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1 第 38 卷第 11 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2016 年 11 月 Vol.38 No.11 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Nov DOI: /j.cnki.xdzk 转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株 1 的获得及其抗旱性分析 葛菲 1,2, 聂琼 2, 乔光 2, 张婷 2, 吴艳 2, 文晓鹏 2 1. 贵州大学生命科学学院, 贵阳 ; 2. 贵州大学农业生物工程研究院 / 山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室, 贵阳 摘要 : 根据前期克隆的火龙果过氧化氢酶基因 (HuCAT) 设计特异引物, 从克隆载体 PMD18T-HuCAT 中扩增出特异带, 将其连入植物表达载体 psh737, 构建了 CaMV35s 启动子驱动的表达载体 psh737-hucat; 采用农杆菌介导法转化烟草, 获得 37 个抗性植株, 经 GUS 组织化学染色及 PCR 扩增鉴定, 有 29 个株系为转基因植株 ; 经半定量 RT-PCR 及荧光定量 PCR 检测, 筛选出高表达株系 22 个 ; 以 PEG-6000 溶液模拟干旱胁迫条件, 测定转基因烟草的抗旱相关生理指标, 结果显示, 转基因烟草 CAT 活性 SOD 活性 POD 活性 PRO 含量和相对含水量均高于野生型烟草,MDA 含量低于野生型烟草, 表明转 HuCAT 基因可能提高了烟草的抗旱性. 关键词 : 火龙果 ;CAT 基因 ; 植物表达载体 ; 遗传转化 ; 烟草 ; 基因表达中图分类号 :Q291;Q786 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) [1-2] 逆境胁迫严重影响植物的分布 生长发育及品质的形成. 在逆境胁迫下, 植物积累了大量的活性氧 (ROS), 从而导致蛋白质 膜脂 DNA 及其他细胞组分的严重损伤. 过氧化氢酶 (CAT) 属血红素蛋白酶 类, 它的主要作用就是催化 H2O2 分解为 H2O 与 O2,CAT 基因的过量表达可有效清除植株体内的 ROS, [3-5] 提高其对氧化胁迫的抗性. 火龙果 (Hylocereusundulatus) 为仙人掌科三角柱属的果用栽培种, 原产于中美洲热带沙漠地区, 耐 [6-7] 热耐旱, 具有很高的利用价值. 前期工作中, 我们克隆了火龙果 CAT 基因 (HuCAT), 并在 mrna 水 [8] 平上分析了该基因与非生物胁迫的关系. 本研究拟构建 HuCAT 的植物表达载体, 并通过遗传转化模式 植物烟草, 以 PEG-6000 溶液模拟干旱胁迫处理, 对转基因烟草的生理指标进行分析, 以期进一步探讨 HuCAT 的高效超表达提高烟草植物抗逆性的潜在功能. 1 材料与方法 1.1 植物材料 烟草 (Nicotianatabactum Xanthin ) 种子由贵州大学农业生物工程研究院基因工程分室提供, 无菌苗 由种子萌发培养保存, 选取继代生长 2~3 周烟草无菌苗的幼嫩叶片为外植体. 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 贵州省留学人员科技活动项目 ( ). 作者简介 : 葛菲 (1989 ), 女, 安徽安庆人, 硕士研究生, 主要从事植物分子细胞生物学研究. 通信作者 : 文晓鹏, 教授.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.edu.cn 第 38 卷 1.2 菌株及试剂 大肠杆菌 DH5α 菌株购于天根生物科技有限公司 ; 农杆菌菌株 LBA4404 和植物表达载体 psh737 由 贵州大学农业生物工程研究院基因工程分室惠赠 ; 含有目的基因的克隆载体 PMD18T-HuCAT 由本实验 室保存 ;PowerUpSYBR Green MasterMix 试剂盒购于 AppiledBiosystems 公司 ; 高保真 PCR 酶 KOD- Plus-Neo 购于 TOYOBO 公司,LA TaqDNA 聚合酶 限制性内切酶 XbaⅠ EcoRⅠ 购于 Takara 公司, T4DNA 连接酶购于 Promega 公司. 1.3 植物表达载体的构建 根据 HuCAT(GeneBank:KF ) 完整开放阅读框序列结合 psh737 表达载体上的酶切位点, 利 用 Primier5.0 软件设计全长扩增引物, 并分别在上下游引物 5 和 3 端引入 EcoRⅠ XbaⅠ 酶切位点. 