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笑瞿
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1 第 20 卷第 4 期草地学报 2012 年 7 月 V.20 N.4 ACTA AGRESTA SNCA Ju 紫花苜蓿 MZP 基因超表达载体的构建及烟草转化李燕 1, 康俊梅 1, 张铁军 1, 杨青川 1, 房锋 2 (1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 ;2. 中国农业科学院植物保护研究所, 北京 ) 摘要 : 根据已经克隆得到的 MZP 基因 (GBk 序列号 :HQ911778), 合成编码区 DNA, 构建植物超表达载体 PB-MZP 将 MZP 基因插入到含有启动子 35S 和终止子的载体 PB121 中, 酶切鉴定表明, 目的基因已经正确的插入到载体中, 超表达载体构建成功采用 CC2 冻融法将其转入农杆菌中, 然后采用农杆菌介导的方法转化烟草 (Nbum), 共得到 12 株抗性烟草苗, 选取其中长势良好的 3 株进行分析结果表明 : 转基因烟草的 PCR,RT-PCR 和 Suh-b 检测均得到了与目的条带大小一致的片段, 说明已经成功获得了能够表达 MZP 基因的转基因烟草 ; 进一步对转基因烟草进行组织化学染色分析, 该基因在根茎叶中都可以表达本试验为 MZP 基因功能的研究提供了理论依据和试验材料关键词 : 紫花苜蓿 ;MZP 基因 ; 超表达载体构建 ; 烟草转化中图分类号 :Q943.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) CudTfmfSup-ExpgPmdf MZP Gfm Mdgv L. LY 1,KANGJu-m 1,ZHANG T-ju 1,YANG Qḡhu 1,ANGg 2 (1.ufAmS,ChAdmyfAguuS,Bjg100193,Ch; 2.ufPP,ChAdmyfAguuS,Bjg100193,Ch) Ab:AdghMZP gqu (GBkumb:HQ911778),DNAfgmw ddhpxpvpb-mzp wud.thpmd wfd Agbum LBA4404byCC2fz-hw mhdhfdbbyagbum mddfmym.twvkmypwbd.thvgukmy pwmpddgfgm.pcrdsuh-bdfpvdh hmbpmdhdbfdb.mzp gwufuyv-xpd gb.thhhmygfgbhwdmzpgxpg h,mdffdb.thhpvddhbdxpmmfhfuudyfmzp g. Kywd:Mdgv L.;MZP g;ov-xpdv;tbfm bzp 类转录因子, 是真核生物中分布最广最保 [1] 守的一类转录因子所有的 bzp 转录因子都具有 2 个保守的结构域第 1 个区域称为亮氨酸拉链结构域, 典型的特征是每 7 个氨基酸的第 7 位含有一个亮氨酸, 其他疏水残基位于第 3 和第 4 位亮氨酸拉链形成一个两亲性的 α 螺旋, 该结构为 bzp 蛋白与 [2] DNA 结合之前的二聚体化作用所需 DNA 结合所需的第 2 个区域是大约 20 个氨基酸的碱性结构域, 它紧靠亮氨酸拉链结构域的 N 末端, 能与专一的 DNA 序列相互作用 bzp 转录因子参与十分广泛的生物学反应玉米 (Zmy)gu2(g2) 编码的 bzp 蛋白 LGULELESS2 作用在玉米叶中叶舌和叶耳发育的狭窄区域, 在营养生长至生殖生长的过渡 [3] 阶段发挥作用 By 等从拟南芥 (Abdp h) 中分离出逆境诱导的 4 种 bzp 蛋白, 分别称做 AB,AB2/AREB,AB3 和 AB4/AREB2; 在干旱高盐或外源 ABA 的诱导下均能激活 bzp 转录因子, 并使之结合在 ABRE(ABA-pvm, 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 十二五国家科技支撑计划课题 (2011BAD17B ); 中央级公益性科研院所专项资金项目 (2011j-14) 资助作者简介 : 李燕 (1984-), 女, 蒙古族, 内蒙古乌兰察布人, 博士, 研究方向为牧草遗传育种,E-m:y@yh.m.;* 通信作者 Auhfpd,E-m:qhyg66@yh.m.

