80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No n Gly,n=2~10 PCs 中 Gly 巯基占很大的百分比, 能够结合重金属离子形成稳定的化合物谷胱甘肽和 PC 合成酶在重金属耐受性中的重要作用已经在拟南芥 Cd sensitive 突变体中得到

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像诸董
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(10):79 86 DOI: /j.cb 过表达谷胱甘肽合成酶基因增强烟草对镉的耐受性 1 贾翠翠季 1 静王 1 罡 2,3 田小卫 2 杜希龙 1 关春峰金 1 超 (1 天津大学环境科学与工程学院天津天津大学化工学院天津 ) (3 天津农学院园艺园林学院天津 ) 2 吴电云摘要随着工业的发展, 土壤污染问题愈发严重, 利用基因工程修复土壤技术备受青睐, 因此, 开发重金属应答中的限速酶基因, 将为植物修复重金属污染的土壤提供可应用的基因资源通过 RT PCR 及末端克隆方法获得枸杞谷胱甘肽合成酶 (Lyciumchinense,Glutathionesynthetase,LcGS) 基因, 采用半定量 RT PCR 分析了枸杞 LcGS 在不同时间镉 (Cd) 胁迫下表达量的变化,LcGS 表达量随着胁迫时间的延长而增强, 胁迫 9h 12h 和 24h 后 LcGS 表达量维持在较高水平同时构建了植物双元表达载体 pcambia2300 LcGS, 通过农杆菌介导的方法将 LcGS 基因转入烟草,PCR 证明了 LcGS 基因成功整合到烟草基因组中, 在 Cd 处理条件下, 转基因植株谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 植物螯合肽 (phytochelatins,pcs) 和叶绿素含量比对照组明显高, 即转基因植株对重金属的耐逆性比对照组更强, 因此, 过表达 GS 植物将是植物修复重金属污染的一个有效策略关键词枸杞 LcGS CdCl 2 胁迫 PCs 中图分类号 Q789 随着工业的发展和城市的建设, 环境污染物的排放量与日俱增, 土壤和水资源受到重金属的污染日益严重, 重金属污染不同于其它有机污染物可以通过化学降解或微生物降解等方法消除植物修复技术通过植物的吸收挥发根滤降解稳定等作用清除土壤或水体中的污染物, 进而达到净化环境的目的, 植物将重金属污染物积累到植物组织中, 从而降低土壤和水体中重金属的污染程度然而, 重金属抑制植物的生长和发育, 限制了植物修复的广泛应用因此, 开发和研究耐重金属离子的基因资源对植物修复技术具有重大的影响, 对修复土壤和水体具有深远的意义谷胱甘肽 (glutathione,gsh ) 是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要含量最丰富的含巯基的三肽 [1 2] [3] 1929 年由 Hopkins 等最早发现并对其予以收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( , ) 国家转基因生物新品种培育重大专项 (2014ZX B,2014ZX ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :jijingtjdx@163.com ;wanggangtjdx@126. com 命名 [3 4], 是一种由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 (L 谷氨酰 L 半胱氨酰甘氨酸 ) [5], 分子式为 C 10 H 17 O 6 SN 3 GSH 在生物体抵抗各种胁迫 ( 干旱真菌冷害重金属空气污染等 ) 的过程中起着重要的作用谷胱甘肽分为氧化型 (GSSG) 和还原型 (GSH) [4], GSH GSSG 的比值是反映植物体内谷胱甘肽活性的重要指标之一 [6] 还原型谷胱甘肽是植物体内重要的活性物质, 它参与二硫化物硫酯和硫醚的形成, 并能清除生物体内的活性氧 GSH 的生物合成分为两步, 分别是在 γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ ECS) 和谷胱甘肽合成酶 (GS) 的催化下, 由 ATP 供能完成的 : L Glutamate + L cysteine +ATP γ ECS L γ glutamyl L cysteine+adp +Pi (1) L γ Glutamyl L cysteine +glycine +ATP GS glutathione+adp +Pi (2) 谷胱甘肽是植物螯合肽的前体物质,PCs 组成了一个含巯基多肽家族, 具有共同的结构特征 (γ Glu Cys)