基 因扩增引物 : 上游引物 HuCAT-F:5 -GCTCTAGAATGGATCCTTACAAGCA-3, 下游引物 HuCAT-R: 5 -CGGAATTCTCACATGGTTGGCCTCA-3. 以含有 HuCAT 基因全长的质粒为模板进行 PCR 扩增. 由 于 KOD-Plus-Neo 高保真酶扩增产物为平滑末端, 为了与 T 克隆载体连接, 使用 LA TaqDNA 聚合酶对 扩增克隆目的片段 3 端进行加 A 反应. 通过 TA 克隆连接到 PGEM-Tvector 上, 转化大肠杆菌 DH5α 后 挑菌落提取质粒进行酶切鉴定及测序, 构成中间载体 PGEM-T-HuCAT. 利用 EcoRⅠ 和 XbaⅠ 酶分别双 酶切 PGEM-T-HuCAT 与 psh737 质粒, 酶切产物纯化后, 用 T4DNA 连接酶 4 过夜连接, 转化 DH5α 后鉴定阳性克隆送测序, 获得重组质粒 psh737-hucat. 1.4 重组子转化烟草及鉴定 [9] 通过冻融法将重组子导入农杆菌 LBA4404 感受态细胞中, 再利用叶盘法转化烟草, 经过卡那霉素 筛选的抗性芽长至 1~2cm 高时切下转入生根培养基中诱导生根. 利用 GUS 组织化学染色及 PCR 检测目 的基因的整合情况. 设计特异性引物 (cat6f:5 -AATAGATCCCAGGAACCACCA-3,cat6r:5 -ACCCA- GAGAGCCTCAACACC-3 ), 以提取的烟草 DNA 为模板对转基因植株进行 PCR 检测,PCR 检测体系 : 2 MasterMix5μL, 模板 DNA25ng, 正反向引物各 0.5μmol/L, 加入 ddh2o 至 10μL. 反应条件 : 94 预变性 3min;94 变性 30s,58 退火 30s,72 延伸 60s, 共 28 个循环 ;72 度延伸 5min. 经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物. 1.5 转基因植株中 HuCAT 基因的表达分析 采用半定量 RT-PCR 及荧光定量 PCR 检测目的基因的相对表达量. 以烟草 β-actin 作为内参基因, PCR 反应体系同 1.4. 反应条件 :94 预变性 3min;94 变性 30s,60 退火 30s,72 延伸 60s, 共 27 个循环 ;72 度延伸 5min. 引物序列如下 : 内参基因引物序列 : β-actin-f:5 -GCCATCAGCAACAAATACCA-3 β-actin-r:5 -GCCTCATCACCAACATAAGCA-3 目的基因引物序列 : cat6f:5 -AATAGATCCCAGGAACCACCA-3 cat6r:5 -ACCCAGAGAGCCTCAACACC-3 采用荧光定量 PCR 进一步分析转基因植株的表达特性.PCR 反应体系为 10μL:PowerUpSYBR Green MasterMix:5μL,ddH2O:4.1μL, 正反向引物各 0.25μmol/L,cDNA100ng. 反应条件 :94 预变性 3min;94 变性 10s,60 退火 20s,72 延伸 20s, 共 40 个循环 ; 熔解曲线测定为从 65 到 95. 采用 2 -ΔΔCt 法计算基因的相对表达量. 引物序列如下 : 内参基因引物序列 : β-actin-f:5 -GCCATCAGCAACAAATACCA-3 β-actin-r:5 -GCCTCATCACCAACATAAGCA-3 atpa-f:5 -ATAGAGGTGCAAGGCTGACA-3 atpa-r:5 -TTGTAGTAATTCTGGTTTGACAC-3