2 736 草地学报第 20 卷 ABA 应答元件 ) 上, 以此激活下游耐盐和耐旱等诸 [4] [5] 多抗性相关基因的表达 Km 等过量表达 bz- P 类转录因子的一个亚家族成员 AB2, 能增加植株对 ABA 的敏感性及对干旱的耐受能力, 且转基因植株提高了 ABA 调控基因的表达水平在水稻 (Oyzv) 中表达 bzp 基因可以显著提高水稻的抗逆性, 影响水稻的品质 [6-7] Rdguz-Ub [8] 等在刀豆 (Phuufu) 中克隆了一个根特异性表达的 bzp 类基因, 该基因受到缺水胁迫的影响综上所述,bZP 类转录因子在植物抗胁迫中发挥着重要作用紫花苜蓿 (Mdgv L.) 是优良的豆科牧草, 目前全世界种植面积达 3000 多万 hm 2, 我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一全国共有 14 个省区种植苜蓿, 主产区以华北西北为主 [9] 这些地区以盐碱地为主, 土壤盐渍化成为制约苜蓿产量的主要因素之一, 因此目前苜蓿产业的重要内容之一, 就是如何培育适应盐碱性环境的苜蓿, 即提高苜蓿的耐盐碱性紫花苜蓿中苜 1 号中编码 bz- P 转录因子的基因 MZP 为本实验室克隆, 为了研究该基因的功能, 本试验克隆了 MZP 基因的编码区, 构建了植物超表达载体, 并转化烟草 (Nbum) 这将为研究该基因的功能, 进而了解该基因在植物中的表达机制提供了试验依据同时, 研究从紫花苜蓿中分离出来的抗逆相关的 MZP 基因, 还可以为培育苜蓿抗逆新品种奠定理论和试验基础 1 材料与方法 1.1 试验材料紫花苜蓿中苜 1 号种子烟草野生型品种 N89 种子根癌农杆菌 LBA4404 植物表达载体 PB121 由本实验室保存大肠杆菌 DH5 感受态细胞和克隆载体 peasy-t 购自北京全式金生物技术有限公司 RNA 提取试剂 Tz 质粒小提试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒购自北京博迈德生物技术公司其他所需的酶和生化试剂均购自北京博雅宏兴生物技术公司 1.2 DNA 和 RNA 提取紫花苜蓿和转基因烟草的总 RNA 提取采用 Tz 法, 转基因烟草的基因组 DNA 采用本实验室改进的 CTAB 法提取 [10] 1.3 克隆载体 peasy-mzp 的构建根据已经获得的 MZP 基因序列, 设计一段含有酶切位点的引物 M:5 -TCTAGAATGGG- GACTAAGGAG-3 ;MR:5 -GGATCCTTCAAG- GTTAGCAAC-3 酶切位点用下划线表示, 分别为 XbⅠ 和 BmH Ⅰ 以紫花苜蓿中苜 1 号总 RNA 为模板, 合成 DNA, 以 DNA 为模板,M 和 MR 为引物, 合成全长 DNA 基因 ( 不含有终止子 ) PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳分析之后, 切胶回收, 连接到 peasy-t 克隆载体上, 转化大肠杆菌感受态 DH5α, 挑取阳性单菌落, 菌体 PCR 检测之后, 将含有目的条带的阳性克隆送到北京博迈德生物技术有限公司测序 1.4 超表达载体 PB-MZP 的构建用限制性内切酶 XbⅠ 和 BmHⅠ 同时酶切克隆载体 peasy-t 和空载体 PB121, 琼脂糖凝胶检测后各自回收目的片段用 T4DNA 连接酶在 16 连接 6h 连接产物转化到大肠杆菌感受态 DH5α 中, 挑取阳性单菌落, 菌体 PCR 检测后, 将含有目的片段的单菌落摇菌, 提取质粒 PB-MZP, 用限制性内切酶 XbⅠ 和 BmHⅠ 酶切鉴定 1.5 转基因烟草的获得采用 CC2 冻融法将构建好的超表达载体转入农杆菌 LBA4404 中, 