momordica charantia fruit is mediated by the altered cholesterol- and bile acid-regulating gene expression in rat liver. Nutrition Research 33, McNamara, D. J. (2000). Dietary cholesterol and atherosclerosis. Biochimica et Biophysica Acta 1529, Moller, D.E., Kaufman, K.D. (2005). Metabolic syndrome: a clinical and molecular perspective. Annual Review of Medicine 56, Moura, E.C., Claro, R.M. (2012). Estimates of obesity trends in Brazil, International Journal of Public Health 57, Muller, H., Lindman, A.S., Brantsaeter, A.L., Pedersen, J.I. (2003). The serum LDL/HDL cholesterol ratio is influenced more favorably by exchanging saturated with unsaturated fat than by reducing saturated fat in the diet of women. Journal of Nutrition 133, Nerurkar, P.V., Lee, Y.K., Nerurkar, V.R. (2010). Momordica charantia (bitter melon) inhibits primary human adipocyte differentiation by modulating adipogenic genes. BMC Complementary and Alternative Medicine 10, 34. Pischon, T., Boeing, H., Hoffmann, K., Bergmann, M., Schulze, M.B., Overvad, K., van der Schouw, Y.T., Spencer, E., Moons, K.G., Tjønneland, A, Halkjaer, J., Jensen, M.K., Stegger, J., Clavel-Chapelon, F., Boutron-Ruault, M.C., Chajes, V., Linseisen, J., Kaaks, R., Trichopoulou, A., Trichopoulos, D., Bamia, C., Sieri, S., Palli, D., Tumino, R., Vineis, P., Panico, S., Peeters, P.H., May, A.M., Bueno-de-Mesquita, H.B., van Duijnhoven, F.J., Hallmans, G., Weinehall, L., Manjer, J., Hedblad, B., Lund, E., Agudo, A., Arriola, L., Barricarte, A., Navarro, C., Martinez, C., Quirós, J.R., Key, T., Bingham, S., Khaw, K.T., Boffetta, P., Jenab, M., Ferrari, P., Riboli, E. (2008). General and Abdominal Adiposity and Risk of Death in Europe. New England Journal of Medicine 359, Raj, M., Kumar, R.K. (2010). Obesity in children & adolescents. The Indian Journal of Medical Research 132, Rakoff-Nahoum, S. (2006). Why cancer and inflammation? Yale Journal of Biology and Medicine 79, Ramirez-Zacarias, J. L., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. (1992) Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intercytoplasmic lipids with Oil Red O. Histochemistry 97, Rosen, E.D., Walkey, C.J., Puigserver, P., Spiegelman, B.M. (2000). Transcriptional regulation of adipogenesis. Genes & Development 14, Sirintorn, Y.A., Sirichai, A., YAO, C.Y., Polkit, S., Sophon. R., Hsu, W.H. (2006). Slow acting protein extract from fruit pulp of Momordica charantia with insulin secretagogue and insulinomimetic activities. Biological & Pharmaceutical Bulletin 29, Tabata, K., Hamano, A., Akihisa, T., Suzuki, T. (2012). Kuguaglycoside C, a constituent of Momordica charantia, induces caspase-independent cell death of neuroblastoma cells. Cancer Science 103, Wensaas, A. J., Rustan, A. C., Rokling-Andersen, M. H., Caesar, R., Jensen, J., Kaalhus, O., Graff, B. A., Gudbrandsen, O. A., Berge, R. K., Drevon, C. A. (2009). Dietary supplementation of tetradecylthioacetic acid increases feed intake but reduces body weight gain and adipose depot sizes in rats fed on high-fat diets. Diabetes, Obesity and Metabolism 11, Wise, L.S., Green, H. (1979). Participation of one isozyme of cytosolic glycerophosphate dehydrogenase in the adipose conversion of 3T3 cells. The Journal of Biological Chemistry 254, Yamauchi, T., Kamon, J., Minokoshi, Y., Ito, Y., Waki, H., Uchida, S., Yamashita, S., Noda, M., Kita, S., Ueki, K., Eto, K., Akanuma, Y., Froguel, P., Foufelle, F., Ferre, P., Carling, D., Kimura, S., Nagai, R., Kahn, B.B., Kadowaki, T. (2002). Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nature Medicine 8, Zeng, X.Y., Zhou, X., Xu, Jun., Chan, S.M.H., Xue, C.L., Molero. J.C., Ye, J.M. (2012). Screening for the efficacy on lipid accumulation in 3T3-L1 cells is an effective tool for the identification of new anti-diabetic compounds. Biochemical Pharmacology 84, Zhang, T., Sawada, K., Yamamoto, N., Ashida, H. (2013). 4-Hydroxyderricin and xanthoangelol from Ashitaba (Angelica keiskei) suppress differentiation of preadiopocytes to adipocytes via AMPK and MAPK pathways. Molecular Nutrition and Food Rsearch doi: /mnfr