2 80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No n Gly,n=2~10 PCs 中 Gly 巯基占很大的百分比, 能够结合重金属离子形成稳定的化合物谷胱甘肽和 PC 合成酶在重金属耐受性中的重要作用已经在拟南芥 Cd sensitive 突变体中得到很好的证明, 例如,Cd sensitivecad2 突变体在谷胱甘肽生物合成中有缺陷 [7] 过量表达谷胱甘肽合成相关酶和 PC 合成酶可能是提高植物重金属耐受性的一个可行的方法, 但是,PC 合成酶并不是 PC 合成的限速酶, 在重金属离子的存在下才被激活 [8] 因此, 研究编码 GSH 合成相关酶的基因具有远大的前景在无重金属存在下, 谷胱甘肽合成的限速反应是 γ ECS, 因为这个酶的活性受到谷胱甘肽的反馈调节, 并依赖于 Cys 的可利用量 [9] 然而, 过表达 γ ECS 基因, 并没有提高拟南芥对 Cd 的耐受性 [10] 无重金属存在的条件下,GS 并不是谷胱甘肽合成的限速酶, 但是, 在重金属胁迫下,GS 调控谷胱甘肽合成发生了明显的变化 [9] 玉米的根经 Cd 胁迫后, GSH 含量下降,γ Glu Cys 得到了积累, 推测是由于 GS 活性降低的原因导致的 [11] 因此, 在 Cd 胁迫下,GS 酶可能是谷胱甘肽生物合成和 PCs 合成的限速酶, 过表达 GS 基因可能减缓 GSH 的损耗, 并增强 PC 的合成 γ ECS 和 GS 这两种酶及相应基因都已在细菌 [12 13] 酵母 [14 15] [16 17] 动物组织和植物组织中发现并纯化, 这两种酶在叶绿体和植物其它细胞器均有分布 [18] 自 1996 年 Ulmann 等首次从拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中克隆出了植物 GSH 合成酶基因以来, 植物谷胱甘肽合成酶基因陆续在野草莓 (Fragariavesca) 黄瓜 (Cucumissativus) 小麦 (Triticum aestivum ) 葡萄 (Vitisvinifera) 豌豆 (Pisum sativum) 玉米 (Zeamays ) 水稻 (Oryzasativa) 番茄 (Solanum lycopersicum) 百日菊 (Zinniaelegans) 大豆 (Glycinemax) 等植物中被克 [18] 隆 Ulmann 等研究发现拟南芥的 GS 为单基因, 并且含有编码定位到叶绿体的转运肽序列, 研究证明谷胱甘肽合成酶基因主要在细胞质中表达本研究克隆了枸杞谷胱甘肽合成酶基因, 对其序列进行生物信息学分析, 研究了枸杞 LcGS 基因在重金属胁迫下的表达量变化, 进而构建了植物双元表达载体, 并将该基因转入到烟草基因组中, 研究了过表达 GS 基因烟草对重金属胁迫的响应 1 材料与方法 1.1 材料枸杞植株为天津大学遗传工程研究所温室培养植物 RNA 抽提试剂 Trizol LATaqDNA 聚合酶 TaKaRa RNAPCR kit(amv)ver3.0 pmd18 T 克隆载体及 RT PCR 相关试剂均购自大连宝生物工程公司,SMART RACEcDNAAmplificationKit 购自 Clontech 公司大肠杆菌感受态 TOP10 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒 DNA marker I 购自天根公司, 引物合成及序列测定均由天津六合华大基因公司完成 1.2 LcGS 基因的克隆与序列分析剪取新鲜枸杞叶片,Trizol 法提取植物总 RNA 采用 TaKaRaRNA PCR kit(amv)ver3.0, 以枸杞总 RNA 为模板,adapter 为引物, 在 AMV 逆转录酶的作用下合成 cdna 第 1 链根据本课题组枸杞转录组数据库中获得的 LcGS 基因的部分序列信息, 根据已知的基因序列设计特异性引物 F2 及 5 RACE R1( 表 1) 取反转录合成的 cdna1μl 作模板进行第一轮 PCR PCR 反应体系 :1μlcDNA,2.5μl10 bufer,2μl dntps(2.5μmol/l),1μlf2(10μmol/l),1μlouter (10μmol/L),0.25μlLA Taqenzyme,ddH 2 O 补至 25μl PCR 反应条件如下 :94 3min;94 30s,55 30s,72 70s,34cycle;72 10min 取上述 PCR 反应液 1μl, 稀释 40 倍后取 1μl 作为第二轮 PCR 反应的模板,F2 和 Outer 作为引物 ( 表 1), 其它条件与第一轮 PCR 反应相同参照 SMARTRACEcDNAAmplication Kit 试剂盒说明书将枸杞总 RNA 反转录成 cdna 第 1 链, 按照如下反应体系进行 5 RACE 反应分离扩增 LcGS 基因的 5 末端, 反应体系为 :5 RACE READY cdna1.5μl,upm(10 )2.5μl,10 PCRBufer2.5μl, dntps( 各 2.5mmol/L)2μl,5 RACE R1(10μmol/L) 1μl,TransSTARTTaq0.25μl,ddH 2 O15.25μl 反应条件,94 30s,65 30s,72 3min,5cycles;94 30 s,68 30s,72 3min,30cycles PCR 扩增产物通过 1% 琼脂糖凝胶电泳验证, 回收目的片段将回收的 DNA 片段与 pmd18 T 载体连接, 构建重组质粒并转化到大肠杆菌感受态 TOP10, 对重组质粒进行菌落 PCR 鉴定, 以确定阳性克隆, 送往天津六合华大基因测序根据 3 RACE 及 5 RACEPCR 扩增得到的 LcGS 末端序列, 与已经获得的序列拼接获得该基因的全长, 根据拼接的全长序列设计引物对 F/Ful R, 以反转录 cdna 第 1 链为模板 PCR 反应体系为 :1μlcDNA, 2.5μl10 bufer,2μldntps(2.5μmol/l),1μlf (10μmol/L),1μlFul R(10μmol/L),0.25μlLATaq enzyme,ddh 2 O 补至 25μl 反应条件为 :94 3min;