用于烟草的转化采用叶盘法转化烟草 [11], 选取培养基中生长良好的无菌烟草叶片, 打孔器打成直径 7 mm 的叶圆片, 在 OD600 为 0.5 的农杆菌转化菌液中浸泡 10 m, 取出后摆放在共培养基中,28 黑暗培养 48h 之后转入筛选培养基中,25 培养直至叶盘周围分化愈伤组织, 并长出芽待芽长至 1m 时, 将芽切下, 转入生根培养基中继续培养, 直至长成完整的烟草苗待根长至 5m, 地上部分长至 10m 左右时, 移栽到营养土中在温室中继续培养 1.6 转基因烟草的 PCR 检测提取转基因烟草的基因组 DNA 作为 PCR 反应的模板, 质粒 PB-MZP 和未转基因烟草 DNA 分别作为阳性和阴性对照, 以基因全长引物 M 和 MR 进行 PCR 扩增 PCR 检测结果在 1% 琼脂糖凝胶上观察 1.7 转基因烟草的 RT-PCR 检测提取抗性苗的总 RNA, 反转录成 DNA 后, 以 M 和 MR 作为引物, 质粒 PB-MZP 和未转基因

3 第 4 期李燕等 : 紫花苜蓿 MZP 基因超表达载体的构建及烟草转化 737 烟草的 DNA 分别作为阳性和阴性对照, 进行 PCR 扩增扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳分析 1.8 转基因烟草的 Suh-b 检测对 PCR 初步鉴定为阳性的转基因烟草植株进行 Suh-b 检测提取转基因烟草的基因组 DNA, 以地高辛标记的 220bp 的 MZP 基因的中间片段为探针, 进行 Suh 检测质粒 peasy-mzp 和未转基因烟草 DNA 分别作为阳性和阴性对照 2.2 超表达载体的构建提取质粒 peasy-mzp 和 PB121, 用限制性内切酶 XbⅠ 和 BmHⅠ 双酶切, 回收目的片段后, 用 T4DNA 连接酶连接, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态挑取单菌落, 菌体 PCR 检测后, 挑取阳性单菌落, 提取质粒 PB-MZP, 用 XbⅠ 和 BmHⅠ 双酶切 1% 琼脂糖凝胶电泳得到一条约 1000bp 的条带 ( 图 2), 与预期大小相符, 表明植物超表达载体 PB-MZP 构建成功 1.9 转基因烟草的组织化学检测切取植物组织放入塑料管中, 加入染液至完全浸没样品, 抽真空 2m 后, 于 37 温育 8h 弃去染液, 用 0.1 M T-HC 清洗后, 在含有 1% 戊二醛的 0.1M T-HC 中 15 下固定 2h, 依次用 0. 1 M T-HC 50% 乙醇和 70% 乙醇清洗, 之后在无水乙醇中除去叶绿素在显微镜下观察染色情况, 叶和根直接在体式显微镜下观察, 茎做横切片后在显微镜下观察 2 结果与分析 2.1 MZP 基因的编码区 DNA 序列的克隆以紫花苜蓿中苜 1 号 DNA 为模板,M 和 MR 为引物进行 PCR 扩增,1% 琼脂糖电泳显示得到大约 1000bp 的片段 ( 图 1) 将该片段连接到克隆载体 peasy-t 并转化大肠杆菌, 菌体 PCR 之后测序序列比对结果显示没有碱基突变和移码突变, 说明成功克隆得到了该基因的编码区, 可以用作构建植物表达载体图 2 超表达载体酶切鉴定 g.2 dffvxpdv 注 :M:Mk;P: 双酶切后的质粒 PB-MZP N:M:Mk;P:pmddgdbyXbⅠ dbmhⅠ 2.3 烟草再生植株的转化经过农杆菌转化的烟草, 在诱芽培养基上生长 2 周后, 在叶盘周围即可见到再生芽, 当再生芽长到 1m 左右时, 将再生芽切下, 转入生根培养基中培养, 再生植株成苗后, 根长 10m, 地上部分 10m 左右时, 即可转入营养土中, 在温室中继续培养 ( 图 3) 图 1 MZP 基因编码区的克隆 