3 第 11 期葛菲, 等 : 转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析 3 目的基因引物序列 : Cat2f:5 -CCCACATCGTCGAAGAGCCA-3 Cat2r:5 -CCACGCATTCAAGCCAAACC 转基因烟草抗旱生理生化指标测定 选择生长一致的过表达转基因株系 T6 和野生型烟草, 在温室内盆栽 ( 基质 : 营养土 ) 培养至 6 片成熟 叶后, 分别加入 20%(w/v)PEG-6000 溶液模拟干旱胁迫处理.20d 后选取烟草植株中大小相近的叶片测定 各项生理生化指标. 每处理 3 株, 重复 3 次, 数据分析用 SPSS22.0 和 Excel 进行处理. [10] 组织相对含水量 (RWC) 测定 : 参照高俊凤的方法测定. 参照苏州科铭试剂盒说明书测定过氧化氢酶 (CAT) 超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (POD) 活 性, 以及脯氨酸 (PRO) 和丙二醛 (MDA) 含量. 2 结果与分析 2.1 HuCAT 的 T 载体克隆与测序验证 以 PMD18T-HuCAT 为模板, 利用高保真酶进行扩增, 电泳检测 HuCAT, 扩增产物大小为 1479bp ( 图 1). 测序结果表明, 该产物与 GeneBank 中该基因的序列一致. 回收目的片段连接到 PGEM-T 上并转化 大肠杆菌, 经测序表明, 序列无移码或突变. 2.2 植物表达载体的构建及鉴定 PGEM-T-HuCAT 和提取的 psh737 质粒载体分别使用 EcoRⅠ XbaⅠ 双酶 切, 电泳检测酶切产物. 结果表明 ( 图 2), PGEM-T-HuCAT 质粒酶切后, 得到大小 两个片段, 小片段的大小约为 1500bp 左 右, 条带与预期大小相符,pSH737 质粒经 双酶切后得到单一的大片段条带. 回收大 小片段后用 T4DNA 连接酶进行连接得到 表达载体 psh737-hucat, 酶切鉴定, 得 M:2000bpDNALadder;1-8: 引物扩增片段. 图 1 HuCAT 序列高保真 PCR 扩增的琼脂糖凝胶图 到约 1500bp 的 HuCAT 基因片段. 将鉴定结果为阳性的表达载体测序, 进一步确定序列无移码或突变发 生, 插入方向正确, 表明植物表达载体构建成功. 转化农杆菌同样扩增出约 1500bp 的条带, 表明表达载体 已导入根癌农杆菌. 图 2 PGEM-T-HuCAT psh737 与 psh737-hucat 质粒载体的双酶切 (A) 和重组子菌落 PCR(B) 2.3 转基因植株的鉴定对抗性植株进行 GUS 组织化学染色, 结果显示,37 个抗性克隆中有 29 株的叶片呈蓝色, 而野生型叶片未出现蓝色 ( 图 3A). 对 GUS 染色呈阳性的植株, 提取总 DNA 进行目的基因的 PCR 检测,GUS 检测呈阳性的 29 个克隆与阳性对照均扩增出目的条带, 而阴性对照野生型烟草未扩增出特异带 ( 图 3B), 说明

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.edu.cn 第 38 卷 GUS 和 PCR 检测结果一致. M:2000bpDNALadder;T1-T17:HuCAT;PC:pSH737-HuCAT 农杆菌质粒. 图 3 抗性植株的 GUS 组织化学染色 (A) 及 PCR 检测 (B) 2.4 转基因植株中 HuCAT 的表达分析采用半定量 RT-PCR 与荧光定量 PCR, 对 HuCAT 进行表达分析. 两种方法检测都表明, 与野生型比较, 在得到的 29 个转基因株系中有 22 个株系 HuCAT 的表达量显著提高, 其中 T6 T11 T13 等 13 个株系的表达量较高,T2 T3 T10 等 9 个株系次之 ;T1 T8 T12 等 7 个株系增强不显著, 其中 T7 T22 植株中不表达 ( 图 4). 因此, 通过农杆菌介导法获得了 22 个 HuCAT 高表达的转基因烟草植株. 图 干旱胁迫对转基因烟草生理生化指标的影响 同一小图中不同英文字母表示差异显著 (p<0.05). 