3 2014,34(10) 贾翠翠等 : 过表达谷胱甘肽合成酶基因增强烟草对镉的耐受性 81 表 1 枸杞 LcGS 基因克隆引物序列 Table1 PrimersforcloningLcGSfrom Lycium chinense 引物 /Primer 序列 /Sequence(5 3 ) 引物 /Primer 序列 /Sequence(5 3 ) F ATGGGCAGTGGCTATTCCT R TCAAACCAAGTATATGCTGTCC F2 GAAGCCTGGATTGTATGTTATG Ful R TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG Actin F CCCAGATTATGTTTGAGACC Actin R ACTGAGCACAATGTTACCG 5 RACE R1 AGTAGTCTGGAGGTGAAAG outer GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG R2 adaptor TAAATGATAGGAAATTGAAGGA GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATG ACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 94 30s,55 30s,72 120s,34cycle;72 10min PCR 产物经过 1% 琼脂糖凝胶电泳验证, 回收目的片段并与 pmd18 T 载体连接, 转化到大肠杆菌感受态细胞 TOP10, 经菌落 PCR 验证后挑取 3 个阳性菌落测序 ORF(openreadingframe) 查找和翻译在 NCBI 的 ORFFinder(htp:// html) 完成的, 并推测其氨基酸序列利用 ExPASy 数据库 ProtParam 软件 (htp://web. expasy. org/ protparam/) 在线预测氨基酸序列的基本性质在 GenBank 中搜索不同植物 GS 的氨基酸序列, 与枸杞 LcGS 基因的氨基酸序列进行 ClustalW 多重序列比对 1.3 LcGS 基因在重金属胁迫下的表达与分析分别取长势一致的枸杞幼苗进行不同时间的重金属胁迫处理, 研究 LcGS 在 Cd 胁迫下表达量的变化将枸杞植株置于含有 500μmol/LCdCl 2 的营养液中分别处理 0h 3h 6h 9h 12h 24h 利用 Trizol 法分别提取枸杞总 RNA, 测定 RNA 的质量和浓度, 以等量的 RNA 为模板反转录 cdna, 取等量 cdna 进行 RT PCR 反应, 再取等量的 PCR 产物通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析实验进行 3 次重复, 通过比较目的条带的灰度判定基因表达的强弱 1.4 植物表达载体 pcambia2300 LcGS 的构建及其对烟草的遗传转化用 BamHI 和 SalI 双酶切 pmd18 T LcGS 重组质粒, 回收 LcGS 基因, 并将其连接到经同样酶切的植物表达载体 pcambia2300 质粒上, 利用 T4 连接酶于 22 连接 2h, 转化到大肠杆菌感受态细胞 TOP10, 经 BamHI 和 SalI 双酶切鉴定阳性重组子采用电击法将酶切鉴定的重组质粒 pcambia2300 LcGS 转入到农杆菌 C58 感受态细胞中, 运用叶盘法进行烟草的遗传转化, 转基因方法参见参考文献 [19] 1.5 转基因植株的分子检测利用 CTAB 法提取烟草基因组, 以烟草基因组为模板,F/R2 为引物进行 PCR 鉴定转基因阳性植株, 反应体系参照 1.2 节 1.6 转基因植株在重金属胁迫下的表达与分析选取 F2 代烟草转化植株 L1/L2 株系种子和野生型种子分别培养在蛭石上, 植株发芽一个月后挑取长势一致的烟草幼苗, 清洗根部, 将其培养在含有 100μmol/LCdCl 2 的 1/2Hoagland 营养液中, 培养 10 天后用去离子水冲洗植株根部, 去除根部附着的微量元素, 分别测定 Cd 处理前后根部 GSH 含量 PC2 含量和叶绿素含量 GSH 含量和 PC2 含量的测定参照 Gril [20] 等的方法 95% 乙醇提取总叶绿素, 测定方法参照参考文献 [21] 2 结果与分析 2.1 LcGS 基因克隆根据本课题组枸杞转录组数据库已知的部分序列设计特异性引物 F2 和 5 RACE R1, 利用 RACE 技术扩增获得 LcGS 基因的 3 和 5 末端序列 759bp 和 600bp 据此设计全长引物 F/Ful R 扩增得到 2081bp 的全长序列 ( 图 1), 将其连接到 pmd 18T 载体上测序, 利用 BlastX 进行序列比对, 确定扩增的基因为 LcGS 2.2 序列分析 LcGS 基因 cdna 序列全长 2160bp(GenBank 登录号 :NO.KJ808719), 包含一个 1683bp 的开放阅读框 (ORF), 编码 560 个氨基酸 ( 图 2),3 非编码区 398bp, 5 非编码区 79bp, 该基因的 cdna 序列还包含 24bp 的 polya 尾利用 ExPASy 数据库 ProtParam 软件在线分析的结果显示, 其蛋白分子量 62.65kDa, 理论等电点为 6.16