g.1 CgfMZPdgg 注 :M:Mk;A: 基因编码区 N:M:Mk;A:dgg 2.4 转基因烟草的 PCR 检测经过抗生素的筛选, 获得了 12 株抗性苗, 选取其中的 3 株进行 PCR 检测提取抗性苗的基因组 DNA 作为模板, 质粒 PB-MZP 和未转基因烟草的基因组 DNA 分别作为阳性和阴性对照模板, 以 M 和 MR 为引物, 进行 PCR 扩增 1% 琼脂糖凝胶电泳结果显示, 这 3 株抗性烟草苗均可以扩增得到约 1000bp 的片段, 大小与编码区一致, 说明该基因不含有内含子, 这与之前的研究结果一致 ( 图 4) 说明 MZP 基因成功整合到烟草的基因组中, 初步确定这几株抗性苗为成功转化的转基因烟草

738 草地学第 20 卷报图 3 抗性植株 p g.3r 图 4 再生植株 PCR 检测 g f g p g.

5 转基因烟草的反转录 RT -PCR 检测将筛选出的 3 株转基因烟草苗提取总 RNA,反图 5 再生植株 RT -PCR 检测 g f g p g.

分别作为阳性和阴性对照模板,以 M 和糖凝胶上电泳分析结果显示这 3 株抗性烟草苗均可以扩增得到约 1000bp 的片段,与目的片段大小一致(图 5) 表明 MZP 基因在转基因

4 738 草地学第 20 卷报图 3 抗性植株 p g.3r 图 4 再生植株 PCR 检测 g f g p g.4 PCR 注:CK+ : 阳性对照; 阴性对照; 再生植株 PCR 鉴定 CK-: M: M k ; 1~3: N :CK+ :p v ;CK-:g v ; M:DNA M k ;1~3: g p 2. 5 转基因烟草的反转录 RT -PCR 检测将筛选出的 3 株转基因烟草苗提取总 RNA,反图 5 再生植株 RT -PCR 检测 g f g p g.5 RT-PCR 注:CK+ :阳性对照; CK-:阴性对照;M:M k ; 1~3:再生植株 RT-PCR 鉴定 N :CK+ :p v ;CK-:g v ; M:DNA M k ;1~3: g p 转录得到 DNA,质粒 PB -MZP 和未转基因烟草 2. 6 转基因烟草的 PCR 检测转基因植株的 Su h -b 检测结果如图 6 MR 为引物,进行 PCR 扩增 PCR 产物在 1% 琼脂照没有杂交信号说明目的基因成功转化到转基因的 DNA 分别作为阳性和阴性对照模板,以 M 和糖凝胶上电泳分析结果显示这 3 株抗性烟草苗均可以扩增得到约 1000bp 的片段,与目的片段大小一致(图 5) 表明 MZP 基因在转基因烟草中的 RNA 水平也可以正常表达所示阳性对照以及 1~3 号出现杂交信号,阴性对烟草的基因组中 2. 7 转基因烟草的组织化学检测采用 GUS 组织化学检测的方法,观察 MZP 图 6 Su h b 检测 h -b g g.6 Su 1~3:再生植株 Su h 检测;CK+ :阳性对照;CK-:阴性对照 1~3:Su h g f g p ;CK+ :P v ;CK-:Ng v 基因的组织表达情况分别取转基因烟草的根茎叶进行检测,转化 PB 121 质粒的烟草作为阳性对照,未转基因的烟草作为阴性对照结果表明,在根茎叶中该基因都可以表达(图 7)

5 第4期李燕等:紫花苜蓿 MZP 基因超表达载体的构建及烟草转化 739 图 7 转基因烟草组织化学检测 hm g f g p g.7 H y 注:从左到右依次为: R:根; S:茎; L:叶;从上到下依次为: CK+ :阳性对照; CK-:阴性对照; A:转 MZP 基因烟草 N :L f :R: ;S: m;l: f;tp b m:ck+ :p v ;CK-:g v ;A: g p gh 3 讨论试验证明, 外源基因转入植物中, 可以改变植物的性状, 特别是将 bz P 类转录因子转入植物中,可以提 )的一个转录高植物的抗逆性将辣椒( Cp um p. 