转基因烟草株系外源 HuCAT 表达的半定量 RT-PCR(A) 及定量 (B) 分析 结果显示, 与野生型植株相比, 干旱处理前转 HuCAT 基因的各项理化指标无显著差异 (POD 活性除 外 ); 干旱处理后转 HuCAT 基因烟草的 CAT 活性 ( 图 5A) SOD 活性 ( 图 5B) POD 活性 ( 图 5C) PRO 含量 ( 图 5D) 和相对含水量 ( 图 5E) 均显著高于野生型, 而转基因植株 MDA 含量 ( 图 5F) 低于野生型. 表明 干旱胁迫下, 转 HuCAT 基因能显著提高植株的抗氧化能力及抗旱性. 3 讨论 我国的水资源时空分布极不均匀, 每年都会因为缺水造成国民经济的重大损失, 干旱是引起作物减产 最主要的非生物逆境. 因此从分子层面研究植物耐旱机理, 克隆耐旱相关基因并应用于转基因可成为改良 [11-12] 作物耐旱性的有效渠道. 转基因育种具有周期短 目的性强的特点, 能够准确地将目的基因整合到宿 [13] 主植物内, 大大扩宽了作物遗传改良可利用的基因来源. 根据 CAT 基因命名的分类方法 [14], 本文研究的 HuCAT 编码的酶属于 I 类过氧化氢酶, 主要在火龙 果成熟茎中表达, 可清除光呼吸产生的 H2O2. 经 HuCAT 氨基酸序列及理化性质预测,HuCAT 编码 492 个氨基酸, 分子量为 57.03KDa, 理论等电点为 7.03, 属稳定蛋白. 经 HuCAT 氨基酸同源性分析, 火龙果 catalase 与其他物种的 cdna 序列以及推测的氨基酸序列同源性高达 73~77% 和 75~80%.HuCAT 具有 保守的过氧化氢酶结构域和催化位点, 系统发育树分析显示其与枇杷树 (Eriobotryajaponica)CAT 基因 [8] 龙眼 (Dimocarpuslongan)CAT 基因 烟草 (Nicotianatabacum)CAT1 基因同源性很高.HuCAT 氨基 酸序列的 C 端有一个与过氧化物酶体靶向序列 1(PTS1) 相似的 TRL 序列 (Thr-ArḡLeu), 过氧化氢酶通

5 第 11 期葛菲, 等 : 转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析 5 A,B,C,D,E,F 代表 CAT 活性 SOD 活性 POD 活性 PRO 含量 相对含水量和 MDA 含量. 图 5 同一小图中不同英文字母表示差异显著 (p<0.05). 转 HuCAT 基因烟草的抗旱前后生理生化特征变化 常定位于过氧化物酶体中, 因此 HuCAT 合成的过氧化氢酶可能通过 PTS1 系统进入过氧化物酶体, 进而 [15] 维持体内 H2O2 的氧还平衡. 此外 HuCAT 的表达量在 H2O2 处理条件下显著上调,mRNA 表达量与酶 [8] 活性能够响应干旱 低温 高盐等逆境胁迫. 在干旱等逆境条件下,CAT 是清除 H2O2 的主要酶类, [16] CAT 基因上调以促进 H2O2 分解从而提高了植物的抗逆水平. 已有很多报道证实利用基因工程手段将 外源基因导入植物中, 获得的转基因植株中 CAT 基因的过量表达能不同程度地提高植物对干旱胁迫的抵 [17-19] 抗能力, 增强植物的耐旱性. 本研究所用的花椰菜花叶病毒启动子 (CAMV35S) 为组成型启动子, 被广泛应用于双子叶植物转基因 [20] 工程. 组成型启动子调控的基因表达不受外界环境条件的影响, 能在整合到双子叶植物基因组后启动外 [21] 源基因在大多数器官和不同发育时期高强度的表达, 且其在转基因的大部分组织中都有高效的表达. CAMV35S 启动子驱动的目的基因过量表达激活了许多其他胁迫基因的表达, 使得转基因植株比非转基因 [22] 植株有着更强的抗旱 抗冻 抗盐的能力. [8] 前期工作中,HuCAT 的功能得到了初步证实. 由于火龙果同源转化体系尚未成功建立, 为了分析 HuCAT 的抗旱功能, 本研究依据 HuCAT 的编码区和植物表达载体 psh737 上的酶切位点, 设计特异引 物成功扩增了完整的开放阅读框, 将基因的编码序列插入到 psh737 的 CAMV35S 启动子和 Nos 终止子之 间, 构建了植物表达载体. 将 HuCAT 在模式植物烟草中组成型过表达, 获得的转基因烟草将为进一步解 析 HuCAT 抗氧化性, 进而为全面揭示 HuCAT 的抗逆功能奠定基础, 同时也有望获得高抗旱的转基因烟 草新种质. 本研究中 T7 不表达,T8 表达量也很低 ( 图 4), 表现出转基因沉默. 前人研究表明目的基因随 T- DNA 随机整合到烟草基因组的不同位点, 会导致基因表达水平存在差异, 转基因植株中也可能会出