18 蘋果苦瓜苦瓜明道選 72 苦瓜沖繩選 33 圖 1 蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33 之外觀 Figure 1. The pictures of Momordica charantia, Momordica charantia MDS72, and Momordica charantia ONS33. 蘋果苦瓜果肉 苦瓜明道選 72 果肉 苦瓜沖繩選 33 果肉 蘋果苦瓜種子 苦瓜明道選 72 種子 苦瓜沖繩選 33 種子 圖 2 蘋果苦瓜 苦瓜明道選 72 與苦瓜沖繩選 33 果肉和種子之粉末 Figure 2. The powders of fruit and seed from Momordica charantia, Momordica charantia MDS72, and Momordica charantia ONS33. 15

19 120 OROSM (% of control) Concentration (g/ml) 圖 3 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞油紅染色之影響 Figure 3. Effect of WEFMC on oil red O stained material (OROSM) in 3T3-L1 adipocytes. Cells were treated with concentration g/ml WEFMC for 48h at 37 o C in a humidified 5% CO 2 incubator. The reported values are the mean SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. 120 GPDH activity (% of control) Concentration (g/ml) 圖 4 蘋果苦瓜水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞 GPDH 活性之影響 Figure 4. Effect of WEFMC on GPDH activity in 3T3-L1 adipocytes. Cells were treated with concentration g/ml WEFMC for 48h at 37 o C in a humidified 5% CO 2 incubator. The reported values are the means SD (n=3) p<0.05 indicates significant difference from the control. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. 16

20 PPAR Relative mrna levels SREBP-1c Relative mrna levels Time (h) Time (h) C/EBP Relative mrna levels C/EBP Relative mrna levels Time (h) Time (h) 圖 5 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 PPAR SREBP-1c C/EBP 與 C/EBP 基因表現之影響 Figure 5. Effect of WEFMC on gene expressions of PPAR, SREBP-1c, C/EBP, and C/EBP in 3T3-L1 adipocytes. The reported values are the means SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. The values of PPAR, SREBP-1c, C/EBP, and C/EBP were normalized to the value of GAPDH. 17

21 ATGL Relative mrna levels HSL Relative mrna levels Time (h) Time (h) CPT-1 Relative mrna levels ACO Relative mrna levels Time (h) Time (h) 圖 6 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 ATGL HSL CPT-1 與 ACO 基因表現之影響 Figure 6. Effect of WEFMC on gene expressions of ATGL, HSL, CPT-1, and ACO in 3T3-L1 adipocytes. The reported values are the means SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. The values of ATGL, HSL, CPT-1, and ACO were normalized to the value of GAPDH. 18

22 FAS Relative mrna levels Adiponectin Relative mrna levels Time (h) Time (h) Leptin Relative mrna levels Time (h) 圖 7 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 FAS adiponectin 與 leptin 基因表現之影響 Figure 7. Effect of WEFMC on gene expressions of FAS, adiponectin, and leptin in 3T3-L1 adipocytes. The reported values are the means SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. The values of FAS, adiponectin, and leptin were normalized to the value of GAPDH. 19