因子 CAbZP1基因转入拟南芥中,可以提高拟南芥的将大豆( G mx)的 bz P 类转录因子 y 基因GmbZP4 4,GmbZP6 2 和GmbZP7 8在拟南芥中 [ 超表达,可以显著提高拟南芥的耐盐性 13] DREB2C [ 12] 抗病性基因与 AB2类型的 bz P 转录因子相结合,在拟南芥中可以响应 ABA 的诱导, 从而参与逆境调控[14] 采用农杆菌介导的方法将柽柳( T m x h )中一个新的 bz P 基因在烟草中超表达,可以显著提高烟草的耐盐性[15] 在水稻中超表达转录因子基因 O bzp7 2, 可以提高水稻的抗旱能力[16] bz P 类转录因子已经在多种植物中分离出来并进行了研究,但是在紫花苜蓿中克隆 M ZP 基因并对其进行功能分析尚属首例目前国内土壤盐碱化程度逐渐加剧,土壤盐渍化成为农业生产面临的重要生物逆境之一,是限制农业生产的主要因素因此培育耐盐的作物品种是盐碱地改良的有效途径苜蓿作为重要的豆科牧草,在畜牧业中占有重要的地位,将分子转基因技术应用到苜蓿育种工作中, 配合传统育种技术,对苜蓿现有品种的相关性状进行改良, 已经成为苜蓿育种工作的重要内容近年来, 苜蓿耐盐相关基因也已经大量的克隆,并逐步 [ ] 用于苜蓿品种选育中[17] W v等 18 从敏盐紫花苜蓿( 中筛选出耐盐细胞系( HG2) HG2 -N1),由该细胞系培养获得的愈伤组织和植株都具有较强的耐盐性白永琴等[19]从紫花苜蓿中克隆得到 LEA 基因家族的基因 MLEA3 1在烟草中表达可以显著提高烟草的耐盐 [ ] 性 W v等 20 将 A 基因导入苜蓿中,增强了 f 盐诱导的 MPRP2基因的表达,在植株的生长过程中其耐盐性得到了提高,并且生长速度加快 Muu k 等[21]从紫花苜蓿中分离出了 MAPK 路径第一个关键酶基因 SMK,序列分析结果表明,它与拟南芥中的 MAPK 基因具有极大的相似性,盐胁迫下其体内的表达水平上调刘小琳等[22]将编码中苜 1 号液泡膜 N+/H+ 逆向转运蛋白的基因 MNHX1 成功转化紫花苜蓿中苜1号, 以期获得耐盐性更好的苜蓿本试验将紫花苜蓿中分离的 MZP 基因构建 PB -M Z P 植物超表达载体,由于在目的基因上游加上了一个3 5S 强启动子,因此它可以调控该基因在转

6 740 草地学报第 20 卷基因植物中高效的表达在植物转基因工作中, 常采用模式植物烟草作为载体来研究基因的表达情况, 它 [23] 的高转化率为研究提供了保障 2010 年, 靳苗苗等将紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因 MCS 成功的转化烟草, 以此来分析该基因在植物抗铝毒害中的作用 [24] 2011 年, 乌艳红等成功的克隆了紫花苜蓿 GDP 解离酶抑制蛋白基因的 DNA 并将其转化烟草, 为研究该基因在植物耐盐耐铝毒害中的作用奠定基础本试验通过农杆菌介导的方法转化烟草, 成功获得了 12 株抗性苗, 对其中的 3 株进行了 PCR,RT-PCR,Suhb 和 GUS 组织化学检测, 结果证实 MZP 基因已经成功的整合到烟草基因组中并进行表达成功获得了超表达的转基因烟草植株, 为后期研究该基因在耐盐中的作用提供了材料, 也为今后将该基因在其他作物和牧草中表达, 并开展抗逆基因工程奠定了基础参考文献 [1] 杨颖, 高世庆, 唐益苗, 等. 植物 bzp 转录因子的研究进展 [J]. 