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.edu.cn 第 38 卷 [23-24] 现转基因沉默现象. 抗氧化酶活性的高低反映了植物对干旱适应能力的强弱. 抗氧化酶体系包括 CAT SOD POD 等, 它 [25] 们通过协同作用, 清除植物体内积累的活性氧, 共同抵御自由基对膜系统的伤害. 本研究发现表达 Hu- CAT 基因烟草 CAT POD 和 SOD 活性均高于野生型植株 ( 图 5A-C), 推测由于转入的 CAMV35S 启动子 增强了编码 POD 和 SOD 的基因表达, 从而导致 POD 和 SOD 活性得到提升. 这表明转 HuCAT 烟草幼苗 具备一定的抵御干旱逆境的能力. 作为细胞膜脂过氧化程度的重要的标志性物质,MDA 通常被作为判断膜 脂过氧化作用的主要指标, 与质膜透性变化呈正相关, 细胞中丙二醛质量分数的高低反映了细胞氧化损伤 [26-27] 的程度, 可用来评价植物的抗旱性. 本研究发现转 HuCAT 烟草 MDA 含量低于野生型植株 ( 图 5F), 可能是因为 CAT POD 和 SOD 等抗氧化酶活性的提高抑制了 MDA 的合成, 从而减轻细胞膜的损伤, 增 强抗逆性. 研究表明, 外源脯氨酸可以提高 CAT POD 和 SOD 酶的活性, 同时还可降低 MDA 的质量分 [28] 数. 干旱胁迫前, 转 HuCAT 基因与野生型烟草的脯氨酸含量基本相同, 而干旱胁迫后转基因烟草脯氨 酸增量明显大于野生型烟草 ( 图 5D).PRO 的大量积累是其主动进行渗透调节的一种反应, 也反映出其对 干旱环境的适应性变化, 提高了其抗逆适应性. 此外, 研究表明,RWC 值越大, 下降速率越小, 植物抗旱 性越强. 干旱胁迫下植物 RWC 是衡量植物水分状况和研究植物抗旱能力比较稳定的生理指标, 可直接反 [29-30] 映缺水时植物体内的水分损失情况. 本研究中野生型和转 HuCAT 烟草的叶片相对含水量在干旱胁 迫下均呈下降趋势, 但转 HuCAT 烟草的下降速率小于野生型烟草, 且转基因烟草叶片相对含水量显著高 于野生型烟草 ( 图 5E), 这说明转 HuCAT 烟草叶片具有较强的保水能力, 幼苗较野生型植株更抗旱. 参考文献 : [1] FARIDUDDIN Q,KHANAM S,HASANSA,etal.Efectof28-HomobrassinolideonDroughtStress-InducedChangesinPhotosynthesisandAntioxidantSystemofBrasicajuncea L. [J].ActaPhysiolPlant,2009,31(5): [2] 郭利娜, 张锐, 孙国清.cyFBPase 基因过表达提高转基因烟草的抗旱性 [J]. 生物技术通报,2013,(11): [3] BAJJIM,KINETJM,LUTTSS.TheUseoftheElectrolyteLeakageMethodforAssessingCelMembraneStabilityas awaterstresstolerancetestindurum Wheat[J].PlantGrowthRegulation,2002,36(1): [4] 时丽冉, 刘志华. 干旱胁迫对苣荬菜抗氧化酶和渗透调节物质的影响 [J]. 草地学报,2010,18(5): [5] 杜秀敏, 殷文璇, 赵彦修, 等. 植物中活性氧的产生及清除机制 [J]. 生物工程学报,2001,17(2): [6] 王彬, 蔡永强, 郑伟. 火龙果果实氨基酸含量及组成分析 [J]. 中国农学通报,2009,25(8): [7] TAOJ,QIAO G,WEN XP,etal.CharacterizationofGeneticRelationshipofDragonFruitAccessions(HȳLocereus spṗ )by MorphologicalTraitsandISSR Markers[J].ScientiaHorticulturae,2014(170): [8] NIE Q,GAOGL,FAN QJ,etal.IsolationandCharacterizationofaCatalaseGene HuCAT3 frompitaya(hylocereusundatus)anditsexpressionunderabioticstress[j].gene,2015,563(1): [9] 王学全, 沈晓, 何赟绵, 等. 