82 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.102014 图 1 RACE PCR 及 cdna 全长序列扩增产物凝胶电泳 Fig.

2 ORFpredictionofLcGSandaminoacidsequence 2.

4 82 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 1 RACE PCR 及 cdna 全长序列扩增产物凝胶电泳 Fig.1 ProductsofRACE PCRandful lengthcdna (a)3 RACE PCR (b)5 RACE PCR (c)amplificationofful lengthcdna Marker:MarkerI;1~2:ProductsofPCR 图 2 LcGS 基因 ORF 预测及其编码的氨基酸序列 Fig.2 ORFpredictionofLcGSandaminoacidsequence 2.3 LcGS 功能位点预测及多序列比对利用 NCBI 数据库 CDD 软件对 LcGS 的结合位点和结构域分析表明,LcGS 属于 eu GS 超家族, 活性位点是由 (R 214 S 237 G 454 R 536 )4 个氨基酸残基构成 ;ATP 结合位点由 14(M 218 I 229 K 395 V 447 K 449 G 445 N 448 Y 450 M 485 Q 486 R 487 I 488 E 511 K 538 ) 个氨基酸残基组成 ; 镁离子结合位点由 3 (E 230 N 232 E 453 ) 个氨基酸残基组成 ; 谷胱甘肽结合位点由 11(R 214 S 235 S 237 E 302 N 304 Q 308 R 356 Y 359 R 536 V 547 A 548 ) 个氨基酸残基组成 ; 此外,LcGS 二聚体单元 (dimerizationunit) 由 28 个氨基酸残基组成 (K 87 P 88 I 89 V 90 D 91 D 94 I 95 D 96 P 97 K 98 L 99 V 100 Q 101 K 102 L 103 A 104 Y 105 D 106 A L 117 V 118 G 119 V 132 D 133 M 134 V 135 H 136 ) 以枸杞 GS 氨基酸序列为参照, 从 NCBI 中查找同源序列, 选取多个同源序列进行多重序列比对, 结果显示 LcGS 与其他植物的相似性很高, 并发现 GS 存在 2 个高度保守区域 : 甘氨酸富集域和丙氨酸富集域 ( 图 3) 2.4 重金属胁迫下 LcGS 基因在枸杞叶片中的表达在重金属 CdCl 2 胁迫处理期间,3h 表达量没有明显的变化,6h 开始逐渐上调表达 LcGS, 但表达量变化不大,9h 表达量达到最大,12h 24h 表达量维持在较高水平因此,LcGS 基因在重金属胁迫下, 表达丰度发生变化, 不同时间的处理下表达量也有所不同, 说明该基