麦类作物学报,2009,29(4): TdBhmyS,1991,16(1): [3] WhJ,dg M.Thgu2gfmzfu dughfmhvgvhpduv hpx[j].thpju,1999,19(4): [4] ByD,OhP.TmmbbZPpf ERggdhufddpp[J]. AxdRdxSg,2007,9(12): [5] KmS,KgJY,ChD,.AB2, ABRE-bdg bzpf,mpfguggd vxpf mup[j].th PJu,2004,40(1): [6] NjhwA,J M,TygA K,.Gmuvyd [2] LmbP,MKghSL.Dvydpfypgu:hbffhypdmz[J]. gxpyfhbuzpppffmy[j].pphygy,2008,146(2): [7] Zu M,GuY,R H,.AbZPpf, OAB5,vvdfyd[J]. PMuBgy,2008,66(6): [8] Rdguz-UbL,O C M A.A -pfbzp pfpv wdf [9] 苏加楷. 中国牧草新品种选育的回顾和展望 [J]. 草原与草坪, 2001(4):3-9 pyb (Phuufu)[J].JufExpmBy,2006,57(6): [10] 李燕. 紫花苜蓿 MZN 锌指蛋白基因启动子 MZPP 的克隆与序列分析 [D]. 呼和浩特 : 内蒙古农业大学,2009:17 [11]HhRB,yJ,HfmN,.Lfdfm [M]//GvSB,ShpRA,d.Pmu bgymu.kuw,ddh,1988:1-9 [12]LSC,ChH W,HwgS,.ufh pppphg-dudbzppf,cabzp1, hdphgfdvm [J].P,2006,224(5): [13]LY,ZuH,WW,.SybGmbZP44,GmbZ- P62dGmbZP78gfugvguf ABAggdfdfzggAbdp[J].P,2008,228(1): [14]LSJ,KgJY,Pk HJ,.DREB2Cwh AB2,bZPpgugbd-pvg xp,dvxpfbdvy[j].pphygy,2010,153(2): [15] WgYC,GC Q,LgY N,.AvbZP g fmtmxhpd mdphygp bp[j].jufpphygy,2010, 167(1): [16]LuGJ,GCX,ZhgX N,.dffObZ- P72pvgufABApddugh[J].P,2009,229(2): [17] 杨青川, 孙彦, 康俊梅. 紫花苜蓿耐盐相关基因克隆研究进展 [J]. 草地学报,2005,13(3): [18] Wv,BD R.Spp:Nw pphhughuuudggu[j].aphygpum,1997,19(4): [19]BYQ,YgQC,KgJM,.dfu hzfmdgvl.g,mlea3-1[j]. MuBgyRp,2012,39(6): [20] Wv,B D R.Tgvxpfh pfafhxpfhdgumprp2gffdmpvyf hp[j].pphygy,1999,120(2): [21]MukT,Lgk W,Mk.Dmg pkphwyvvdgg md dvhypm [J].PJu,1999,20 (4): [22] 刘小琳, 康俊梅, 孙彦, 等.MNHX1 基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定 [J]. 草地学报,2008,16(2): [23] 靳苗苗, 杨青川, 金洪, 等. 紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化 [J]. 草地学报,2010,18(4): [24] 乌艳红, 米福贵, 李志明, 等. 紫花苜蓿 GDP 解离抑制蛋白基因 DNA 的克隆分析及烟草转化 [J]. 草地学报,2011,19 (1): ( 责任编辑刘云霞 )

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料