根癌农杆菌 EHA105 和 LBA4404 冻融法转化条件的优化研究 [J]. 药物生物技术, 2011,18(5): [10] 高俊凤. 植物生理学实验指导 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2006: [11]ISOLA N R,ARUNDHATIA,LAKSHMIT V R,etal.Gene-ChipsinPlantGenetics[J].PlantTiss-UeCult,2003, 12(2): [12] 赵恢武, 刘晗, 于海源, 等. 耐旱植物厚叶旋蒴苣苔 BDN1 脱水素基因的克隆及表达特性分析 [J]. 科学通报,2000, 45(15): [13] 张欣, 付亚萍, 周君莉, 等. 水稻规模化转基因技术体系构建与应用 [J] 中国农业科学,2014,47(21): [14] WILLEKENSH,INZÉD,VAN MONTAGU M,etal.CatalasesinPlants[J].MolecularBreeding,1995,1(3): [15] 任伟, 徐博, 耿慧, 等. 朝鲜碱茅过氧化氢酶基因 (PuCAT) 的克隆及表达分析 [J]. 北方园艺,2014,(20): [16]SHIKANAIT,TAKEDA T,YAMAUCHIH,etal.InhibitionofAscorbatePeroxidaseUnderOxidativeStressinTobaccoHavingBacterialCatalaseinChioroplasts[J].FEBSLeters,1998,428(1): [17] 蔡永智, 祝建波, 郝晓云, 等. 转过氧化氢酶基因 KatG 棉花的抗旱性 [J]. 西北农业学报,2013,22(12): [18] 程星, 王燕雯, 包爱科, 等. 超表达 AVP1 基因提高转基因百脉根的耐盐性和抗旱性 [J]. 植物生理学通讯,2010, 46(8): [19] 王升平, 杨金广, 战徊旭, 等. 烟草过氧化氢酶基因 CAT1 的克隆及表达特征分析 [J]. 中国烟草学报,2014,20(5):

7 第 11 期葛菲, 等 : 转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析 7 GainoftheHuCAT GeneticTobaccoandAnalysison DroughtStressResistanceofTransgenicTobacco GE Fei 1,2, NIE Qiong 2, QIAO Guang 2, ZHANG Ting 2, WU Yan 2, WEN Xiao-peng 2 1. ColegeofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 2.KeyLaboratoryofPlantResourceConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion (MinistryofEducation)/ InstituteofAgro-Bioengineering,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China [20] 焦改丽, 孟钊红, 聂安全, 等. 花椰菜花叶病毒 (CAMV)35s 启动子在转基因棉花中的表达 [J]. 作物学报,2004, 30(11): [21]MARTÍNEZF,ARIFA,NEBAUERSG,etal.AFungalTranscriptionFactorGeneisExpre-SsedinPlantsfromIts OwnPromoterandImprovesDroughtTolerance[J].Planta,2015,242(1): [22] 朱丽萍, 于壮, 邹翠霞, 等. 植物逆境相关启动子及功能 [J]. 