2014,34(10) 贾翠翠等 : 过表达谷胱甘肽合成酶基因增强烟草对镉的耐受性 83 图 3 枸杞和其它植物 GS 同源蛋白比对 Fig.

胁迫处理不同时间点的表达量 Fig.4 TheexpresionpaternsofLcGSinduced bycdcl 2 streswithdiferenttimes 2.

将目的片段连接并转化到大肠杆菌中, 提取质粒, 该质粒经 BamHI 和 SalI 双酶切得到 2045bp 的目的片段 ( 图 5), 说明植物表达载体 pcambia2300 LcGS 构建成功 2.

以烟草基因组为模板,F/R2 为引物,PCR 扩增出目的条带, 可推断这些植株是转基因阳性植株 ( 图 6) 图 5 pcambia2300 LcGS 表达载体双酶切验证 Fig.

5 2014,34(10) 贾翠翠等 : 过表达谷胱甘肽合成酶基因增强烟草对镉的耐受性 83 图 3 枸杞和其它植物 GS 同源蛋白比对 Fig.3 AlignmentofGShomologiesfrom Lycium chinenseandotherplants 因参与重金属胁迫的应答 ( 图 4) 图 4 LcGS 在 CdCl 2 胁迫处理不同时间点的表达量 Fig.4 TheexpresionpaternsofLcGSinduced bycdcl 2 streswithdiferenttimes 2.5 植物表达载体 pcambia2300 LcGS 的构建为构建 LcGS 基因的植物表达载体, 分别用 BamHI 和 Sal I 双酶切 pmd18 T LcGS 重组质粒和 pcambia2300 质粒, 将目的片段连接并转化到大肠杆菌中, 提取质粒, 该质粒经 BamHI 和 SalI 双酶切得到 2045bp 的目的片段 ( 图 5), 说明植物表达载体 pcambia2300 LcGS 构建成功 2.6 烟草的遗传转化及其阳性植株的分子检测采用电击法将 pcambia2300 LcGS 质粒转入到农杆菌 C58 感受态细胞中, 运用叶盘法进行烟草的遗传转化利用 CTAB 法提取烟草基因组, 以烟草基因组为模板,F/R2 为引物,PCR 扩增出目的条带, 可推断这些植株是转基因阳性植株 ( 图 6) 图 5 pcambia2300 LcGS 表达载体双酶切验证 Fig.5 Constructiontestoftheexpresionvector ofpcambia2300 LcGS 1:pCAMBIA2300;2:pCAMBIA2300 LcGS;3:LcGS 图 6 转化植株的 PCR 鉴定 Fig.6 PCRanalysisoftransgenictobaccoplants M:Marker I;WT:Widetype;1~6:Transgeniclines