23 p-erk ERK 圖 8 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞 p-erk 蛋白質表現之影響 Figure 8. Effect of WEFMC on protein expression of p-erk in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 adipocytes were incubated with 50 g/ml of WEFMC for 0-9 h at 37 C in 5% CO 2 incubator. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. The relative protein expression was quantified using densitometry and Image J software, and calculated in reference to the ERK reference bands (n=3). 20

24 p-jnk JNK 圖 9 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞 p-jnk 蛋白質表現之影響 Figure 9. Effect of WEFMC on protein expression of p-jnk in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 adipocytes were incubated with 50 g/ml of WEFMC for 0-9 h at 37 C in 5% CO 2 incubator. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. The relative protein expression was quantified using densitometry and Image J software, and calculated in reference to the JNK reference bands (n=3). 21

25 Adiponectin -actin 圖 10 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞 adiponectin 蛋白質表現之影響 Figure 10. Effect of WEFMC on protein expression of adiponectin in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 adipocytes were incubated with 50 g/ml of WEFMC for 0-9 h at 37 C in 5% CO 2 incubator. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. The relative protein expression was quantified using densitometry and Image J software, and calculated in reference to the -actin reference bands (n=3). 22

26 FAS -actin 圖 11 蘋果苦瓜果肉水萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞 FAS 蛋白質表現之影響 Figure 11. Effect of WEFMC on protein expression of FAS in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 adipocytes were incubated with 50 g/ml of WEFMC for 0-9 h at 37 C in 5% CO 2 incubator. WEFMC, water extract from the fruit of Momordica charantia. The relative protein expression was quantified using densitometry and Image J software, and calculated in reference to the -actin reference bands (n=3). 23

27 表 1 即時定量聚合酶連鎖反應之基因引子對 Table 1. Gene specific primer used for real-time RT-PCR Gene name Sequence GAPDH PPAR C/EBP C/EBP SREBP-1c FAS ATGL ACO CPT-1 HSL Leptin Adiponectin Forward 5 -GTATGACTCCACTCACGGCAAA-3 Reverse 5 -GGTCTCGCTCCTGGAAGATG-3 Forward 5 -TTTTCAAGGGTGCCAGTTTCGATCC-3 Reverse 5 -AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3 Forward 5 -CGCAAGAGCCGAGATAAAGC-3 Reverse 5 -CACGGCTCAGCTGTTCCA-3 Forward 5 -GGGGTTGTTGATGTTTTTGG-3 Reverse 5 -CGAAACGGAAAAGGTTCTCA-3 Forward 5 -GGAGCCATGGATTGCACATT-3 Reverse 5 -GCTTCCAGAGAGGAGGCCAG-3 Forward 5 -TGGGTTCTAGCCAGCAGAGT-3 Reverse 5 -TACCACCAGAGACCGTTATGC-3 Forward 5 -GGTGCCAACATTATTGAGGTG-3 Reverse 5 -AAACACGAGTCAGGGAGATGC-3 Forward 5 -GCCTTTGTTGTCCCTATCCG-3 Reverse 5 -TACATACGTGCCGTCAGGC-3 Forward 5 -TATCGCCACCTGCTGAACC-3 Reverse 5 -TTGAAGGTGACGAAGGTGGT-3 Forward 5 -TCGGGGAGCACTACAAACG-3 Reverse 5 -CACGCAACTCTGGGTCTATGG-3 Forward 5 -AGGATGTGAGGGGTGATGTGA-3 Reverse 5 -TGAGGTGACCAAGGTGGCATAG-3 Forward 5 -GTCTCAGCTGTCGGTCTTCCCCT-3 Reverse 5 -CCCTGGCTTTATGCTCTTTGC-3 24

28 表 2 蘋果苦瓜不同溶劑萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞抑制胞內三酸甘油酯之影響 Table 2. Effect of different solvent extracts of Momordica charantia on the inhibition of intracellular triglyceride in 3T3-L1 adipocytes Percentage (%) Different solvent extracts (g/ml) WESMC 100.0± ± ± ±6.3 MESMC 100.0± ± ± ±2.4 EESMC 100.0± ± ± ±5.5 AESMC 100.0± ± ± ±6.3 EAESMC 100.0± ± ± ±17.3 WEFMC 100.0± ± ± ±2.5 MEFMC 100.0± ± ± ±7.5 EEFMC 100.0± ± ± ±7.0 AEFMC 100.0± ± ± ±7.1 EAEFMC 100.0± ± ± ±5.0 Percentage (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 adipocytes were incubated with g/ml of different solvent extracts of bitter melon for 48 h at 37C in 5% CO 2 incubator. 25