遗传,2010,32(3): [23]IYERL M,KUMPATLASP,CHANDRASEKHARAN M B,etal.TransgeneSilencinginMonocots[M].PlantMolecularBiology,2000(43): [24] 罗滨, 陈永康, 王莹. 植物外源基因拷贝数及插入位点的检测方法与技术 [J]. 河南师范大学学报 ( 自然科学版 ), 2012,40(6): [25] 杨牟, 何平, 段才绪, 等. 外源 SNP,Spd 对盐碱胁迫下射干幼苗体内抗氧化酶活性的影响 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ),2015,37(6): [26] 马文涛, 樊卫国. 贵州野生柑橘的抗旱性及其活性氧代谢对干旱胁迫的响应 [J]. 果树学报,2014,31(3): [27] 喻泽莉, 何平, 张春平, 等. 干旱胁迫对决明种子萌发及幼苗生理特性的影响 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ), 2012,34(2): [28] 苏贝贝, 刘佳, 李琳琳, 等. 外源脯氨酸对高温胁迫下半夏抗氧化酶活性及光合特性的影响 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ),2015,37(12): [29] 颜淑云. 紫穗槐幼苗对干旱胁迫的生理生化响应 [D]. 兰州 : 兰州大学,2010. [30] 王传明, 乙引. 外源 Ca 2+ 对喜钙植物 随遇植物和嫌钙植物 POD 活性和相对含水量的影响 [J]. 湖北农业科学, 2014,53(10): Abstract:Basedonourpreviouswork,HuCAT wasamplifiedfromcloningvectorpmd18t-hucat u- singspecificprimerpair.productsweretheninsertedintovectorpsh737toconstructsenseandanti-sense plantexpressionvectorspromotedbycamv35s.usingagr-obacteriumtumefaciens-mediatedco-transformationmethod,37cloneswereharvestedfromtheleafdiscsoftobacco ( Xanthin ),amongwhich,29 wereproventobetransgeneticlin-esaftergusgenehistochemicalstainingandpcrdetection.withsemiquantitativepcrandreal-timequantitativepcrdetection,22transgeneticlinesover-expressinghucat we-reobtained.somedroughtresistancephysiologyindicesfortransgenictobaccowereinvest-igatedunder simulateddroughtstressconditionsbyusing PEG-6000.Theresultsshow thattheenzymeactivityof CAT,SOD,POD,thecontentofPROandrelativecontentofwaterwerehigherthanwild-typeplants.On thecontrary,thecontentof MDA wasbelow it.the HuCAT transgenictobacco plantscouldresist droughtstress,whichprovidesupdatedinformationintheroleofhucat underaboticstress. Keywords:Pitaya;Catalase;expressionvectors;genetictransformation;tobacco;geneexpression 责任编辑欧宾

8 8 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.edu.cn 第 38 卷

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