6 84 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 转基因植株在重金属胁迫下的表达与分析谷胱甘肽和植物螯合肽共同作用组成了植物解毒重金属的一个重要的途径, 为研究过表达 GS 烟草对重金属胁迫的应答反应, 分别测定了 WT/L1/L2 经 100μmol/LCdCl 2 处理 10 天前后根部 GSH 含量 PC (PC2) 和叶绿素含量未经 Cd 处理前不同株系烟草根部 GSH 含量无显著性差异 Cd 处理后,WT 植株根部 GSH 含量明显低于未处理 WT 植株, 但是转基因株系 L1 和 L2 根部 GSH 含量却与未处理前无显著性差异 ( 图 7a) Cd 处理前, 未检测到 PC2, 处理后, 转基因株系根部 PC2 含量分别约是 WT 株系的 1.89 倍 (P<0.05) ( 图 7b) Cd 处理前, 受试植株总叶绿素含量无明显差异,Cd 处理后, 虽然转基因植株和野生型烟草总叶绿素含量皆下降, 但是转基因植株比野生型下降的程度低 ( 图 8),L1 和 L2 株系在整个实验过程中无明显差异图 7 Cd 处理前后过表达 GS 基因烟草株系 L1/L2 和野生型根部 GSH(a) 和 PC2 含量 (b) Fig.7 Tisueconcentrationsofglutathioneinwild typeandgs overexpresion(l1/l2)(a); tisueconcentrationsofpc2inwtandl1/l2(b) 3 讨论图 8 Cd 处理前后过表达 GS 基因烟草株系 L1/L2 和野生型总叶绿素含量 Fig.8 Totalchlorophylcontentofaltested linesaftercdtreatmentfor10days Valueshavingthe same leterare notsignificantly diferentat P<0.05,bytheLSD test.verticalbarsrepresenttheseofthe meanfortriplicatedeterminations 本研究从枸杞叶片中扩增获得 LcGS 基因, 与多数植物相比, 功能结构域差异较小, 说明 LcGS 蛋白质的主要功能域相对保守,LcGS 有两个富集域, 分别是甘氨酸富集域和丙氨酸富集域, 是 GS 实现催化功能所必须的活性位点 [22 23],GS 催化功能依赖于 ATP, 甘氨酸富集域是 ATP 的一部分结合位点 GS 功能分析表明活性位点动力学特征对催化和基质的识别具有重要的作用 [24] LcGS 存在于不同种属的生物中, 经多序列比对表明, 该基因编码的蛋白与其它植物氨基酸序列相似性很高, 与番茄葡萄甜橙同源性分别为 88% 76% 69%, 反应出 LcGS 在进化上编码区结构相对保守, 说明其基因功能的重要性在植物中, 谷胱甘肽维持细胞内的氧化还原平衡, 对外源物质和重金属有解毒作用, 并通过谷胱甘肽化调控酶的活性 [25 27] 许多研究表明, 在植物体内过量表达 GSH 合成酶基因, 能够提高植物对逆境的抗性