29 表 3 苦瓜明道選 72 不同溶劑萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞抑制胞內三酸甘油酯之影響 Table 3. Effect of different solvent extracts of Momordica charantia MDS72 on the inhibition of intracellular triglyceride in 3T3-L1 adipocytes Percentage (%) Different solvent extracts (g/ml) WESMCMDS ± ± ± ±13.1 MESMCMDS ± ± ± ±23.0 EESMCMDS ± ± ± ±8.8 AESMCMDS ± ± ± ±11.9 EAESMCMDS ± ± ± ±10.8 WEFMCMDS ± ± ± ±11.1 MEFMCMDS ± ± ± ±3.5 EEFMCMDS ± ± ± ±17.9 AEFMCMDS ± ± ± ±13.5 EAEFMCMDS ± ± ± ±16.3 Percentage (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 adipocytes were incubated with g/ml of different solvent extracts of bitter melon for 48 h at 37C in 5% CO 2 incubator. 26

30 表 4 苦瓜沖繩選 33 不同溶劑萃取物對 3T3-L1 脂肪細胞抑制胞內三酸甘油酯之影響 Table 4. Effect of different solvent extracts of Momordica charantia ONS33 on the inhibition of intracellular triglyceride in 3T3-L1 adipocytes Percentage (%) Different solvent extracts (g/ml) WESMCONS ± ± ± ±7.7 MESMCONS ± ± ± ±5.1 EESMCONS ± ± ± ±4.1 AESMCONS ± ± ± ±1.7 EAESMCONS ± ± ± ±2.9 WEFMCONS ± ± ± ±3.4 MEFMCONS ± ± ± ±7.1 EEFMCONS ± ± ± ±4.5 AEFMCONS ± ± ± ±2.9 EAEFMCONS ± ± ± ±9.5 Percentage (%) is expressed as control at 100%. Data are expressed as the mean SD (n=3). p<0.05 indicates significant difference from the control. 3T3-L1 adipocytes were incubated with g/ml of different solvent extracts of bitter melon for 48 h at 37C in 5% CO 2 incubator. 27

31 國科會補助專題研究計畫項下出席國際學術會議心得報告 計畫編號 計畫名稱出國人員姓名 會議時間 會議名稱 發表論文題目 NSC B 日期 :102 年 09 月 14 日 以細胞及動物模式探討新育種苦瓜對脂質生合成之影響及其分子機轉探討服務機構徐慶琳中山醫學大學營養學系副教授及職稱 102 年 6 月 16 日至會議地點荷蘭阿姆斯特丹 102 年 6 月 20 日 2013 第 39 次高效能液相分離與相關技術國際研討會 th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques 牛奶榕根乙醇與水萃取物及其活性組成之抗氧化與抗癌活性 Antioxidant activity and anticancer effect of ethanolic and aqueous extracts of the roots of Ficus beecheyana and their active components 一 參加會議經過第 1 次之高效能液相分離與相關技術國際研討會首次的大會在 1973 年於瑞士舉行, 為迄今歷經超過 40 年歷史的國際研討會, 今年很高興能有機會參與第 39 次高效能液相分離與相關技術國際研討會在荷蘭阿姆斯特丹舉行, 此次在荷蘭的高效能液相分離與相關技術國際研討會是第三次在荷蘭舉行, 此年會先前僅由美國與歐洲國家之間輪流主辦, 之後有亞洲國家與澳洲加入主辦國家, 所以目前主辦國家是採全世界輪流主辦的方式, 以 2001 年迄今為例, 分別在 Maastricht, The Netherland (2001) Kyoto, Japan (2001) Montreal, Canada (2002) Nice, France (2003) Philadelphia, USA (2004) Stockholm, Sweden (2005) San Francisco, USA (2006) Gent, Belgium (2007) Baltimore, USA (2008) Kyoto, Japan (2008) Dresden, Germany (2009) Boston, USA (2010) Budapest, Hungary (2011) Dalian, China (2011) Anaheim, USA (2012) Amsterdam, The Netherlands (2013) Hobart, Australia (2013) New Orleans, USA (2014) Geneva, Switzerland (2015) San Francisco, USA (2016) 與 Prague, Czech Republic (2017) 等國家舉行 本次參加 2013 高效能液相分離與相關技術國際研討會, 是由於 2013 年 3 月份本人將自己的研究成果摘要投稿於大會中, 有幸能得到大會的論文發表接受函, 能參加 2013 高效能液相分離與相關技術國際研討會, 並發表壁報論文 (poster) 本次 2013 年高效能液相分離與相關技術國際研討會於 6 月 16 日至 6 月 20 日舉行, 本次會場在荷蘭阿姆斯特丹之 RAI Congress Centre 國際展覽會場舉行 在會議中來自全世界的學校 研究機構 食品公司 政府單位的人員參與, 大會規劃了許多 education sessions 與超過 900 篇的壁報論文 (poster) 發表 會議從 6 月 16 日開始, 展開一連五天的研討會, 會議第一天主要是讓會員辦理報到, 取得會議相關手冊資料, 同一時間已有部份的學術會 1