7 2014,34(10) 贾翠翠等 : 过表达谷胱甘肽合成酶基因增强烟草对镉的耐受性 85 [28] Stefens 等过量表达印度芥菜 (Indiamustard)GSH 合成酶基因, 发现其比野生型 GSH 的含量和植物螯合肽合成能力都有所提高, 植株对 Cd 的抗性也增强, 并能积累更多的 Cd GSH 能够提高植物对重金属的耐性主要是由于 GSH 具有的 SH 能与重金属离子结合形成硫肽复合物, 再通过转运蛋白的作用将这些复合物运输到细胞胞外, 或者储存在液泡等细胞器内, 从而降低重金属对细胞的毒性本研究检测了枸杞在不同时间 Cd 胁迫处理下谷胱甘肽合成酶基因的表达量变化, 结果表明 LcGS 基因在重金属胁迫下表达量上调, 胁迫 9h 表达量达到最大, 胁迫 12h 24h 后表达量维持在较高水平可以推断该基因对环境中重金属胁迫的适应性具有重要的作用因此, 通过过表达 LcGS 基因可能会提高植物对重金属的耐受性本研究证实了过表达 LcGS 烟草增强植株对 Cd 的耐受性在无 Cd 存在下, 野生型和转基因株系 L1/L2 根部 GSH 含量并没有明显的差异, 在所有的株系里并未检测到 PC2, 无 Cd 存在下,γ ECS 是 GSH 合成的限速酶,γ ECS 酶的活性受到谷胱甘肽的反馈调节, 并依赖于 Cys 的可利用量, 因此, 无 Cd 存在下, 受试植株 GSH 含量无显著差异, 这些结果与 Zhu [9] [29] 等和 Foyer 等研究结果一致在 Cd 存在下, 野生型烟草植株根部 GSH 含量比未处理前的下降约 2.83 倍, 但是过表达 GS 植株处理前后并没有明显的差异, 过表达 GS 植株根部 PC2 含量较野生植株提高了约 2 倍,Cd 存在下,GS 活性降低, 导致 GSH 含量降低, 但是过表达 GS, 提供了额外的 GS, 因此 GSH 含量没有下降, 一部分 GSH 用于合成 PC, 表明 GS 是 GSH 和 PCs [9] 生物合成的限速酶, 与 Zhu 等的研究结果一致根部高 PC 含量可能会减轻 Cd 对根部的毒害另外, 在 Cd 胁迫条件下, 转基因植株总叶绿素含量比野生型下降的程度低, 说明转基因植株在 Cd 胁迫下比野生型长势好, 即过表达 GS 烟草植株比野生型对 Cd 的耐受性更强本研究探讨了 Cd 胁迫处理下, 过表达 GS 对烟草 GSH 含量和 PC 含量的影响, 结果表明过表达 GS 的转基因烟草植株, 在受到重金属胁迫下,PCs 水平提高, 导致植株对重金属的积累, 从而减轻土壤和水体中的重金属含量, 进而达到植物修复的目的参考文献 [1]RennenbergH.Glutathionemetabolism andposiblebiological rolesinhigherplants.phytochemistry,1980,21: [2]FaheyRC,SundquistAR.Evolutionofglutathionemetabolism. AdvEnzymolRelatAreasMolBiol,1991,64:53. [3]HopkinsFG,Zeterstr m R,EijkmanC.Thedawnofvitamins andotheresentialnutritionalgrowthfactors.actapaediatrica, 2006,95: [4] 胡文琴, 王恬, 孟庆利. 抗氧化活性肽的研究进展. 中国油脂,2004,29: HuW Q,WangT,MengQL.Researchadvanceofantioxidative bioactivepeptides.chinaoilsandfats,2004,29: [5]DixonD P,SkipseyM,GrundyN M,etal.Stres induced protein S glutathionylation in Arabidopsis. PlantPhysiology, 2005,138: [6] 陈坤明, 宫海军, 王锁民. 植物谷胱甘肽代谢与环境胁迫. 西北植物学报,2004,24: ChenKM,GongHJ,WANGSM.Glutathionemetabolismand environmental streses in plants. Acta Botanica Boreali occidentaliasinica,2004,24: [7]HowdenR,AndersenCR,GoldsbroughPB,etal.Acadmium sensitive,glutathione deficientmutantofarabidopsisthaliana. PlantPhysiology,1995,107: [8]ZenkM H.Heavymetaldetoxificationinhigherplants areview. Gene,1996,179: [9]ZhuYL,Pilon SmitsEA,JouaninL,etal.Overexpresionof glutathionesynthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulationandtolerance.plantphysiology,1999,119: [10]CobbetC,GoldsbroughP.Phytochelatinsandmetalothioneins: rolesin heavymetaldetoxification and homeostasis. Annual ReviewofPlantBiology,2002,53: [11] RauserW E, Schupp R, Rennenberg H. Cysteine, γ glutamylcysteine, and glutathione levels in maize Seedlings distributionandtranslocationinnormalandcadmium exposed Plants.PlantPhysiology,1991,97: [12] GushimaH,YasudaS,SoedaE,etal.Completenucleotide sequenceofthee.coliglutathionesynthetasegsh I.Nucleic AcidsResearch,1984,12: [13] WatanabeK,YamanoY,MurataK,etal. Thenudeotide sequence of the gene for γ glutamylcysteine synthetase of Escherichiacoli.NucleicAcidsResearch,1986,14: [14] Mooz E D, MeisterA. Glutathione biosynthesis: I. γ Glutamylcysteine synthetase (Hog Liver) I. glutathione (tripeptide)synthetase(yeast).methodsinenzymology,1971, 17: [15] Ohtake Y, Yabuuchi S. Molecular cloning of the γ glutamylcysteinesynthetase gene ofsacharomycescerevisiae. Yeast,1991,7: [16]YanN,MeisterA.Aminoacidsequenceofratkidneygamma glutamylcysteine synthetase. JournalofBiologicalChemistry, 1990,265: [17]HuangC,HeW,MeisterA,etal.Aminoacidsequenceofrat kidney glutathione synthetase. Proceedings ofthe National