32 議活動開始展開 6 月 16 日報到並取得研討會之大會手冊後, 利用一些時間去規劃會議期間想要參加之活動, 由於大會安排許多的演講活動, 在同一時間同時安排不同的研究內容, 當下真的只能選擇對自己最有幫助與最感興趣的內容參與 本人在本次的會議中發表了一篇研究論文, 以 Poster 形式發表, 論文題目為牛奶榕根乙醇與水萃取物及其活性組成之抗氧化與抗癌活性 希望藉由此次研究論文發表機會, 將研究成果與其他國際研究學者交流, 提升自我的研究深度與國際視野 以下為壁報展示之時間與題目 : Presentation Title: Antioxidant activity and anticancer effect of ethanolic and aqueous extracts of the roots of Ficus beecheyana and their active components Presentation Number: FOOD09_WE Session Title: Food Session Time: 6/19/2013 高效能液相分離與相關技術國際研討會是一個以高效液相色譜法為主的科學討論研討會, 其亦探討相關分離技術, 例如 :electrophoresis electrochromatography field-flow fractionation supercritical fluid chromatography 與 hyphenated techniques (LC/MS 與 CE/MS) 本次大會安排了許多的演講, 包括 :6 月 16 日的 Plenary Session (PL1 Fight against Cancer PL2 Top Ten HPLC Column Myths PL3 Forget Everything, Except Mass Spectrometry 與 PL4 From Pore Level Reconstruction to Morphological Analysis of Eddy Dispersion);6 月 17 日的演講包括有 HYPERformance LC-Columns High-Impact LC-Pharmaceutical Analysis HPLC-MS-Quantitative LC-MS/Ionization Methods HYPERformance LC-Miniaturization HPLC-MS-Quantitative LC-MS HYPERformance LC-Fundamentals High-Impact LC-Environmental Analysis 與 HPLC-MS-Microscale LC-MS and CE-MS;6 月 18 日的演講包括有 HYPERformance LC-Columns High-Impact LC-Proteomics HPLC-MS-LC-MS of Small Molecules HYPERformance LC-Columns High-Impact LC-Proteomics HPLC-MS-LC-MS of Small Molecules HYPERformance LC-Instruments /Data Analysis High-Impact LC-Polymer Separations HPLC-MS-Biomedical LC-MS HYPERformance LC-Data Analysis High-Impact LC-Polymer Separations 與 HPLC-MS-Biopharmaceutical LC-MS;6 月 19 日的演講包括有 HYPERformance LC-Selectivity High-Impact LC-Food HPLC-MS-High-resolution MS HPLC-MS-LC-MS Data Analysis High-Impact LC-Metabolomics HPLC-MS-LC-MS Data Analysis 與 HPLC-MS-LC-MS of Large Molecules ; 6 月 20 日的演講包括有 HYPERformance LC-LCxLC High-Impact LC-Metabolomics HPLC-MS-LC-MS of Large Molecules HYPERformance LC-SFC High-Impact LC-Forensics HPLC-MS-LCxLC-MS High-Impact LC-Sample Preparation HPLC-MS-Microscale LC-MS Plenary Session (PL5 Interfacing Liquid Chromatography with Mass Spectrometry: From Zero Plate Chromatography to Multidimensional Approaches PL6 Microfluidic Separation Devices Coupled to Mass Spectrometry PL7 Developments in the Design and Usage of High Performance Ion-Exchange 2