8 86 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No AcademyofSciences,1995,92: [18]UlmannP,GondetL,PotierS,etal.CloningofArabidopsis thaliana glutathione synthetase (GSH2) by functional complementationofayeastgsh2mutant.europeanjournalof Biochemistry,1996,236: [19]JiJ,WangG,WangJ,etal.Functionalanalysisofmultiple carotenogenicgenesfromlyciumbarbarumandgentianaluteal. fortheirefectsonβ caroteneproductionintransgenictobacco. BiotechnologyLeters,2009,31: [20]GrilE,WinnackerEL,ZenkM H.Phytochelatins,aclasof heavy metal binding peptides from plants, are functionaly analogous to metalothioneins. Proceedings ofthe National AcademyofSciences,1987,84: [21]WintermansJ,DeMotsA.Spectrophotometriccharacteristicsof chlorophylsa and b and their phenophytins in ethanol. BiochimicaetBiophysica Acta (BBA) Biophysicsincluding Photosynthesis,1965,109: [22] JezJM, Cahoon R E. Kinetic mechanism ofglutathione synthetase from Arabidopsis thaliana. JournalofBiological Chemistry,2004,279: [23]KatherineH,RebeccaE.Cahoon,etal.Reactionmechanismof glutathionesynthetase from Arabidopsisthaliana. Biophysical Journal,2007,282:17157? [24]GalantA,ArkusK A,ZubietaC,etal.Structuralbasisfor evolutionofproductdiversityinsoybeanglutathionebiosynthesis. ThePlantCelOnline,2009,21: [25]NoctorG,FoyerCH.Ascorbateandglutathione:keepingactive oxygenundercontrol.annualreviewofplantbiology,1998, 49: [26]MayMJ,VernouxT,LeaverC,etal.Glutathionehomeostasisin plants: implications for environmental sensing and plant development.journalofexperimentalbotany,1998,49: [27]RouhierN,LemaireSD,JacquotJP.Theroleofglutathionein photosyntheticorganisms:emergingfunctionsforglutaredoxins andglutathionylation.annurevplantbiol,2008,59: [28]StefensJC.Theheavymetal bindingpeptidesofplants.annual ReviewofPlantBiology,1990,41: [29] FoyerC H, SouriauN, PeretS, etal. Overexpresionof glutathionereductasebutnotglutathionesynthetase leadsto increasesinantioxidantcapacityandresistancetophotoinhibition inpoplartrees.plantphysiology,1995,109: Over expresionofglutathionesynthetasegeneenhancescadmium ToleranceinTransgenicTobaccoPlant JIACui cui 1 JIJing 1 WANGGang 1 TIANXiao wei 2,3 DUXi long 2 GUANChun feng 1 JINChao 1 WUDian yun 2 (1SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,TianjinUniversity,Tianjin ,China) (2SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin ,China) (3ColegeofHorticultureandLandscape,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin ,China) Abstract Soilpolution,asaresultofindustrialdevelopment,isbecomingaseriousproblem inchinaand raisingincreasingconcernsfromthepublic.soilremediationthroughplantgeneticengineeringisawidelyusedmethod totacklethisproblem.thetheoryistoprovideanewgeneticresourceforheavymetalphytoremediationthroughthe studyandmanipulationofheavymetalresponsiverate limitingenzymesinplants.thegenelcgs,codingglutathion synthetase(gs)oflyciumchinensewasclonedusingreversetranscriptionpolymerasechainreaction(rt PCR)and rapidamplificationofcdnaends(race).expresionoflcgsinl.chinenseundercdcl 2 stresovera24htime periodwasmonitoredandanalyzedusingsemi quantitativert PCR.TheexpresionofLcGSgeneup regulated initialyfolowingtheincreaseofcdstrestime,thenremainedatarelativelyhighlevelfrom9h,tiltheendofthe monitoringperiodat24h.theexpresionvectorcontainingthisgenewasalsoconstructedandnamedpcambia2300 LcGS.ThentheLcGSexpresioncasetewastransformedintotobaccoviaAgrobacterium mediatedtransformation. IntegrationofthisforeigngenewasconfirmedusingPCR.UnderCdCl 2 stres,transgenicplantscaryinglcgsgene containhighercontentsofglutathione(gsh),phytochelatins(pcs)andchlorophylthanwild typeplants,confirming highertolerancetocdcl 2.Therefore,over expresionofglutathionsynthetasegenesthroughgeneticengineeringcan beapromisingstrategyforheavymetalphytoremediation. Keywords Lyciumchinense Glutathionesynthetase CdCl 2 Stres PCs

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料

80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No n Gly,n=2~10 PCs 中 Gly 巯基占很大的百分比, 能够结合重金属离子形成稳定的化合物 谷胱甘肽和 PC 合成酶在重金属耐受性中的重要作用已经在拟南芥 Cd sensitive 突变体中得到

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