33 Columns 與 PL8 High-Impact Liquid Chromatography) 此外在 posters 海報發表上, 今年共有超過 900 篇各類主題的 posters 發表, 包括 :Biomedical Biopharmaceutical Biotechnology Column efficiency CE-MS Capillary electrophoresis Chip-based separations Chiral separations Chemometrics Columns Environmental Food Forensic Fundamentals Glycans HILIC High-resolution MS Instrumentation LC LC LC-MS principles LC-MS of small molecules Lipids Mass spectrometry Metabolomics Monoliths MS data analysis Nanomaterials Pharmaceutical Polymers Proteomics Quantitative MS Retention mechanisms Sample preparation Selectivity Sub- and supercritical-fluid chromatography 與 Stationary phases 高效能液相分離與相關技術國際研討會是國際上年度重要的成分分析與分離技術大會, 國際分析技術設備的生產廠商, 例如 :Shimadzu Agilent Waters 與 Thermo 均是本年度的大型贊助廠商, 亦提供最新穎分離技術於大會中發表展示, 例如 :Agilent 公司在大會發表最新的 Hybrid SFC/UHPLC system;waters 公司則在大會上以全球首次發表的方式, 提出公司最新穎的分離管柱 二 與會心得高效能液相分離與相關技術國際研討會是一個從事成分分析相關研究的人員, 每年可以齊聚一堂的機會平台, 亦是一個可以讓自己增廣見聞的最好機會 本次有機會到荷蘭阿姆斯特丹參加 2013 年高效能液相分離與相關技術國際研討會, 由衷感謝國科會在出國經費之補助, 使得此次參加國際學術研討會能順利成行 利用這個國際交流的機會互相分享研究成果與研究心得, 與國際學者交換彼此的研究想法與經驗, 由本次的學術交流讓我獲得很棒的學習經驗與成長 期望未來能有機會繼續參加此類國際學術研討會, 亦期望國科會能持續支持補助年輕研究者在研究計畫與出席國際會議之經費, 我相信從中能獲得許多新知與觀念, 使自己能獲得更多之國際觀與想法 三 建議高效能液相分離與相關技術國際研討會舉辦至今已超過 40 年歷史, 每年都能吸引數許多專家學者前往參加, 我相信參加此國際活動對於食品分析相關領域的發展, 具有實質的應用 學術價值與意義, 是值得食品分析相關人員的參與 承蒙國科會補助開會所需的費用, 僅此致謝 四 攜回資料名稱及內容 年高效能液相分離與相關技術國際研討會大會手冊一本 2. 年會活動照片 3

34 國科會補助計畫衍生研發成果推廣資料表日期 :2013/09/14 國科會補助計畫 計畫名稱 : 以細胞及動物模式探討新育種苦瓜對脂質生合成之影響及其分子機轉探討計畫主持人 : 徐慶琳計畫編號 : B 學門領域 : 食品及農化 無研發成果推廣資料

35 年度 論 利 數 量 數 ( 數 ) 論 / 論 數 數 數 利金 說 數 列 參 力 論 利 參 力 理 論 / 論 / 數 數 數 利金 理

36 ( 量 理 力 益 列 ) 量 量 路 參 數

37 度 利 1. 度 說 100 說 2. 利 論 利 路 酶 量